端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞的影响

目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的作用。方法：用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人胃癌细胞株共同温育一定时间后，观察细胞形态变化，检测细胞DNA含量的分布，测定端粒酶活性。结果：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人胃癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；电泳呈凋亡特征性Ladder带；流式细胞仪分析显示，在G1期前出现亚2倍体凋亡峰；端粒酶活性抑制。结论：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端合成，从而抑制胃癌细胞的增殖。     

端粒酶反义寡核苷酸对食管癌细胞Eca-109端粒酶活性及细胞凋亡的影响

目的探讨人端粒酶反义寡核苷酸(PS-ASODN)对食管癌Eca-109端粒酶活性及细胞凋亡的影响。方法1-5uM的PS-ASODN、5uM的N-ASODN作用于Eca-109细胞后,在倒置显微镜下连续观察Eca-109细胞形态学改变;采用半定量TRAP-银染法检测端粒酶活性;用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期变化。结果PS-ASODN对Eca-109细胞具有生长抑制作用,PS-ASODN作用后,细胞的生长速度缓慢,细胞体积缩小,部分细胞变形漂起。随着药物浓度增加,PS-ASODN对Eca-109细胞端粒酶活性的抑制作用逐渐增强,呈浓度依赖性和序列特异性。流式细胞仪检测到凋亡峰并受阻于G0/G1期,而对照组寡核苷酸无上述作用。结论PS-ASODN不但抑制食管癌的增殖,降低端粒酶的活性,而且具有促凋亡的作用,对食管癌的临床治疗具有重要的价值。     

hTERT mRNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长抑制的研究

目的探讨以hTERT mRNA作为靶位的肝癌治疗的可行性。方法人工合成hTERT mRNA反义寡核苷酸，导入体外培养的人肝细胞癌细胞系HepG2。提取细胞总RNA，采用RT-PCR方法检测hTERT mRNA的表达量，观察反义核酸对肝癌细胞hTERT mRNA表达的抑制作用。测定细胞生长曲线，评价反义核酸药物对肝癌细胞生长的抑制作用。结果经hTERT mRNA反义寡核苷酸处理后，细胞hTERT mRNA表达水平与对照组相比显著降低（P〈0．05），为对照组表达水平的26％，而随机序列寡核酸处理组与对照细胞无显著性差异（P〉0．05）。同时，细胞经hTERT mRNA反义寡核苷酸处理后其生长明显受到抑制，而随机序列处理后与对照组细胞的生长曲线无显著性差别。结论hTERT mRNA的表达与肝癌细胞增殖活性相关，人工合成的hTERT mRNA反叉寡核苷酸可以抑制hTERT mRNA的表达，并可以进一步抑制肝癌的增殖。     

端粒酶RNA的反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究

目的研究端粒酶RNA的反义寡核苷酸(As-ODN)抗白血病作用及其机制。方法采用脂质体包裹As-ODN转染入HL-60细胞;用端粒重复序列扩增法(TRAP)-酶联免疫吸附试验(ELISA）检测HL-60细胞的端粒酶活性变化;用细胞形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测凋亡细胞。结果0.1～2.0?μmol/LAs-ODN转染入HL-60细胞,培养1～6?d,HL-60细胞端粒酶活性（A值）由1.043±0.045降至0.063±0.011,且有剂量依赖性和时间依赖性。As-ODN转染的HL-60细胞培养后细胞增殖速度减慢,发生了细胞凋亡。而错义寡核苷酸(Ms-ODN)则无此效应。结论As-ODN能特异性抑制HL-60细胞的端粒酶活性,诱导细胞凋亡。     

TGFβ1反义寡核苷酸对人腹膜间皮细胞增殖和纤维连接蛋白的影响

目的探讨阳离子脂质体介导的TGFβ1反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,ASON)对人腹膜间皮细胞(HPMC)体外增殖及其分泌纤维连接蛋白(FN)的影响,初步探索腹膜间皮细胞对腹膜纤维化影响和TGFβ1反义寡核苷酸对其的干预作用,为临床防治腹膜纤维化寻找有效途径。方法①人腹膜间皮细胞原代培养,第三代用于实验;②合成特异性针对TGFβ1mRNA转译起始区ASON及正义、错义寡核苷酸,并和阳离子脂质体形成复合物;③将合成的寡核苷酸与第三代腹膜间皮细胞共同孵育24、48h,分为对照组(F12培养基组)、TGFβ1反义寡核苷酸组、TGFβ1正义寡核苷酸组和TGFβ1错义寡核苷酸组,采用MMT法观察细胞增殖,ELISA法测定细胞上清液内FN蛋白含量以及RT-PCR测定FNmRNA表达。结果①TGFβ1反义寡核苷酸作用人腹膜间皮细胞24、48h后,其细胞增殖率明显低于其它各组(P均<0.05);②TGFβ1反义寡核苷酸作用人腹膜间皮细胞24、48h后其上清液中FN蛋白质的含量明显降低;TGFβ1正义寡核苷酸组明显升高(P<0.05);③正义、反义和错义各组寡核苷酸作用人腹膜间皮细胞24h时FNmRNA表达与对照组比较,正义组上调22%,而反义组和错义组分别下调22%和11%。结论TGFβ1反义寡核苷酸能够抑制人腹膜间皮细胞增殖和FN的过度表达。     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的探讨生存素反义寡核苷酸(ASODN)对人胃癌细胞SGC7901凋亡的诱导作用。方法设计合成特异性靶向survivin ASODN。胃癌细胞株SGC7901分为4组:空白对照组(Sham)、单纯脂质体对照组(Lip)、正义链转染对照组(Lip-SODN)、ASODN转染组(Lip-ASODN)。作用12、24、48 h后收获各组细胞。Western blot法检测各组细胞survivin表达情况,倒置显微镜观察细胞生长形态变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中Ki67表达。结果脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞出现survivin蛋白表达明显下降;形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、凋亡小体形成;细胞凋亡率明显高于各对照组(P<0.05);细胞中Ki67表达水平明显降低。结论survivin反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的探讨生存素反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901凋亡的诱导作用。方法设计合成特异性靶向survivin ASODN。胃癌细胞株SGC901分为4组：空白对照组（Sham）、单纯脂质体对照组（Lip）、正义链转染对照组（LipSODN）、ASODN转染组（Lip-AKSODN）。作用12、24、48h后收获各组细胞。Westernblot法检测各组细胞survivin表达情况,倒置显微镜观察细胞生长形态变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中Ki67表达。结果脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞出现survivin蛋白表达明显下降;形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、凋亡小体形成;细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0．05）;细胞中Ki67表达水平明显降低。结论survivin反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。     

人端粒酶核糖核酸反义寡核苷酸可增强顺铂诱导原代白血病细胞凋亡的作用

目的:探讨人端粒酶核糖核酸(human telomerase ribonucleic acid,hTR)反义寡核苷酸(an-tisense oligodeoxynucleotides,ASODN)对顺铂诱导原代白血病细胞凋亡的影响.方法:采用与hTR模板互补的硫代ASODN处理原代白血病细胞,采用端粒酶重复扩增分析-聚合酶链反应-酶联免疫分析法检测端粒酶活性的变化;采用苔盼蓝拒染法观察经hTR ASODN处理的原代白血病细胞对顺铂的反应:采用An-nexin V与碘化丙啶双染色观察凋亡细胞形态及用流式细胞仪检测凋亡细胞率.结果:经hTR ASODN作用后,原代白血病细胞端粒酶活性明显下降.ASODN作用24小时,再加入顺铂作用48小时,明显抑制原代白血病细胞,并使原代白血病细胞凋亡明显增加.ASODN作用24小时后再加入5 μmol/L顺铂作用72小时的原代白血病细胞凋亡率为(41±9)%,分别高于正义寡核苷酸加顺铂组[(15±5)%]及单用顺铂组[(13±3)%],差异有统计学意义(均为P＜0.01).结论:hTR ASODN可明显抑制原代白血病细胞端粒酶活性,并增强顺铂诱导原代白血病细胞的凋亡,人端粒酶有可能成为白血病基因治疗的新靶点.     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸诱导人胃癌细胞凋亡模型构建的研究

目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对胃癌细胞株的作用。方法：用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与胃癌细胞株共同孵育一定时间后,观察细胞形态变化,观察细胞DNA含量的分布,测定端粒酶活性。结果：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为细胞膜起泡,染色质固缩,核碎裂,凋亡及小体形成;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,在D1期前出现亚2倍体凋亡峰;端粒酶活性抑制。结论：端粒酶反义寡取脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,抑制端粒合成,从而抑制胃癌细胞的生长。     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用

为了研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖状态,应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性。结果发现反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,hTERT基因表达明显受抑,细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示反义寡核苷酸10、20和30μmol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39,0.944±0.16,与未作用组(2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);正义寡核苷酸20μmol/L作用组(OD450-690值为2.376±0·65)与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。TRAP-PAGE检测表明hTERTASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol/L作用组条带最少。结论hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖,下调端粒酶活性。     

HMGA2反义寡核苷酸抑制乳腺癌细胞增殖的研究

目的观察反义寡核苷酸（antisense01igodeoxynucleotide，ASODN）能否降低人乳腺癌细胞株MCF～7中HMGA2基因的表达，以及能否抑制其细胞增殖。方法将HMGA2ASODN及其对照序列（空白对照和错配序列）通过脂质体转染MCF-7细胞，应用Westernblot观察HMGA2蛋白表达的变化，然后应用MTT观察细胞增殖。结果HMGA2ASODN能特异性下调MCF-7细胞HMGA2蛋白，而且能抑制其细胞增值。结论HMGA2AsODN抑制乳腺癌细胞增殖具有可行性。     

反义寡核苷酸靶向hTERT对K562细胞株端粒酶活性和细胞凋亡的影响

本研究探讨靶向封闭端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的反义硫代寡核苷酸(antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,ASPSODN)对K562细胞目的基因抑制作用及对端粒酶活性和细胞凋亡的影响.选用3种浓度ASPSODN,分别为0.2 μmol/L、0.6 μmol/L、1.0 μmol/L,同时设空白组、脂质体组和三种相同浓度正义硫代寡核苷酸(SPSODN)作为对照,转染到人红白血病细胞株K562,于24、48小时收集细胞进行检测.用RT-PCR检测靶基因hTERT mRNA的表达,TRAP-ELISA检测细胞端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果表明①K562细胞被转染24小时后,hTERT mRNA的表达在脂质体组为0.80±0.24,在0.2 μmol/L ASPSODN组为0.69±0.12,在SPSODN组为0.72±0.25,它们与空白对照组(0.85±0.28)无统计学差异(p＞0.05),而0.6μmol/L ASPSODN组的hTERT mRNA的表达(0.42±0.16)比脂质体组明显下调(p＜0.05),而相同浓度的sPSODN组则下调不明显(0.69±0.26),1.0 μmol/L ASPSODN和SPSODN对hTERT表达都表现出一定的抑制.采用台盼蓝拒染法染色显示,经脂质体转染的1.0 μmol/L ODN无论正义或反义时,细胞死亡明显增多.②24小时端粒酶相对活性空白对照组为88.9%,脂质体作用组为77.7%,两者无显著性差异;0.2、0.6、1.0 μmol/LASPSODN作用后端粒酶相对活性分别为60.6%、52%、58%,与空白对照组相比均有显著性差异(p＜0.05),其中0.6 μmol/L ASPSODN组间与脂质体组有显著性差异(p=0.037);而0.2、0.6、1.0 μmol/L作用后SPSODN组端粒酶相对活性分别为76.1%、72.2%、65.7%,0.2和0.6 μmol/L SPSODN组与空白组、脂质体组间均无统计学差异.48小时ASPSODN各作用组则端粒酶活性有所恢复,0.2、0.6、1.0 μmol/L ASPSODN作用后端粒酶相对活性分另1为84.1%、82.3%、79.6%;而48小时0.2、0.6、1.0 μmol/L各SPSODN组端粒酶相对活性分别为74.8%、74.5%、67.9%,0.2和0.6 μmol/L SPSODN组间端粒酶活性无明显抑制.③培养48小时后0.6 μmol/LASPSODN组和SPSODN组细胞凋亡率分别为4.34%和1.83%,脂质体作用组为1.84%,空白对照组为1.07%,ASPSODN和SPSODN组两者问有统计学差异(p＜0.05),ASPSODN组与脂质体作用组及空白对照组间有显著性差异(p＜0.01).结论ASPSODN靶向hTERT能特异性抑制K562细胞hTERT mRNA的表达,明显下调K562细胞株端粒酶活性,最佳作用浓度为0.6 μmol/L,但抑制时间较短,24小时明显抑制,48小时则有所恢复.高浓度(1.0 μmol/L)寡核苷酸表现出一定的细胞毒性;48小时0.6μmol/L ASPSODN能明显诱导细胞凋亡,而SPSODN组则无此作用,两者间有显著性差异(p＜0.05).     

肝细胞生长因子对人胃癌细胞株AGS增殖的促进作用

目的:肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一种多肽生长因子,具有促进细胞增殖、诱导细胞迁移和形态改变的作用。本研究探讨HGF对人胃癌细胞株AGS增殖的影响。方法:体外培养人胃癌细胞株AGS,应用浓度为25、50、75、100 ng/mL的HGF分别处理AGS细胞24 h、48 h、72 h,采用CCK-8法检测AGS细胞的增殖情况。结果:CCK-8法检测结果显示,不同浓度的HGF对AGS细胞均有促增殖作用,随着HGF浓度的增加或作用时间的延长,细胞增殖活力呈上升趋势,在72 h最为明显,呈时间、浓度依赖关系(t为3.89、5.28、9.73、11.00,P0.01)。结论:HGF能显著促进人胃癌细胞株AGS的增殖。     

人类端粒酶逆转录酶基因反义核苷酸对白血病细胞端粒酶活性的影响

为了探讨人类端粒酶逆转录酶（hTERT)基因反义寡核苷酸（ASODN）对原代培养的急性髓性白血病（AML）和慢性髓性白血病（CML）细胞端粒酶活性的影响。采用间接免疫荧光标记方法，通过流式细胞术检测hTERT基因ASODN作用于AML和CML细胞后hTERT蛋白表达含量的变化。采用端粒酶聚合酶链反应-酶子弟免疫测定（PCR-ELISA0法检测白血病细胞端粒酶活性的改变。结果显示：hTERT ASODN作用于AML和CML细胞24，48和72小时后，hTERT蛋白表达水平不断降低；同时，AML和CML细胞端粒酶活性均逐渐受到抑制。结论：hTERT基因ASODN可以通过特异性地抑制AML和CML细胞hTERT蛋白的表达，抑制AML和CML细胞端粒酶的活性。     

c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性影响及诱导凋亡作用

为了研究c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞端粒酶活性的影响及其诱导凋亡作用,探讨HL-60细胞端粒酶活性与c-myc基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞c-myc基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,采用流式细胞术进行细胞凋亡检测及细胞周期分析,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA断裂情况,应用TRAP-ELISA法测定HL-60细胞端粒酶的活性。结果表明:反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,c-myc基因表达明显受抑;S期细胞百分数由55.6%降至30%,并出现早期凋亡峰(凋亡细胞比例占25.2%);琼脂糖凝胶电泳显示DNA凋亡梯形带;端粒酶活性检测发现反义寡核苷酸3,4,5μmol/L作用组OD450-690分别为1.952±0.14,1.805±0.40,1.616±0.41,与未作用组(OD450-690为2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);反义寡核苷酸1和2μmol/L作用组及正义寡核苷酸5μmol/L作用组OD450-690分别为2.324±0.36,2.162±0.38,2.466±0.29,与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:c-myc基因反义寡核苷酸能够通过封闭c-myc基因的表达而诱导HL-60细胞凋亡,阻止细胞由G1期进入S期,并具有下调端粒酶活性作用。     

金雀异黄素对人结肠癌细胞株增殖的影响

目的 研究金雀异黄素（GEN）对人结癌细胞系（SW480）细胞的作用并探讨其作用机理。方法 采用细胞计数法MTT法、免疫组化等方法，观察GEN对体外培养的SW480细胞的生长抑制以覆COX2表达的影响。结果 GEN对体外培养SW480细胞具有明显的生长抑制效应且呈剂量-效应的依赖关系，当50μmol／LGEN作用SW480细胞24h，抑制率达28％。免疫组化的结果显示：GEN处理后的SW480细胞COX2表达下降。结论 CEN对体外培养SW480细胞具有增殖抑制作用，CEN通过下调SW480细胞COX2蛋白的表达，促进细胞凋亡。     

胃癌病人胃液中端粒酶活性的检测意义

目的:运用端粒酶半定量检测方法对病人的胃液进行检测,比较原发性胃癌、胃癌癌前病变和对照组病人胃液中端粒酶活性及胃癌病人术前术后胃液端粒酶活性,总结出其中的规律,为胃癌的基础研究和临床检测提供理论依据。方法:对比分析22例胃癌病人、14例癌前病变病人、15例对照组病人和18例胃癌术后病人胃液端粒酶活性的检测结果。结果:端粒酶活性(OD值)平均值为:胃癌组(0.755±0.107)>癌前病变组(0.464±0.078)>对照组(0.265±0.073),且每两组之间的差异均有统计学意义,P值均为0.000;术前组(0.758±0.107)>术后组(0.425±0.085),两组之间的差异有统计学意义,P=0.000。结论:端粒酶的活化是胃癌癌变过程的一个早期事件,端粒酶活性的检测有可能成为胃癌早期诊断、术后检测手术效果和术后复发检测的指标。     

细胞周期蛋白D3反义寡脱氧核苷酸对白血病细胞系CEM的生长抑制作用

为了研究细胞周期蛋白D3(cyclin D3)过度表达在白血病细胞增殖和白血病发生中所起的作用,选用过度表达cyclin D3的人T细胞白血病细胞系CEM,利用cyclin D3特异的反义寡脱氧核苷酸作用于CEM细胞,观察对CEM细胞生长的影响。经流式细胞术检测,cyclinD3的表达水平明显下降,同时CEM细胞生长明显受到抑制,G_0/G_1期细胞所占比例增大。实验结果说明cyclin D3过度表达在促进白血病细胞增殖中起着重要作用。