以药测证对肾虚和肾阳虚大鼠基因表达谱的比较研究

目的在分子水平揭示肾虚和肾阳虚内涵的异同。方法肾虚证采用自然衰老大鼠模型,肾阳虚证采用皮质酮大鼠模型,均用淫羊藿总黄酮（epimedium flavonids,EF）以药测证,分别取下丘脑、垂体、肾上腺、淋巴细胞（HPAT）组织,采用Affymetrix公司的大鼠全基因组芯片,各两次重复基因表达谱研究。结果老年大鼠和皮质酮大鼠与青年大鼠比较,在HPAT轴上首先是众多的神经递质显著下调,接下来是生长激素类和性激素类都显著下调,其表达下调的模式呈高度一致,EF能逆转上述基因的表达;但EF在皮质酮大鼠显著上调热休克蛋白（HSP）和细胞色素P450以及促甲状腺激素（TSH）大幅度上调。结论两组大鼠均具有肾虚的内涵,但肾阳的主要物质基础是甲状腺激素促进能量代谢的氧化磷酸化过程。     

从整体论到系统生物学进行肾虚和衰老的研究

中医学对世界医学的贡献之一就是整体观,我们从整体观出发研究了肾阳虚证与下丘脑－垂体－靶腺轴功能紊乱的联系;采用基因芯片技术研究老年大鼠（肾虚证）及中药干预后下丘脑－垂体－肾上腺－胸腺（HPAT）轴的分子网络调控规律;通过基因芯片也揭示存在于老年大鼠下丘脑、垂体、肾上腺、淋巴细胞、骨骼、肝脏、肾脏等与“肾”相关组织的神经－内分泌－免疫以及神经－内分泌－骨代谢两大基因网络路线,从而推进“证”的整体性研究。近年按照系统生物学的动态、干预、多层面整合的要求,在全基因组转录水平、代谢组和单个衰老相关信号通路3个不同层面揭示衰老在不同层面的共同规律;揭示出基因的时空关联随着衰老进程逐渐弱化;并且中药淫羊藿总黄酮能有效改善衰老在上述两方面的系统改变。因此从整体观到系统生物学的转变可能促进中医学进入现代生命科学领域。     

肝气郁结证动物模型的建立及HPA轴相关激素的初步研究

[目的]建立并验证“肝气郁结证”大鼠模型,在此基础上研究“肝气郁结证”下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴相关激素的改变.[方法]20只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组.采用慢性应激+孤养方法制备“肝气郁结证”大鼠模型,通过行为学观察、蔗糖水偏嗜实验、开野实验评价模型.运用酶联免疫吸附试验( ELISA)技术对两组大鼠血清进行HPA轴相关激素分析.[结果]肝气郁结模型大鼠表现为躲避、活动减少、大便松散、皮色失去光泽,造模第2周开始生长较对照组缓慢,摄食量减少(P＜0.05);28 d造模后,水平得分、垂直得分较正常组均明显降低(P＜0.01,P＜0.05),血清皮质酮(CORT)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的含量明显升高(P＜0.01).[结论]从病因学、行为学和症状表现上成功构建了肝郁证大鼠模型,并进一步证实模型大鼠呈HPA轴亢进状态,有助于阐释肝郁证病理改变的本质.     

补肾方药对老年大鼠下丘脑-垂体-肾上腙皮质所属组织结构形态变化的影响

目的：观察左归丸、右归丸对老年大鼠HPA轴所属组织形态结构变化的影响。方法：以自然衰老大鼠为肾虚证动物模型，HE染色，光镜观察HPA轴所属组织结构的增龄性变化，以及补肾方药（左、右归丸）的改善作用。结果：老年大鼠垂体、下丘脑、肾上腺皮质组织形态结构呈现明显的老年性退化，左归丸、右归丸能不同程度改善这些组织结构。结论：左归丸、右归丸能从组织结构形态方面延缓下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴的老年性变化。     

地黄饮子对帕金森病肾虚证模型大鼠的干预作用及机制研究

目的通过检测大鼠形态学、HPA轴及抗氧化能力,探讨地黄饮子对帕金森病肾虚证模型大鼠的干预机制。方法将36只Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组、干预组。模型组、干预组大鼠给予15 mg·kg~(-1)·d~(-1)氢化可的松溶液连续灌胃6周,模拟中医肾虚证模型。从造模第15天开始模型组、干预组大鼠颈背部皮下注射1.0 mg/kg的鱼藤酮溶液,连续注射4周,每周间隔一天,制备病证结合模型,同时干预组给予0.86 mL·100 g~(-1)·d~(-1)的地黄饮子水煎液灌胃4周。用ELISA、HE染色等方法,观察各组大鼠HPA轴变化、MAO、Lipo含量及黑质区形态学变化。结果与正常组相比,模型组大鼠HPA轴功能亢进(P0.01),MAO、Lipo浓度升高(P0.01),黑质区多巴胺能神经元数目明显减少,胶质细胞增多,神经纤维结构疏松;与模型组相比,干预组大鼠HPA轴功能减退、MAO、Lipo含量降低(P0.01),黑质区多巴胺能神经元数目明显增多,胶质细胞减少。结论地黄饮子通过调控HPA轴功能,降低脑组织中MAO、Lipo含量,提高脑组织抗氧化能力,减缓DA神经递质降解速率,抑制黑质区多巴胺能神经元的损伤等对帕金森病肾虚证模型大鼠产生疗效作用。     

以药测证对肾虚证基因网络和信号转导的研究

总结了从细胞内的小的信号转导通路组成的网络到中等的下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺（HPAT）轴网络和涵盖全身,联络多个重要系统的大的神经内分泌免疫（NEI）网络,提出人体受到外界干预而形成的“病”或“证”,亦都是以众多的分子网络变化为基础。描绘了信号转导通路的方式、能力、研究信号转导通路变化的方法,提出“以药测证”是按系统生物学方法研究证的干预手段。作者采用补肾复方以药测证发现肾阳虚证涵盖着NEI调节网络,而且直接作用于NEI网络的调控中枢-下丘脑。采用从补肾复方中提取的有效组分——淫羊藿总黄酮（EF）,发现它通过NEI网络的下行通路激活免疫系统,能激活生长激素轴、性腺轴、淋巴细胞凋亡3个方面的网络机制发挥分子网络效应;也观察到EF调控基因网络表现出多种多样的方式,在淋巴细胞凋亡和增殖的网络机制中重塑对立的凋亡相关基因及增殖相关基因平衡;能会聚与整合共刺激分子、转化生长因子及多个原癌基因,成为启动促增殖、抗凋亡的上游因子网络;使NIK／IKK／IκB／Rel／NFκB信号转导通路中对立的IκBα与NFκB同时升高,既维持NFκB适度升高,又保证NFκB呈强者态势发挥其分子调控网络中的枢纽作用,并由此观察到肾虚证HPAT轴上有序的基因网络调控路线图谱。     

右归饮,四君子汤,桃红四物汤调节肾虚,脾虚,血瘀证患？…

目的：探讨右归饮、四君子汤、桃红四物汤对肾虚、脾虚、血瘀证患者免疫调节的不同作用。方法：用用右归饮、四君子汤、桃红四物汤分别治疗肾虚、脾虚、血瘀证患者各４０例,另分别设备证型２０例子安慰剂作对照,观察治疗前后免疫功能情况。结果：四君子汤使脾虚患者,右归饮使肾虚患者的循环免疫复合物（ＣＩＣ）水平下降,淋巴细胞转化主（淋转率）和自然杀伤（ＮＫ）细胞活性提高,四君子汤还使脾虚２的ＩＬ－２水平和嗜中性细胞     

一个糖尿病家系中肾虚证的分布特征及其基因表达谱研究

目的：分析肾虚证在一个糖尿病家系中的分布特征及其差异基因表达谱。方法：对一个2型糖尿病（T2DM）家系的12个成员进行辨证分析和理化检测,选择不同代的典型糖尿病肾虚证3例分别与家系中的正常人1例作基因芯片杂交测试;采用SAM基因芯片数据分析软件筛选差异表达基因作进一步的基因功能分析。结果：肾虚证患者占总家系中追踪到成员的66.7%;通过SAM软件筛选到81个显著表达基因,基因功能注释结果提示免疫反应、糖代谢和氨基酸代谢类基因显著表达。结论：肾虚证在此T2DM家系中呈聚集分布;糖尿病肾虚证与免疫反应及代谢功能类基因的异常表达密切相关。     

逆灸命门穴对大鼠力竭游泳时间及血清Cort、下丘脑GnRH、垂体GnRH和血睾酮的影响

目的：观察逆灸命门穴对大鼠力竭游泳时间、血清皮质醇（Cort）,下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）、垂体GnRH及血睾酮的影响,并探讨其作用机制.方法：采用3.5月龄SD雄性大鼠28只,将大鼠按游泳能力随机分为空白对照组、逆灸命门组、力竭对照组、逆灸命门＋力竭组,每组7只,分别干预20天后,力竭对照组、逆灸命门＋力竭组进行力竭游泳,观察力竭时间的差别,并采用生化法检测血清Cort,下丘脑GnRH、垂体GnRH及血睾酮含量.结果：逆灸命门＋力竭组力竭游泳时间较力竭对照组明显延长（P＜0.05）.与空白对照组相比,逆灸命门穴组大鼠的血清Cort,下丘脑GnRH、垂体GnRH及血睾酮含量无明显变化（P＞0.05）,力竭对照组大鼠的血清Cort,下丘脑GnRH、垂体GnRH及血睾酮含量显著升高（P＜0.01）.与力竭对照组比较,逆灸命门＋力竭组大鼠的血清Cort,下丘脑GnRH、垂体GnRH及血睾酮含量明显降低（P＜0.01）.结论：力竭游泳后HPG轴异常活跃,血清Cort异常升高.逆灸命门穴可缓和HPA轴过度应激、预防HPG轴的过度负反馈,并减少过度应激时HPA轴对HPG轴产生的不利影响,使机体睾酮含量和血清Cort维持在相对稳定的水平,这可能是逆灸命门穴能延长大鼠游泳力竭时间、提高其运动耐力的机制之一.     

基于基因表达谱数据建立肾虚证量化数学模型

目的 利用基因表达谱数据,建立量化肾虚证程度的数学模型。方法 采用4、10、18、24月龄SD大鼠,以24月龄大鼠加淫羊藿总黄酮（EF）干预,摘取大鼠下丘脑、垂体、肾上腺、淋巴细胞、骨、肝、肾、脾,利用基因芯片技术,检测全基因组mRNA表达,用不同月龄大鼠的基因表达谱数据建立神经网络模型,然后用此模型评价EF干预肾虚证的效果。结果 7个组织共筛选到199个基因表达具年龄依赖特征,其中相当一部分为神经内分泌免疫相关基因。模型预判发现EF作用后,24月龄老龄大鼠下丘脑 、垂体、肾上腺、肝、肾、骨、脾的基因表达与8～13月龄大鼠相似,分别为12．64、10．87、8．10、12．70、11．93、13．14、10．13月龄。结论 基于基因表达谱数据能建立量化肾虚证程度的模型,并能预测补肾药的效果,研究也表明EF能使老年状态基因表达向年轻化靠近,提示其具有改善肾虚、延缓衰老的作用.     

多囊卵巢综合征不同中医证型与内分泌代谢的相关性探索

目的 探讨多囊卵巢综合征（PCOS）的不同中医证型与内分泌代谢的相关性。方法 收集223例PCOS患者,其中脾虚组109例、肝虚组56例、肾虚组58例;同龄健康女性20名为对照组。测量体重指数（BMI）、腰臀比（WHR）;检测血清黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雄激素（T）、泌乳素（PRL）、雌二醇（E2）、性激素结合球蛋白（SHBG）、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、血脂（TC、TG、LDL C、HDL C）、瘦素（leptin,Lp）,比较各项指标的组间差异。结果 PCOS 3组的Lp、FINS、HOMA IRI、T、LH/FSH比值均显著高于对照组,SHBG均低于对照组（P<005,P<001）。Lp在PCOS 3组间比较差异无统计学意义;脾虚组FINS、HOMA IRI高于肾虚组及肝虚组（P<005, P<001）;肾虚组T、LH/FSH比值高于脾虚组及肝虚组（P<005）;肝虚组PRL高于脾虚组与肾虚组（P<001）。结论 血清Lp、SHBG异常为PCOS不同证型共同的病理表现;而不同证型有其各自的内分泌代谢变化的特点。     

右归配方颗粒对肾阳虚型体外受精－胚胎移植患者卵巢颗粒细胞基因表达谱的影响

目的从基因组学角度探讨温肾阳中药对肾阳虚型体外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer,IVF-ET）患者卵巢颗粒细胞基因表达谱的影响。方法 72例行IVF治疗的肾阳虚患者按照随机数字表法分为治疗组（36例）和对照组（36例）,治疗组服用右归配方颗粒联合促性腺激素（gonadotropin,Gn）,对照组服用安慰剂联合Gn,两组均在IVF治疗前连续用药3个周期。两组采用超排卵长方案治疗后,行穿刺取卵术。利用基因高通量测序技术对两组患者卵巢颗粒细胞基因表达谱进行分析,研究两组患者基因表达谱的差异,并对差异基因行基因本体（gene ontology,GO）分析和京东基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路分析。结果通过对两组患者卵巢颗粒细胞基因表达谱的分析,共筛选到391个差异表达基因,其中上调基因238个,下调基因153个。差异表达基因参与的富集的分子功能是：与细胞增殖、凋亡有关的细胞周期调节蛋白,蛋白质泛素化,微管、微丝等细胞骨架的构建,线粒体及能量相关功能的因子,激素合成调节因子等;参与的通路是能量代谢通路和转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）信号通路。结论两组患者卵巢颗粒细胞基因表达谱存在明显差异,差异表达基因所涉及的生物学过程与肾阳虚导致的生殖细胞增殖、凋亡紊乱,线粒体产生能量过程受阻等有相关性。     

荷瘤小鼠常见证候在神经-内分泌-免疫网络组织基因转录的特征

目的:揭示邪毒壅盛证、气虚证、阳气虚证、气阴阳虚证等4个同病异证荷瘤小鼠在神经-内分泌-免疫网络组织差异转录基因的总体特征。方法:对2006和2009年2批实验所检测以上4个证候及正常对照小鼠下丘脑、垂体、肾上腺、睾丸、胸腺、脾脏等60张芯片,近100万个核心基因进行分析,观察其一致性上调或下调的基因数与量的特征。结果:肿瘤发生后脾脏、胸腺、睾丸等组织基因一致性差异表达的数量大,其次是垂体和肾上腺,与疾病的关系密切;早期气虚证荷瘤小鼠突出表现为下丘脑基因表达趋于活跃;而同期的邪毒壅盛证荷瘤小鼠则突出表现为肾上腺基因表达趋于抑制,这可能与该证候荷瘤小鼠预后差有关。结论:荷瘤小鼠同病异证在神经-内分泌-免疫网络组织转录组方面有其特征性的物质基础。     

代谢综合征痰证病性兼杂及理化指标与PPARγ基因的相关性研究

目的通过分析代谢综合征(MS)痰证兼杂及理化指标与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因的相关性,探讨其可能的生物学基础。方法收集MS患者,运用证素辨证法从中筛选MS痰证单纯兼杂患者,即MS痰兼湿证组、痰兼热证组、痰兼阴虚证组,各30例,并以30名健康人作为健康组。理化检测指标包括:BMI、SBP、DBP、TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、ALT/AST、GGT、BUN、SCr、UA以及FPG,实时荧光定量PCR法(q-PCR)及酶联免疫吸附法(ELISA)检测PPARγmRNA及蛋白表达。结果MS痰证兼杂病性证素频次由高至低依次为:湿、阴虚、热、气滞、气虚、阳虚、血瘀、血虚;MS痰证病位证素频次由高至低依次为:肝、肺、肾、脾、心、胆、胃;与健康组比较,痰兼湿、痰兼热、痰兼阴虚组BMI、SBP、DBP、FPG均显著升高(P<0.01,P<0.05),痰兼湿、痰兼阴虚组FPG显著升高(P<0.01,P<0.05);痰兼阴虚组FPG高于痰兼热证组、痰兼湿证组(P<0.01);痰兼热证组SCr高于健康组、痰兼阴虚组、痰兼湿证组(P<0.01)。痰兼热证组、痰兼阴虚组BUN高于痰兼湿证组(P<0.05)。与健康组比较,痰兼阴虚组、痰兼热证组、痰兼湿证组PPARγmRNA表达量均升高,而蛋白表达降低(P<0.01,P<0.05);痰兼阴虚组及痰兼湿证组PPARγ蛋白表达高于痰兼热证组(P<0.01);痰兼湿证组PPARγmRNA表达与AST/ALT呈正相关(P<0.05);痰兼热证组PPARγ蛋白表达与GGT呈负相关(P<0.05);痰兼阴虚组PPARγ蛋白表达与SCr呈正相关(P<0.05)。结论MS痰证病性证素前三位为湿、阴虚、热;病位证素前三位是肝、肺、肾;MS患者机体PPARγ基因表达的下调可能是其痰证兼杂的生物学基础,PPARγ基因与MS痰证兼杂热证有一定联系。     

右归饮对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴钙调素mRNA表达的影响

目的：从分子水平探讨肾阳虚证的本质以及补肾中药的作用机理。方法：用醋酸可的松造成肾阳虚模型,以逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）半定量法,测定肾阳虚大鼠下丘脑－垂体－肾上腺轴CaMmRNA的表达,以及补肾中药右归饮对其的影响。结果：肾阳虚大鼠下丘脑、肾上腺CaMmRNA水平升高,垂体组织CaMmRNA水平没有显著变化,右归饮能够降低下丘脑组织CaMmRNA水平,但对肾上腺影响不显著。结论：下丘脑中CaMmRNA水平升高与肾阳虚证有关,下丘脑CaMmRNA水平的降低是补肾中药右归饮改善肾阳虚症状的作用机理之一。     

基因表达谱揭示淫羊藿总黄酮对皮质酮大鼠肾上腺皮质再生的调控机制

目的观察淫羊藿总黄酮（epimedium flavonoids,EF）对皮质酮大鼠肾上腺皮质再生的调控作用.方法采用碘化丙啶染色流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡率;用末端转移酶介导的X-dUTP缺口末端标记（TUNEL）法原位显示凋亡细胞;用基因芯片技术检测mRNA表达.结果模型组与正常对照组比较,肾上腺细胞G0/G1期阻滞,凋亡率明显升高（P＜0.05）;EF干预后G0/G1期比例下降,G2/M期比例显著上升（P＜0.01）,凋亡率下降（P＜0.05）.TUNEL法原位细胞凋亡检测显示正常对照组、模型组、治疗组凋亡阳性细胞数分别为（4.67±1.53）、（70.67±9.29）、（18.67±7.64）个（n=3）.皮质酮主要抑制肾上腺的基因表达,其中7个促进细胞周期的基因如V-ras、V-jun均下调.EF治疗后,肾上腺基因表达以上调为主,其中有6个促进细胞周期基因、1个抗凋亡基因,与肾上腺皮质细胞再生密切相关的上游分子IGF-Ⅱ及其受体IGFR,FGF7及其受体FGFR基因,7个参与类固醇生物合成的基因均上调.结论EF通过促进肾上腺皮质细胞增殖、抑制其细胞凋亡、促进类固醇生物合成,从而促进肾上腺皮质再生是EF在激素撤除过程中发挥保护肾上腺皮质功能的机制.