受体－A蛋白融合蛋白制备抗P物质受体血清及其特性

受体－Ａ蛋白融合蛋白制备抗Ｐ物质受体血清及其特性ＷａｌｔｅｒＫ．Ｋ．Ｈｏ（何国强）；ＡｌｅｘｉｓＰ．Ｋ．Ｃｈｅ，郑德枢（香港中文大学；香港生物化学系，香港沙田；广州医学院神经科学研究所，广州５１０１８２）本文报告了用直肠杆菌表达Ｐ物质受体－Ａ蛋白融合...     

P物质及其受体的研究进展

神经肽P物质(SP)是速激肽家族的重要成员,通过与其受体相结合发挥生物学作用.P物质和其偏嗜性受体神经激肽受体-1(NK1R)广泛分布在中枢和外周神经系统及周围组织,SP通过与G蛋白耦联的受体相互作用调控多种功能.目前在mRNA水平和蛋白水平所发现的人NK1R只有两种:由5个外显子组成全长型受体(NKIR-FL)和C-...     

抗G－CSF单克隆抗体的制备及其特性鉴定

抗Ｇ－ＣＳＦ单克隆抗体的制备及其特性鉴定上海第二医科大学附属瑞金医院，上海血液学研究所细胞生物学研究室（上海２０００２５）吴文，姜国胜，周荣富，邬维礼，曹伟丽，孙关林粒系集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）是一种能在祖细胞和成熟细胞不同水平上促进中性粒细胞生成...     

P53融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的 为研制出能特异与Ｐ＾５３结合的单克隆抗体,使对Ｐ＾５３的检测得到更为广泛的应用。方法 用ＰＣＲ技术扩增编码人Ｐ＾５３Ｎ－端１８０个氨基酸的ＤＮＡ片段并将其克隆在谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）表达质粒Ｐ＾ＧＥＸ－２Ｔ中。用该重组质粒转化大肠杆菌ＪＭ１０９,并经异丙基β－Ｄ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导产生Ｐ＾５３－ＧＳＴ融合蛋白。用Ｐ＾５３－ＧＳＴ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。常规细胞融合,间接酶联免疫吸附试     

系统性红斑狼疮患者血清抗核糖体P蛋白抗体的检测及其临床意义

目的: 观察抗核糖体P蛋白抗体(抗P蛋白抗体)在系统性红斑狼疮 (SLE)患者中的阳性率及其意义。方法:以含有核糖体磷酸蛋白P0、P1、P2全序列的合成蛋白作为抗原, 采用欧盟斑点法(EUROblot), 测定 150份SLE患者血清抗核糖体P蛋白抗体的阳性率, 并分析其与其他自身抗体(抗dsDNA抗体、抗Sm抗体和抗RNP抗体等), 以及患者的临床特征的相关性。结果: 150份患者血清中, 有 36例(24% )抗P蛋白抗体呈阳性。抗P蛋白抗体阳性组肾脏损害、中枢神经系统损害的发生率显著高于阴性组, 而与皮肤、关节、血液及肝脏的损害无关, 也与病情活动指数 (DAI)不相关。抗P蛋白抗体的阳性率与抗dsDNA抗体、抗Sm抗体及抗RNP抗体的阳性率相关。结论: SLE患者抗P蛋白抗体的阳性率高于欧美人群(13% )。该抗体与SLE患者的肾脏及中枢神经损害具有相关性。     

抗果蝇Dnop5蛋白抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备兔抗果蝇Dnop5蛋白的抗体,并进行特性鉴定。方法:以RTPCR扩增Dnop5的全长cDNA并克隆入pET28a( )表达载体中,表达并纯化Dnop5His融合蛋白。用纯化的Dnop5His融合蛋白免疫家兔,制备抗Dnop5的抗体,并用His亲和层析法进行纯化。采用Westernblot法和免疫组化染色法鉴定该抗体的特异性及生物学活性。结果:表达的Dnop5His蛋白以包涵体的形式存在,用His亲和层析法分离纯化后得到较纯的Dnop5His融合蛋白,以纯化的Dnop5His免疫家兔制备的兔抗Dnop5的抗体,经Westernblot分析显示:该抗体可与果蝇的胚胎、幼虫、蛹及成虫组织中表达的Dnop5特异性结合。结论:获得具有良好特异性的兔抗dnop5抗体,为进一步研究Dnop5的功能奠定了基础。     

人抗P53蛋白单克隆抗体的制备及评价

目的制备获得人P53蛋白单克隆抗体,并应用于免疫组化检测。方法利用基因重组方法,将p53基因构建到原核质粒载体上并诱导表达,将收集获得的P53蛋白免疫小鼠,经细胞融合及亚克隆手段获得鼠源单克隆抗体,与商品化的抗体DO-1共同染色蜡块包埋的病理组织样本,比较二者的染色结果。结果在筛选获得的与DO-1检测结果相近的5株抗体内,取检测结果最接近的1株抗体5E10,经Protein A/G株纯化抗体,与收集获得的数例癌症组织蜡块进行免疫组化验证,发现结果均与DO-1的结果无明显差异。结论成功制备并筛选出1株人抗P53单克隆抗体,可用于免疫组化染色。     

抗重组GST单克隆抗体的制备及其在融合蛋白纯化中的应用

目的 制备抗重组GST的单克隆抗体（mAb),并用来纯化重组GST融合蛋白,方法 用含重组GST融合蛋白基因的pGEX4T-1质粒转化E.coliBL21,IPTG诱导GST融合蛋白表达,亲和层析和凝胶过滤法分离表达的重组GST融合蛋白,以此蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,按传统的杂交瘤技术制备mAb。将抗GSTmAb经ProteinA纯化后,与Sepharose4B偶联。结果 经3次亚克隆后,获得两株分泌抗GST载体特异性mAb的杂交瘤,采用该mAb对两种不同的GST融合蛋白进行亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定达到了商品化Glutathione-Resin的亲和层析纯化效果。结论 用抗GST蛋白特异性mAb亲和层析纯化融合蛋白是一种经济、实用的方法,且可用于Glutathione-Resin亲和层析纯化后的二次纯化。     

抗人乙酰胆碱受体scFv-人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:制备抗人乙酰胆碱受体单链抗体637(scFv637)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,提高scFv637的稳定性。方法:用PCR扩增人HSA基因,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体scFv637基因的载体pHEN2中构建重组载体pHEN2-scFv637-HSA。以重组载体转化E.coliHB2151,表达产物用斑点杂交试验检测,并以SDS-PAGE和Westernblot鉴定其融合蛋白的相对分子质量(Mr)。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,扩增的人HSA基因和融合基因的大小分别为1770bp和7054bp。构建的scFv637-HSA经测序证实核苷酸序列正确,并且正确克隆至载体的开放读码框架内。表达产物仅存在于pHEN2-scFv637-HSA转化的E.coliHB2151外周质裂解液中。表达的融合蛋白的Mr约为95900。结论:在E.coli中成功地表达scFv637-HSA融合蛋白,为进一步对其进行功能研究和应用奠定了基础。     

IL－2和IL－6融合蛋白的分子生物学特性的研究

本文应用酶联免疫吸附技术对ＩＬ－６／２融合蛋白（ＦＰＩＬ－６／２）进行了定性、定量分析，测定其等电点，并对该蛋白的表位、柔性和抗原性进行了计算机模拟。ＥＬＩＳＡ测试结果表明：融合蛋白ＩＬ－６／２含有ＩＬ－２和ＩＬ－６两个结构域，可分别与ＩＬ－２和ＩＬ－６单克隆抗体结合，且两个结合无明显空间排阻效应，这与计算机的表位、柔性和抗原性分析结果一致。从计算机模拟也可以看出ＦＰＩＬ－６／２的抗原性与ＩＬ－２和ＩＬ－６的一致性，而且接头区抗原性较低，这为该蛋白的实际临床应用提供了一定的保证。     

抗人白介素6受体单抗的制备和鉴定

利用重组人可溶性ＩＬ－６受体免疫小鼠后，制备了两株抗ＩＬ－６Ｒ的单克隆抗体１７６／Ｂ６帮１５１／Ｈ１２两者分别识别ＩＬ－６胞外肽段的近膜区和远膜区。免疫迹分析表明，两株单抗均能够特异地结合天然的膜ＩＬ－６Ｒ蛋白，然而不能阻断ＩＬ－６Ｒ的生物功能。     

正常和失眠症患者血清神经肽Y和P物质对照研究

目的：探讨正常和失眠症患者血清神经肽Y（NPY）和P物质（SP）的特征。方法：选取国际疾病分类诊断标准（ICD-10）之相应诊断标准的失眠症患者75例及64名正常成人,以酶联免疫吸附法测定血清NPY及SP水平,以汉密尔顿焦虑量表（HAMA）及匹茨堡睡眠质量指数量表（PSQI）评定焦虑症状和主观睡眠质量状况。结果：（1）失眠症组血清NPY水平低于正常对照组（P〈0.01）。（2）血清SP水平高于正常对照组（P〈0.05）。（3）血清SP水平与病程、HAMA总分和PSQI总分无明显相关。结论：失眠症患者可能存在外周NPY及SP能神经元功能紊乱,值得进一步随访。     

P物质和P物质受体在小鼠胚胎发育期脑内的表达

目的研究小鼠胚脑发育期间P物质（SP）和P物质受体（SPR）的表达。方法分别取孕11、13、15、17和19d的小鼠胚脑和新生鼠脑。采用SP和SPR酶标免疫组织化学染色观察SP和SPR表达的变化。结果SP自小鼠胚胎11d开始出现少量表达,并一直持续到出生后,主要出现在发育过程中的新纹状体等部位;SPR与SP同时出现并持续到出生后,主要出现在发育过程中的延髓中缝等部位。结论SP和SPR在小鼠发育期间的表达提示SP可能参与中枢神经系统神经元形成和成熟调控。     

大鼠脊髓P物质受体定位分布的免疫细胞化学研究

用免疫细胞化学技术对大鼠脊髓和脊神经节内Ｐ物质受体的定位分布进行了系统的研究。结果证明，Ｐ物质受体阳性胞体和树突主要密集地分布于脊髓全长的Ⅰ层，此外，还发现Ⅱ层的外侧部出现少量阳性胞体和树突，来自Ⅲ层的阳性树突穿过Ⅱ层后进入Ⅰ层；Ⅲ～Ⅳ和Ⅹ层也可见中等密度的阳性胞体和树突；Ⅵ层和Ⅶ层仅见少量阳性胞体和树突，但胸髓中间带外侧核、骶髓副交感运动核、骶髓后连合核内可见大量浓染的阳性胞体和树突；Ⅷ、Ⅸ层、Ｏｎｕｆ氏核、外侧颈核和外侧脊索核也有阳性胞体和树突．灰质内的阳性胞体的树突还伸向前索和外侧索，有时可达脊髓的边缘．此外，脊神经节内也可见少量散在且均匀分布的小型阳性胞体．     

狼疮性肾炎患者可溶性IL－2R的检测

为了解可溶性白细胞介素２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）与狼疮性肾炎（ＬＮ）活动的关系，对３０例ＬＮ病人血清和尿液ｓＩＬ－２Ｒ含量进行测定。结果显示，ＬＮ活动组（１７例）血清ｓＩＬ－２Ｒ平均值为２７４．７±２０９．７Ｕ／ｍｌ，明显高于ＬＮ非活动组（１３例，平均值１１５．４±８５．ｌＵ／ｍｌ，Ｐ＜０．０２）和正常对照组（２０名，平均值１１３．５±４０．ｌＵ／ｍｌ，Ｐ＜０．０１），血清ｓＩＬ－２Ｒ水平变化与血清补体和肌酐值改变无明显相关性；尿液ｓＩＬ－２Ｒ的变化与血清相似，但两者间无明显相关性，亦与尿蛋白分泌无明显相关性；尿／血ｓＩＬ－２Ｒ比值在正常对照组为０．８８±０．４５，ＬＮ病人平均比值＞１。     

5—羟色胺受体和P物质受体在培养的人胎盘滋养层细胞的定位研究

目的：探讨培养的人胎盘绒毛滋养层细胞是否存在5－羟色胺受体（5－HTR）和P物质受体（SPR）,方法：采用细胞培养法和免疫细胞化学技术。结果：培养的滋养层细胞为5－HTR与SPR免疫阳性反应,免疫阳性物质位于胞浆内,胞核为阴性。结论：人胎盘滋养层细胞自身含有5－HTR和SPR,为在离体培养条件下研究5－HT和SP对胎盘激素的合成与分泌的调控作用提供了形态学依据。     

大鼠腰骶髓后连合核SP受体免疫阳性神经元与SP免疫阳性终末的突触联系

应用免疫组织化学双重反应的方法研究了大鼠腰骶髓后连合核内ＳＰ受体免疫阳性神经元在光、电镜下的特征及其与ＳＰ免疫阳性终末的突触联系。结果证明，ＳＰ免疫阳性终末和ＳＰ受体阳性胞体及树突均密集分布于后连合核区。在光镜下双重免疫反应阳性结果显示二者重叠分布，且可见大量的ＳＰ样免疫阳性终扣与ＳＰ受体阳性胞体或树突紧密接触。电镜下证明ＳＰ受体免疫阳性产物不仅位于突触后部位而且分布于胞体和树突的非突触部位，有４２％的ＳＰ受体阳性树突与ＳＰ阳性终末形成突触连接。在此未发现ＳＰ受体免疫阳性终末。通过一系列实验证明：腰骶髓后连合核神经元接受由ＳＰ介导的外周伤害性信息的传入，且其主要为盆腔脏器内脏初级传入成分。     

大鼠纹状体边缘区内5-HT_(2A)受体的分布──原位杂交和免疫组织化学研究

已知纹状体边缘区有密集的 5 -HT纤维及终末分布。为了观察 5 -HT2 A受体 m RNA是否在大鼠纹状体边缘区表达 ,从基因分子水平和细胞水平进一步证明大鼠纹状体边缘区能否合成 5 -HT2 A受体 ,用地高辛标记的寡核苷酸探针进行原位杂交 ,研究了大鼠纹状体边缘区的 5 -HT2 A受体 m RNA的表达及分布。原位杂交结果发现 5 -HT2 A受体 m RNA阳性杂交信号在纹状体的分布不均匀 ,尾壳核只有少量中等大小的阳性胞体 ,苍白球也只有少量较大的阳性胞体 ,而在尾壳核和苍白球之间的边缘区部位则可见到许多中等大小的梭形阳性神经元胞体 ,并呈现密集的带状分布。免疫组织化学结果观察到 5 -HT受体阳性神经元胞体在纹状体的分布与原位杂交结果一致。本实验结果推测 ,大鼠纹状体边缘区神经元可以合成 5 -HT2 A受体 ,具有接受和整合 5 -HT神经递质的功能     

多发性硬化患者血清sIL-6R 水平观察

为探讨可溶性白细胞介素－６受体（ｓＩＬ－６Ｒ）在多发性硬化（ＭＳ）发生、发展中的作用，采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法，对２８例ＭＳ患者和２５例正常对照组血清ｓＩＬ－６Ｒ水平进行了测定。结果显示缓解－复发型和进展型ＭＳ患者血清ｓＩＬ－６Ｒ水平明显高于正常对照组和良性型组（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）；而良性型ＭＳ患者血清ｓＩＬ－６Ｒ水平与正常对照组相比，未见明显改变。缓解－复发型ＭＳ患者血清ｓＩＬ－６Ｒ水平随着病情的好转而下降。ｓＩＬ－６Ｒ水平与ＭＳ患者头颅ＭＲＩ上的病灶大小和部位无明显相关性（ｒ１＝０．１２４，Ｐ＞０．０５；ｒ２＝０．０９１，Ｐ＞０．０５）。推测ｓＩＬ－６Ｒ水平的高低可作为判断ＭＳ患者病情变化的指标之一。