表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑室下区神经干细胞增殖分化的影响

背景：由于神经干细胞分化的多向性和不确定性给临床应用造成巨大困难，因此，探讨神经干细胞增殖分化条件已成为解决这一问题的关键。目的：观察表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑神经干细胞增殖分化的影响。设计：以培养的人胚神经干细胞为观察对象，随机对照实验。单位：解放军第一军医大学珠江医院儿科。材料：实验于2004—01／05在全军儿科中心实验室进行。随机在广州市某三级甲等医院产科选取自愿水囊引产的16周胎儿2例（胎儿父母签署同意书），取其脑室下区组织分别在无血清培养基和血清培养基进行细胞培养。方法：采用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及表皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基对人胎脑室下区组织进行原代细胞培养；两种生长因子的浓度均为20μg／L，采用血清培养基对原代培养的细胞克隆球进行分化实验；并采用免疫组化技术对分化细胞进行检测。主要观察指标：各组克隆球数量及其分化为神经元和星形胶质细胞的变化。结果：①碱性成纤维细胞生长因子组、表皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子组形成的原代克隆球数量无显著差异[（150．3&;#177;14．9），（173．6&;#177;26．4）个／孔，P〉0．05]，但均明显多于表皮生长因子组[（99.5&;#177;14．9）个／孔，P〈0．01]。②碱性成纤维细胞生长因子组以及表皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子组克隆球分化为神经元的数量明显多于表皮生长因子组，而表皮生长因子组产生较多的星形胶质细胞。结论：①碱性成纤维细胞生长因子能促进人胎脑室下区神经干细胞增殖，所形成的细胞克隆球能分化出较多的神经元。②两种因子合用并没有获得明显的优于单用碱性成纤维细胞生长因子的结果，提示不存在协同作用。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题.目的观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法.设计单一样本观察.单位四川大学生命科学院细胞生物学实验室.材料孕14 d SD大鼠10只,DMEM/F12 11,碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子;巢蛋白抗体IgG,β-微管蛋白Ⅲ抗体Ig G,胶质纤维酸性蛋白抗体Ig G,生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗.方法实验于1999/2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成.①从胎鼠前脑取出脑组织,采用酶消化、机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆.②神经干细胞以2×108L-1密度接种培养,分4组,每组6瓶细胞,DMEM/F12组加入DMEM/F12(11)培养基含体积分数为0.1的小牛血清;碱性成纤维细胞生长因子组培养基为含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子组培养基含30μg/L表皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子组先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2 h后再换成含表皮生长因子的培养基培养.培养24 h后更换培养瓶,培养14 d后显微镜下计数原代克隆数,免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达.主要观察指标①神经干细胞的原代克隆.②单细胞克隆培养结果.③诱导分化结果.结果①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力,免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高(0.630%).③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞.结论①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法.     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景：体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题。 目的：观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法。 设计：单一样本观察。 单位：四川大学生命科学院细胞生物学实验室。 材料：孕14dSD大鼠10只。DMEM／F12 1：1，碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子；巢蛋白抗体IgG，β-微管蛋白Ⅲ抗体IgG，胶质纤维酸性蛋白抗体IgG，生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗。 方法：实验于1999／2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成。①从胎鼠前脑取出脑组织，采用酶消化．机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆。②神经干细胞以2&;#215;10^8 L^-1密度接种培养，分4组，每组6瓶细胞，DMEM／F12组：加入DMEM／F12（1：1）培养基含体积分数为0．1的小牛血清；碱性成纤维细胞生长因子组：培养基为含20μg／L碱性成纤维细胞生长因子；表皮生长因子组：培养基含30μg／L表皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子＋表皮生长因子组：先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2h后再换成含表皮生长因子的培养基培养。培养24h后更换培养瓶，培养14d后显微镜下计数原代克隆数，免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达。 主要观察指标：①神经干细胞的原代克隆。②单细胞克隆培养结果。③诱导分化结果。 结果：①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力，免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高（0．630％）。③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞。 结论：①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景：影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。目的：观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12＋2%B27＋20μg/L表皮生长因子＋20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子＋神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果与结论：①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组均明显提高（P〈0.05）,且碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组神经元的比例最高（P〈0.05）。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景:影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。目的:观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12+2%B27+20μg/L表皮生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子+神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果与结论:①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组+神经生长因子组均明显提高(P<0.05),且碱性成纤维细胞生长因子组+神经生长因子组神经元的比例最高(P<0.05)。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

碱性成纤维细胞生长因子与表皮生长因子对神经干细胞增殖与分化的影响

目的:如何促进神经干细胞的增殖并诱导其向目的细胞类型分化是神经科学界研究的热点。本文就碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子在神经干细胞增殖、分化中的调节作用进行综述。资料来源:应用计算机检索PUBMED1998-01/2006-03期间的相关文章,检索词为“bFGF,EGF,nerve stem cells”,并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库2000-01/2006-03期间的相关文章,检索词为“碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,神经干细胞”,并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与碱性成纤维细胞生长因子/表皮生长因子在神经干细胞增殖、分化中的调节作用研究相关。排除标准:重复研究或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到78篇相关文献,32篇文献符合纳入标准,排除的46篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的32篇文献中,8篇涉及神经干细胞的研究现状,10篇涉及碱性成纤维细胞生长因子对神经干细胞增殖、分化的作用及其机制,4篇涉及表皮生长因子对神经干细胞增殖、分化的作用及其机制,8篇涉及碱性成纤维细胞生长因子与表皮生长因子合用对神经干细胞增值、分化的影响,5篇涉及碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对神经干细胞作用的比较。资料综合:①神经干细胞具有自我更新能力,在不同微环境中可增殖、分化为不同干细胞以及不同类型的成熟组织细胞,微环境中的多种细胞因子对其分化方向起着决定性的作用。②碱性成纤维细胞生长因子具有强大的促神经干细胞增殖作用,可激活中枢神经系统不同区域的神经元前体细胞潜在的再生能力,细胞增殖或分化呈碱性成纤维细胞生长因子浓度依赖性。③表皮生长因子既能促进神经干细胞的生长,也可促进其分化为神经元及神经胶质细胞。表皮生长因子促细胞增殖作用也呈浓度依赖性。④大多神经干细胞培养中都联合应用碱性成纤维细胞生长因子与表皮生长因子,从而提高神经干细胞增殖和分化的效率。⑤目前对表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的作用差异认识不统一。结论:碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子都具有较强的促进神经干细胞增殖和分化的作用,均属于神经干细胞培养中重要的神经促生长因子,其促细胞增殖和分化作用呈浓度依赖性。     

胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1联合诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化特点

目的:观察胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1体外联合诱导对脊髓源性神经干细胞分化的影响,为了解神经干细胞在体内多因素环境下的分化表现提供实验依据。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。①碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白多抗,神经丝蛋白单抗(Sigma)。②选用清洁级孕16d的SD大鼠10只,无菌条件下取出胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。基础培养基组成:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02B27添加液的DMEM/F12。③原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆,在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清作为对照。同时设立碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组,换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子 2μg/L转化生长因子β1。观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化行为,免疫细胞化学染色标记神经元与星状胶质细胞的表达。④通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化的形态学观察:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出3种神经细胞类型:神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②神经干细胞免疫组织化学检测:血清对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③流式细胞荧光分选计数:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组神经元分化比例最高,明显高于碱性成纤维细胞生长因子组(χ2=19.56,P<0.05),而与血清对照组、转化生长因子β1组比较差异有极其显著性意义(χ2=24.15,25.32,P均<0.01)。碱性成纤维细胞生长因子组星状胶质细胞分化比例最低,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组组与其相近(χ2=17.23,P>0.05),而血清对照组、转化生长因子β1组则显著升高(χ2=24.45,23.79,P均<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,为脊髓原位神经干细胞分化及神经干细胞移植体内后的分化表现提供了实验数据。     

联合应用碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响

背景:调控神经干细胞分化的微环境因素很多,数种因素可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞更有效地分化为神经元尤为关键.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子与脑源性神经营养因子联合应用对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2008-05在中国医科大学神经解剖研究室完成.材料:清洁级雄性SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供.方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 pm时,滴加含B27、表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12进行单细胞克隆培养.传代的神经干细胞分成4组:空白对照组加入含体积分数为10%胎生血清的DMEM/F12培养液,碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组分别在空白对照组培养液的基础上加入10 pg/L碱性成纤维细胞生长因子、200 μg/L脑源性神经营养因子、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+200 μg/L脑源性神经营养因子,培养1周.主要观察指标:免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞分化为神经元的比例.结果:单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.与空白对照组比较.碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组神经干细胞分化为神经元的比例均明显提高(t=3.409～7.558,P<0.05),且联合组升高幅度尤为显著.结论:适宜浓度的碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子联合应用,比其单独应用具有更强的促神经干细胞向神经元分化的作用.     

表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导体外培养大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响

目的:获得大量神经干细胞并且能够控制其向神经元定向分化可为进一步修复损伤大脑和治疗退行性神经系统疾病奠定种子细胞基础,实验观察了表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导神经干细胞向神经元分化过程中的影响.方法:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.①材料:清洁级雄性成年SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 μ m时,滴加DMEM/F12 2?7 20μg/L表皮生长因子 20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 条件培养液(细胞原代培养第7天的上清液的过滤液),进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、表皮生长因子组、脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组.空白对照组培养液为含体积分数0.1胎牛血清的DMEM/F12,其余3组培养液在此基础上分别加入各自对应的细胞因子培养1周,表皮生长因子浓度为20 μg/L,肺源性神经生长因子浓度为50 μg/L.③实验评估:传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定.计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况.结果:①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,表皮生长因子组有所降低:脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组均明显提高(t=2.309～2.779,P＜0.05),且后者提高幅度尤为显著(t=2.309,P＜0.05).结论:表皮生长因子可以提高脑源性神经生长因子诱导成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的比例.     

胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化

背景:胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1同属于转化生长因子β超家族,两者在哺乳动物中枢与外周神经系统发育、分化及细胞周期的调节中扮演重要角色。目的:观察胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导脊髓源性神经干细胞的分化,并与单一因子诱导培养液比较。设计:对照观察。单位:南方医科大学附属深圳医院中心实验室。材料:选用10只清洁级孕16d的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供。主要试剂及材料:DMEM/F12,B27(GIBCO);碱性成纤维细胞生长因子,EGF,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子-β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白(nestin)多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多抗,神经丝蛋白(NF-200)单抗(Sigma)。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。无菌条件下分离大鼠胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。实验分①基础培养基组:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02 B27添加液的DMEM/F12。原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆。②对照组:在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清。③碱性成纤维细胞生长因子组。④转化生长因子β1组。⑤胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组。换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子 2μg/L转化生长因子β1。①光镜观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化情况。②免疫细胞化学染色标记检测神经元与星状胶质细胞的表达。③通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。主要观察指标:①各组细胞分化的形态学特点。②各组神经干细胞免疫组织化学检测结果。③各组神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化形态:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②免疫组织化学检测结果:对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组及胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③神经元及星状胶质细胞的阳性百分比:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组神经元阳性百分比高于血清对照组、碱性成纤维细胞生长因子组及转化生长因子β1组(χ2=24.15,19.56,25.32,P<0.05～0.01),星状胶质细胞阳性百分比低于血清对照组及转化生长因子β1组(χ2=24.45,23.79,P<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,说明两者具有协同作用。     

不同培养条件下胚胎神经干细胞分化细胞中神经元所占比例的比较

目的比较细胞因子(bFGF、EGF)、B27及血清对胚胎神经干细胞分化的影响。方法从孕16-18d大鼠胚胎脑室旁组织分离神经干细胞,进行原代培养,分为B27组、bFGF+EGF组(联合组)、血清组及对照组;每天观察细胞生长状况。结果培养细胞呈Nestin免疫阳性;各组均可见干细胞的生长及分化。免疫荧光双标及图象分析结果B27组及联合组神经干细胞分化为神经元的比例大,联合组更突出(P<0.01);血清组及对照组神经干细胞组分化为胶质细胞比例较大,血清组更突出(P<0.01)。结论神经干细胞的分化同时受到内在基因和外在环境的影响,bFGF、EGF可促进NSC细胞生长,并对细胞分化为神经元起很大作用。     

人胎脑神经干细胞在发育期脑脊液中的迁移和分化

目的:探讨人发育期脑脊液对胎脑神经干细胞迁移和分化行为的影响.方法:取实验室液氮冻存的孕龄16周的胎脑细胞,复苏后加入含EGF、bFGF、B27及N2的DMEM/F12培养基,14 d后获得生长状况良好的神经球.胚胎组先后从蛛网膜下腔和脑室吸出脑脊液,小儿组均由腰椎穿刺或脑室穿刺获得脑脊液,将培养14 d的神经球分别接种于两组脑脊液中,于37 ℃、体积分数为5%的 CO_2饱和湿度孵箱中培养.观察神经球在脑脊液中的迁移和生长状态,免疫荧光鉴定脑脊液对神经细胞分化的影响.结果:神经球接种到脑脊液后,除小儿组有少数几个神经球未发生迁移外,其余神经球均在培养6 h即向外周迁移,且神经球周边细胞向外发出突起,形成细胞索,细胞索向外周延伸后进一步编织成细胞网.与胚胎组比较,小儿组胶质纤维酸性蛋白阳性率明显升高(P < 0.01),神经纤维及巢蛋白阳性率均明显降低(P < 0.01).此外,仅小儿组3份脑脊液培养的细胞为半乳糖脑苷脂阳性.结论:不同发育时期的脑脊液对神经干细胞的迁移和分化作用效果各异,提示脑脊液参与神经发育的调控,是脑发育的重要微环境影响因素.     

食蟹猴神经干细胞的培养与分化

背景:关于神经干细胞以往研究多集中在啮齿类和人类,涉及非人灵长类的神经干细胞研究较少.目的:建立食蟹猴神经干细胞的体外分离培养方法,并观察其分化潜能.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-07/2009-04在中山大学于细胞与组织工程研究中心完成.材料:孕3～5个月的食蟹猴流产胚胎,由蓝岛生物技术有限公司(华南非人灵长类研究开发中心)提供.方法:取食蟹猴胚胎的室管膜下区及海马区脑组织,放入神经干细胞悬浮培养液中,巴氏吸管吹打分散,得到单细胞悬液,调整细胞浓度为(2.0～5.0)×10~5接种于25 cm~2 培养瓶中,在37℃、体积分数为5%的CO_2条件下进行原代悬浮培养.待形成神经球2周后,接种于预先包被多聚鸟氨酸/纤维连接蛋白的培养板上进行贴壁培养.每天向孔内添加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子各20 μg/L,待细胞增殖到90%左右传代扩增.主要观察指标:利用免疫细胞荧光化学技术,对体外培养的食蟹猴神经干细胞表面标志性抗原nestin及其分化潜能进行鉴定.结果:悬浮培养1周后,倒置显微镜下可见神经球形成,神经球在培养过程中逐渐增大.第4周将神经球进行贴壁培养后,24 h可见神经球贴附于板壁,并有突触从球中伸出,随后大量细胞从神经球中迁出,逐渐铺满板壁.添加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子培养的神经干细胞呈nestin~+,而未添加两种因子的神经干细胞呈GFAP~+,Tuj 1~+,O4~+.结论:悬浮培养与贴壁培养相结合的方法较适合食蟹猴神经干细胞的培养及传代,分离出的食蟹猴神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元细胞、少突胶质细胞的能力.     

GFP转基因胚胎大鼠神经干细胞生物学特性研究

目的 体外分离、培养、鉴定绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）转基因胚胎大鼠神经干细胞，研究其体外活性与生物学性状，为在体分化示踪研究奠定基础。方法 采用机械分离，无血清传代培养法从GFP胚胎大鼠海马获得神经干细胞，免疫荧光和免疫细胞化学法染色进行体外神经干细胞性质和分化活性鉴定，并利用流式细胞计数法行纯度检测。结果 成功从GFP胎鼠海马获得神经干细胞，体外生长情况与活性良好，能分化成神经元和胶质细胞；体外连续传代3次后绝大部分细胞Nestin表达阳性，且分化后细胞的GFP表达不受影响。结论 GFP胚胎大鼠来源神经干细胞具有普通胎鼠NSCs相同的自我更新和多向分化潜能，且能稳定表达GFP，因此它可以成为示踪神经干细胞研究的有效工具细胞。     

表皮生长因子培养条件下脑源性神经生长因子诱导大鼠海马神经干细胞向神经元分化的最佳浓度

背景：目前神经干细胞的定向分化是神经干细胞研究的热点。脑源性神经生长因子作为诱导剂可否诱导神经干细胞分化为神经元。目的：观察在表皮生长因子培养条件下,不同质量浓度脑源性神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的影响。设计：对比实验。单位：中国医科大学人体解剖学教研室。材料：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。提取成年SD大鼠海马神经干细胞,无血清技术培养。清洁级成年SD大鼠3只,体质量200-250g,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供。方法：①无菌条件下分离大鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养神经干细胞。②取第4代神经干细胞,利用有限稀释法进行单细胞克隆培养。将单细胞克隆传代后的克隆球细胞进行神经干细胞的鉴定。克隆球细胞行巢蛋白免疫细胞化学染色,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。③单细胞克隆的神经干细胞脑源性神经生长因子诱导分化实验,根据脑源性神经生长因子质量浓度不同分成0μg/L浓度的对照组和50、100、150、200μg/L浓度的4个实验组,各组的培养液中均加入表皮生长因子,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况。主要观察指标：神经干细胞分化为神经元的比例。结果：①神经干细胞免疫细胞化学染色结果显示,单细胞克隆培养后克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②50,100μg/L组脑源性神经生长因子组神经干细胞分化为神经元比例明显高于对照组、150,200μg/L脑源性神经生长因子组组（t=2.502-5.025,P〈0.05）;50,100μg/L脑源性神经生长因子组之间神经干细胞分化为神经元的比例差异不显著（P〉0.05）;对照组、150,200μg/L组3组间神经干细胞分化为神经元比例差异不显著（P〉0.05）结论：在20μg/L表皮生长因子培养条件下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50μg/L。     

中枢神经系统再生的可能性:碱性成纤维生长因子和表皮生长因子对胚胎神经干细胞生长分化的影响

目的研究碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对胚胎神经干细胞生长和分化的影响.方法从孕11～13d大鼠胚胎神经管取神经干细胞,原代体外培养中加入bFGF和EGF,观察对神经干细胞胞体发育及突起生长的影响.结果EGF主要影响神经干细胞的增殖,也可以促进细胞突起的生长,但胞体直径与相应的对照组无显著差异;bFGF可促进胞体发育及突起的生长;两种因子联合应用,生长作用优于单独应用组.结论EGF和bFGF可以促进原代培养胚胎神经干细胞的生长和分化.     

体外血清预培养促进神经干细胞增殖

背景:神经干细胞的临床应用前景广阔,寻找多种方法体外促进神经干细胞的增殖和分化为今后的发展方向。目的:介绍一种省时且经济的神经干细胞的培养方法。设计:观察对比实验。单位:北京市神经外科研究所。材料:选择4只孕14天Wistar大鼠,常温常湿环境饲养,体质量(180±20)g,均购自中国医学科学院动物所(实验动物许可证号码:SCXK1100-0006)。DMEM/F12(1∶1)以及B27购自Gibco公司;碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子购自PeproTech公司;巢蛋白单克隆抗体、胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、半乳酸脑苷多克隆抗体和微管相关蛋白2单克隆抗体购自Chemicon公司。胎牛血清购自Hyclone公司。方法:实验于2004-05/2004-10在北京市神经外科研究所损伤修复室完成。将Wistar大鼠脱臼处死,每次取4只胎鼠,将其脑组织置于Hank’s液中,解剖显微镜下剥离软脑膜及血管,眼科剪剪碎脑组织并收集细胞于2个离心管中离心,弃上清液。①根据给予血清预培养与否将细胞分成血清预培养组及对照组。血清预培养组细胞加入含100g/L胎牛血清DMEM培养液,培养48h后换含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12培养液;对照组细胞中直接加含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12培养液,37℃,体积分数为0.05的CO2培养箱培养1周。通过相差显微镜观察血清预培养组对照组培养48h后神经干细胞的生长情况。②用100g/L胎牛血清诱导分化后的第5天和第10天行nestin、胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、半乳酸脑苷多克隆抗体和微管相关蛋白2单克隆抗体免疫荧光染色,采用荧光显微镜观察检测两组神经干细胞的表达;对照组采用PBS缓冲液替代一抗,其它步骤同血清预培养组。主要观察指标:①相差显微镜下观察血清预培养组及对照组神经干细胞培养48h后的生长状况。②免疫荧光染色检测两组神经干细胞的表达。结果:①血清预培养组细胞经培养48h后,出现大量较规则的神经干细胞球,多数细胞球由8-10个细胞聚集而成。改用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12培养液后,细胞球增殖很快;对照组细胞培养48h后只有不规则片状块,4-5d后才出现规则的小细胞球。②荧光显微镜观察可见两组细胞的分化速度和分化方向相同,在诱导分化后的第5天,nestin、胶质纤维酸性蛋白、半乳酸脑苷为阳性,微管相关蛋白2为阴性;在诱导分化后的第10天,nestin和胶质纤维酸性蛋白为阳性,半乳酸脑苷和微管相关蛋白为阴性。结论:血清预培养可使神经干细胞聚球速度加快,促进神经干细胞增殖。