TAFA2基因剔除小鼠模型的建立

目的 建立TAFA2基因剔除小鼠模型,为在体研究TAFA2基因的生物学功能及其与中枢神经系统发生、发育的关系创造条件. 方法 运用生物信息学手段确定小鼠TAFA2基因组的序列,设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-MCS-TAFA2,以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆,PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆. 结果 同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚后获得嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti（野生型）毛色的小鼠41只,其中14只为TAFA2基因剔除杂合子小鼠,阳性率为34.1%.在雌、雄杂合子小鼠交配的后代中获得纯合子小鼠,初步的表型观察未发现TAFA2基因剔除小鼠出现异常改变. 结论 已成功建立了TAFA2基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.     

Sumf2条件性基因剔除小鼠模型的建立及初步表型分析

目的建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,为整体水平研究Sumf2基因的生物学功能创造条件。方法运用生物信息学,采用ET克隆、同源重组、显微注射等技术成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,并通过该模型与Ella-cre转基因小鼠交配,获得Sumf2基因剔除小鼠模型,通过PCR、RT-PCR、WesternBlot等方法在不同水平验证Sumf2基因的表达;对该小鼠模型进行初步的表型分析。结果经胚胎干细胞打靶,获得19个正确同源重组的克隆,重组效率为20％：阳性克隆经囊胚注射,获得2只嵌合体雄鼠;嵌合雄鼠与C57BL／6J小鼠交配,获得28只灰鼠,经PCR鉴定16只为杂合子小鼠,阳性率为57％;与Ella—ere转基因小鼠交配,获得了Sumf2基因剔除小鼠模型,DNA、RNA及蛋白水平证明该基因已成功剔除;初步的表型观察未发现Sumf2基因剔除小鼠生长发育、血常规及血生化指标等出现异常改变。结论成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,该基因纯合缺失未发现明显的生长发育异常,为进一步的基因功能研究奠定了基础。     

Rtn4-A/B基因敲除小鼠模型的制备

目的通过制备Rtn4-A/B基因敲除小鼠,探索Rtn4-B基因的生物学功能。方法用细菌人工染色体(BAC)载体构建Rtn4-A/B基因打靶载体并使其线性化,通过电转化法将其转入129SvEv品系雄性小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)。将正确同源重组的ES细胞注射入C57BL/6J小鼠囊胚腔,繁育出嵌合体小鼠后,进一步繁殖以获得杂合子小鼠。抽提小鼠尾尖组织DNA,采用PCR法鉴定小鼠的基因型。结果基因打靶后,得到14个发生双臂正确同源重组ES细胞克隆。利用阳性ES细胞克隆进行囊胚内显微注射,得到5只嵌合率大于50%的雄鼠,最终繁育得到4只Rtn4-A+/-B+/-杂合子小鼠。结论利用ES细胞基因打靶、同源重组等方法,成功获得Rtn4-A/B基因敲除杂合子小鼠。     

微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠的制备和鉴定

目的 制备微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠.方法 构建miR-302s打靶载体,通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞(ES细胞),用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定和Southern分析.利用显微注射技术将正确同源重组的ES细胞注射至B6(Cg)-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J小鼠囊胚腔内,注射后的囊胚植入受体小鼠子宫.将得到的嵌合体小鼠与野生型雌鼠交配获得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠.结果 获得嵌合体小鼠11只,其中4只嵌合雄鼠嵌合率＞50％.利用嵌合体小鼠进行繁育交配,得到miR-302s基因打靶杂合子小鼠11只.结论 成功建立miR-302s条件性基因打靶小鼠模型,为进一步研究miR-302s基因功能打下基础.     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因R528H突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。     

Brevican基因敲除小鼠的制备

目的制备brevican基因敲除小鼠。方法采用ET克隆方法,构建brevican打靶载体。线性化打靶载体,电转化胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),将正确同源重组的ES细胞注射入囊胚腔,生育嵌合体,再交配繁育杂合子及纯合子。PCR法鉴定小鼠的基因型。结果将PGK启动子指导的NEO表达框敲进Bcan第3外显子,敲除第3～8外显子序列,得到打靶载体,上游臂为2.4 kb,下游臂为4.8 kb。基因打靶后,得到双臂均发生正确同源重组的克隆数14个。利用阳性ES细胞克隆注射入囊胚,得到3只嵌合率大于50%的雄鼠,繁育得到6只Brevican-/-纯合子小鼠。结论利用同源重组方法,成功敲除干细胞靶基因,建立Brevican-/-建系小鼠。     

Tex101条件性基因敲除小鼠模型的建立和表型鉴定

目的建立Tex101（Testis expressed gene101）条件性基因敲除小鼠模型并进行表型鉴定。方法构建针对小鼠Tex101基因2、3号外显子的重组载体,通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞（ES细胞）,用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定。利用显微注射把发生正确同源重组的ES细胞注射进C57BL／6J小鼠囊胚,移人受体小鼠子宫。将得到的嵌合体小鼠与C57BL／6J雌鼠交配获得Tex101-LoxP转基因小鼠。该小鼠与EⅡa—Cre转基因小鼠杂交,通过子代自交获得Tex101条件性基因敲除（cKO）小鼠并进行初步分析。结果得到2只Tex101cKO雄鼠。冰冻切片观察发现Texl01cKO雄鼠睾丸形态和大小与野生型小鼠相比无明显差异。结论成功建立了Tex101条件性基因敲除小鼠模型,并初步验证了该基因对雄性小鼠睾丸大小和形态无明显影响,为进一步研究Tex101基因功能奠定了基础。     

心肌乙酰胆碱敏感钾通道基因敲除小鼠模型的建立

目的建立Kcnj5基因敲除小鼠模型,构建病理生理或药理实验平台,以确定钾通道和东莨菪碱等药物和心衰治疗的关系。方法用细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）载体构建了缸面5打靶载体,电穿孔到129／S6／SvEv品系雄性小鼠的胚胎干细胞SCR012后,用300μg／mlG418、2μmol／LGanC筛选克隆8d。打靶后的干细胞显微注射到囊胚后．生育嵌合体再交配繁育杂合子及纯合子。用PCR方法结合片段克隆后基因测序鉴定基因型。免疫组化法证实基因型的表达。结果挑取抗性克隆96个中正确同源克隆数20个,阳性率为20．8％。显微注射C57BL／6J囊胚180枚．14只受体出生12只小鼠中得到4只大于50％嵌合率雄鼠。配育获得29只尉r3．4 1代杂合子。现繁育F4后代获得尉r3．4＇纯合子约百只。用单抗对敲除鼠心进行免疫组化鉴定,提示纯合子敲除鼠心为阴性。结论用同源重组法敲除了干细胞靶基因,成功建立腼r3．4‘建立鼠系。成功建立鲋r3．4钾通道分子病动物模型。该基因的完全缺如模型有利于隔离了该基因的作用,对与之相关的基因的进一步阻断、拈抗或激活等药物研究．也是一个很好的模型。     

线粒体钾通道Kcna3基因敲除小鼠初步制备

目的为观察线粒体钾通道在缺血再灌注(I/R)心肌损伤中的作用,探讨其和心衰的关系,制备基因敲除小鼠模型以探讨钾通道单分子作用。方法用BAC载体制备同源重组载体,对129小鼠胚胎干细胞(ES)打靶筛选后,显微注射至C57BL/6J小鼠囊胚获得嵌合小鼠。经尾基因组DNA PCR鉴定和测序,鉴别杂合子小鼠。结果在40只灰色小鼠中初步鉴定出Kcna3+/-基因型F1小鼠8只。结论在国内首先用ES同源重组基因打靶方法,成功育成Kcna3基因敲除鼠杂合子,为下一步获得纯合子鼠奠定了基础。对进一步用钾离子通道病模型研究心肌保护病理生理机制和药物筛选具重要意义。     

基于Cre/loxP系统的糖皮质激素受体基因条件性打靶嵌合鼠的获得

目的:应用Cre/loxP系统建立诱导型糖皮质激素受体(GR)基因剔除小鼠模型,为在体内直接进行GR基因的研究提供条件.方法:针对GR基因第2外显子构建诱导型目标载体,将打靶载体电穿孔转染胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),经Southern杂交筛选发生正确同源重组的ES细胞,囊胚注射法制备嵌合体并进行生殖系检测及纯化建系.结果:成功构建了针对GR基因第2外显子的诱导型目标载体,转染ES细胞获得了工程化的ES细胞,经囊胚注射获得了由工程化的ES细胞和体细胞共同发育而来的嵌合体小鼠.结论:基于Cre/loxP系统的GR基因条件性打靶嵌合鼠的获得,为得到理想的诱导型GR基因剔除小鼠模型奠定了基础.     

碳水化合物反应元件结合蛋白条件性基因敲除小鼠模型的建立及鉴定

目的 建立转录因子碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）的条件性基因敲除小鼠模型,为研究ChREBP的体内生物学功能提供技术手段。方法和结果 利用Cre/loxP基因打靶策略,通过构建基因打靶载体和基于胚胎干细胞（ES细胞）的基因同源重组,在ChREBP基因第8外显子的两侧分别引入loxP位点;将打靶成功的ES细胞显微注射至小鼠囊胚,然后植入假孕雌鼠子宫获得嵌合鼠,进一步获得可种系传代的ChREBP^flox/+小鼠;将ChREBP^flox/+小鼠与Alb-Cre小鼠交配,获得ChREBP的肝脏特异性基因敲除小鼠。结论 建立了ChREBP条件性基因敲除小鼠模型,为揭示不同组织中ChREBP的生理功能和病理学意义提供了重要手段。     

采用CRISPR/Cas9技术构建新品系HBeAg转基因小鼠

目的培育一种HBeAg转基因小鼠新品系。方法克隆乙型肝炎病毒HBeAg基因;采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重 组的方式分别在Rosa26基因位点定点插入pliver-HBeAg表达框,获得含有HBeAg基因的表达载体pliver-HBeAg,经酶切得到 含有HBeAg基因的线性DNA 片段,将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,再将其移植 入C57BL/6J雌性代孕小鼠子宫,获得F0代建系小鼠;采用长片段PCR对出生小鼠进行鉴定,共获得HBeAg基因正确同源重组 的F0代建系小鼠;F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育获得F1代小鼠,经PCR鉴定及测序确认阳性F1代小鼠;将 携带HBeAg基因的F1代转基因小鼠再次回交,对子代小鼠进行PCR基因型鉴定,直至获得纯合子子代转基因小鼠;采用全自 动化学发光免疫分析仪、胶体金法和免疫组织化学方法分别检测HBeAg转基因鼠血浆和肝组织中HBeAg和HBeAb的表达。 结果采用CRISPR/Cas9技术共获得56只F0代小鼠,其中2只为正确同源重组的F0代小鼠;F1代小鼠中6只阳性F1代小鼠。 截至目前,共获得22只F2代纯合子和29只杂合子HBeAg转基因小鼠。所有HBeAg转基因小鼠外周血中均可检出高浓度的 HBeAg蛋白,但未检出HBeAb的表达。而且免疫组化结果显示HBeAg转基因小鼠肝脏肝细胞中可特异性表达HBeAg蛋白。 结论采用CRISPR/Cas9技术成功构建了能在肝脏肝细胞中稳定表达HBeAg蛋白且对HBeAg免疫耐受的新品系HBeAg转基 因小鼠,为HBV的研究提供了新的实验动物模型。     

蛋白4.1R基因敲除小鼠的引种及繁殖

目的:引种、繁殖4.1R基因敲除小鼠,用于蛋白4.1R功能的研究.方法:按照国家进出境动物检验检疫的具体要求,对引种自美国的3对4.1R基因敲除小鼠进行隔离、检疫.引进的种鼠按照SPF动物饲养标准操作规程在IVC屏障系统中进行1雄1雌长期同居方式繁殖,C57BL/6J对照组小鼠采用同样方式饲养繁殖.定期观察记录种鼠的繁...     

Establishment of Germ-line Competent C57BL/6J Embryonic Stem Cell Lines

Objective To establish C57BL/6J embryonic stem （ES） cell lines with potential germ- line contribution Methods ES cells were isolated from blastocyst inner cell mass of C5 7BL/6J mice, and cultured for 15 passages, and then injected into blastococels of ICR mice blastocysts to establish chimeric mice. Results Three ES cell lines （mC57ES1,mC57ES3, mC57ES7） derived from the inner cell mass of C57BL/6J mice blastocysts were established. They were characteristic of undifferentiated state, including normal XY karyotype, expression of a specific cell surface marker “stage-specific embryonic antigen-I” and alkaline phosphatase in continuous passage. When injected into immunodeficient mice, mC57ES1 cells consistently differentiated into derivatives of all three embryonic germ layers. When mC57ES1 cells were transferred into ICR mice blastocysts, 4 chimeric mice have been obtained. One male of them revealed successful germ-line transmission. Conclussion We have obtained C57BL/6J ES cell lines with a potential germ-line contribution, which can be used to generate transgenic and gene knock-out mice.     

无bFGF条件下简便有效建立C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系

目的:在不含bFGF的Knockout血清替代品(knockout serum replacement,KSR)的培养条件下,简便、有效地建立小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)系.方法:以C57BL/6J小鼠3.5天囊胚为材料,改良巴氏德管机械法分离内细胞团,于加或不加碱性成纤维细胞生长因...