2001年研究生毕业论文摘要

阿霉素单用及联用维拉帕米对 OS732细胞毒性作用的机制硕士研究生　陈　鹏专　　　业　外科学 (骨科学 )导　　　师　林建华教授　　目的　探讨阿霉素对 OS732细胞的毒性作用 ,维拉帕米是否对阿霉素有增效作用及其作用机制。　方法　用MTT法检测肿瘤细胞存活率 ,比较单用阿霉素及联用维拉帕米对 OS732细胞的毒性作用 ;以流式细胞仪方法检测阿霉素及联用维拉帕米诱导后不同时间点 OS732细胞多药耐药指标 (Pgp、Topo 和 GSTπ)表达情况 ;以琼脂凝胶电泳法观察阿霉素单用及联用维拉帕米诱导后不同时间点 OS732细胞抽取 DNA的电泳图 ;…     

阿霉素单用或联用维拉帕米对OS732细胞的毒性作用

目的 探讨阿霉素单用及联用维拉帕米对骨肉瘤细胞株（OS732细胞）的毒性作用。方法 用MTT比色法检测按不同浓度梯度阿霉素或联用维拉帕米干预OS732细胞24，48，72h 后的细胞活性；用流工细胞仪检测阿霉素单用及联用维拉帕米干预OS732细胞2，12，24，48及72h后Fas抗原（CD95）表达率，结果 阿霉素对OS732细胞的毒性作用呈剂量依赖关系，但并不随时间增加等幅增加，无细胞毒作用的维拉帕米对阿霉素有增效作用。结论 联用维拉帕米对阿霉素的增效作用可能与促细胞凋亡作用有关。     

MDR基因及MDR基因编码产物在咽喉部恶性黑色素瘤中表达及其意义

目的 :研究多药耐药 (mnlti-drugresistance ,MDR)基因胎盘型谷胱甘肽 -S -转移酶 (GST -π)和DNA拓朴酶Ⅱ (TopoⅡ )以及MDR基因编码产物P -糖蛋白 (Pgp)、在咽喉部恶性黑色素瘤中的表达及其意义。方法 :应用链霉素亲生物素 -过氧化物酶标S -P法检测 2 8例咽喉部恶性黑色素瘤中Pgp、GST -π和TopoⅡ的表达 ,分析MDR基因及MDR基因编码产物阳性表达率与肿瘤主要临床病理特征的关系。结果 :2 8例标本中Pgp、GST -π和TopoⅡ的表达率分别为 35 .7%、5 7.1%和 4 6 .4 % ,相互间差异无显著性 (P >0 .0 5 )。Pgp、GST -π和TopoⅡ的表达与性别、年龄、肿瘤大小无明显相关 (P >0 .0 5 ) ,与AJC分级显著相关 (P <0 .0 5 )。结论 :Pgp、GST -π和TopoⅡ等多因素联合作用是咽喉部恶性黑色素瘤多药耐药的主要作用机理 ,其表达在化疗敏感性预测中具有必要性和可行性。     

膀胱移行细胞癌多种耐药因子与凋亡相关因子的表达

目的 探讨多种耐药因子P糖蛋白（Pgp)，谷胱甘肽S转移酶－π（GST-π），DNA拓扑异构酶Ⅱ-α（Topop Ⅱ-α)与调亡蛋白突变p53,bcl-2在原发性膀胱移行细胞癌多药耐药现象形成中的作用。方法 采用免疫组织化学SP法，检测107例原发性膀胱移行细胞癌中Pgp,GST-π，TpopⅡ-α，p53,bcl-2的表达情况。结果 Pgp,GST-π，p53,bcl-2总阳性表达率分别为63.6%,72.9%,72.9%,54.2%,TopoⅡ-α指数Ⅰ-Ⅳ级分别占45.0%,36.3%,12.5%,6.3%;除TopoⅡ-α指数仅与病理分级有关外，其余各指标均与病理分级，临床分期和术后腔内化疗复发密切相关。Pgp表达与p53,bcl-2密切相关，GST－π与p53,bcl-2无相关，TopoⅡ-α指数与p53相关，而与bcl-2无相关。结论 原发性膀胱移行细胞癌多药耐药的形成是多种因素共同作用的结果。     

葡萄籽多酚对多药耐药的逆转作用及其机制

目的：探讨葡萄籽多酚(GSPs)逆转多药耐药的作用及其对多药耐药相关蛋白GSTπ、TopoⅡ α表达的影响。方法：以人乳腺癌MCF-7细胞及其耐药株MCF-7／ADR细胞作为实验对象，用MTT法观察GSPs对多药耐药的逆转作用，免疫细胞化学技术观察GSPs对GSTπ、TopoⅡα等多药耐药相关蛋白表达的影响。结果：GSPs在1．2、2．4mg／L浓度时对细胞无毒性作用，并且均能逆转MCF-7／ADR细胞的多药耐药性，逆转倍数分别为5．77和9．79倍；GSPs可使MCF-7／ADR细胞GSh表达下降，但对TopoⅡ α表达无影响。结论：体外试验证实GSPs具有多药耐药逆转作用，其机制可能与降低肿瘤细胞内GSTπ的表达有关，提示GSPs是一种潜在的肿瘤化疗增敏剂。     

HL60/VCR白血病细胞多药耐药机制的初步探讨

目的探讨白血病细胞产生耐药的机制,以及VEGF在白血病细胞产生耐药过程中的作用。方法采用反复暴露并逐渐提高诱导药物浓度的方法建立HL60/VCR多药耐药细胞系,MTT法检测细胞的耐药性及交叉耐药性;RT-PCR检测诱导前后mdr1、MRP、TopoⅡα、GSTπ和VEGF mRNA的表达情况。结果诱导后的HL60/VCR耐药细胞不仅对VCR高度耐药,对其他类化疗药物亦具有交叉耐药性;与HL60相比,HL60/VCR的mdr1、TopoⅡα和VEGF mRNA的表达明显增强,GSTπmRNA的表达无明显变化;HL60和HL60/VCR均不表达MRP mRNA。结论耐药基因mdr1和TopoⅡα以及VEGF共同参与HL60/VCR多药耐药的形成。     

P-gp、TopoⅡ、GSTπ在胃癌中的表达及临床意义

目的 探讨胃癌组织中耐药基因P-糖蛋白(P-gP)、DNA拓扑异构酶(Topo)Ⅱ和谷胱甘肽转移酶(GST)π的表达以及与胃癌组织学类型、临床分期、淋巴结转移的关系及临床意义.方法 用S-P免疫组化二步法对216例胃癌手术标本进行检测.结果 胃癌组织中P-gp、Topo Ⅱ、GSTπ阳性表达率分别为56.90%、56.90%、60.20%,P-gp表达与胃癌组织学类型和临床分期有关(均P<0.05);Topo Ⅱ表达与胃癌组织学类型、临床分期、淋巴结转移有关(均P<0.05);GSTπ表达与临床分期有关(P<0.05).结论 P-gP、Topo Ⅱ、GST π在胃癌原发性多药耐药中起重要作用.联合检测P-gP、Topo Ⅱ、GSTπ对于胃癌化疗方案选择具有一定的指导意义.     

康莱特联合顺铂高效杀伤骨肉瘤细胞

目的 研究康莱特联合顺铂对骨肉瘤细胞的杀伤作用及其相关机制，探寻骨肉瘤的中西医结合化疗方案。方法 免疫组化及RT—PCR方法检测不同浓度康莱特作用下骨肉瘤OS732细胞的Fas表达，并将康莱特与顺铂单独及联合应用于OS732细胞，采用MTT法检测细胞毒性作用，流式细胞仪定量分析凋亡细胞所占比例，相差显微镜及荧光显微镜下观察凋亡细胞形态改变。结果 康莱特可上调OS732细胞的Fas表达并诱导凋亡，10μL／mL康莱特与1μg／mL顺铂合用于OS732细胞的抑制率与各自单用时相比明显提升（P〈0．01）。细胞形态观察及凋亡率测定也显示，康莱特与顺铂联用可诱导更多OS732细胞凋亡。结论 康莱特可协同顺铂高效杀伤骨肉瘤细胞，这可能与康莱特上调Fas表达诱导骨肉瘤细胞凋亡有关。     

盐酸千金藤碱逆转MCF-7/ADR细胞多药耐药性的作用及其机制

目的研究盐酸千金藤碱(CH)对人乳腺上皮细胞癌耐药细胞株MCF-7/阿霉素(ADR)多药耐药性的体外逆转作用,并探讨其逆转机制。方法用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测CH对多药耐药肿瘤细胞MCF-7/ADR的耐药逆转活性;免疫组织化学法检测细胞内谷胱甘肽硫转移酶π(GST-π)的表达;通过对超螺旋PBR322 DNA的解旋能力检测拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)的活性。结果 CH在无细胞毒浓度下具有逆转MCF-7/ADR细胞耐药性的作用,逆转倍数为13.5倍,但对敏感株MCF-7细胞的抗癌药物敏感性基本无影响。CH4μmol/L使MCF-7/ADR细胞中过度表达的GST-π的表达水平下降及DNA TopoⅡ的催化活性提高,但对敏感株MCF-7细胞无影响。结论 CH具有逆转多药耐药性的作用,其机制可能与降低GST-π的表达及提高DNA TopoⅡ的活性有关。     

甲诺孕酮和屈洛昔芬对K562／AO2细胞株多种耐药机制的调节(摘要)

研究甲诺孕酮 (NOM )和屈洛昔芬 (DRO)对K5 6 2 /AO2细胞株耐药基因mdrⅠ、谷胱甘肽S 转移酶 (GSTπ)、拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)和多药耐药相关蛋白 (MRP)的调节。 方法　应用细胞培养技术 ,采用MTT比色法、免疫组织化学、逆转录 聚合酶连反应和流式细胞术分析。结果　NOM和DRO均可明显提高K5 6 2 /AO2细胞株对阿霉素 (ADM)的敏感性 ,增加细胞内ADM和累量。可显著下调mdrⅠ、GSTπ的mRNA和蛋白表达 ,明显上调TopoⅡα基因表达。K5 6 2敏感株的GSTπ基因表达同样被抑制。都具有明显的时间依赖性。MRP基因表达的变化差异无统计学意义。结论　NOM和DRO可明显逆转K5 6 2 /AO2细胞株对ADM的耐药性。NOM与异搏定逆转强度相似 ;两药对mdrⅠ、GSTπ和TopoⅡα基因表达均有明显调节作用。调节呈时间依赖性。     

γ干扰素上调Fas表达诱导骨肉瘤细胞凋亡的研究

目的探讨γ干扰素(IFN-γ)对骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用及其相关机制。方法将IFN-γ应用于体外培养的骨肉瘤OS732细胞,采用MTT法检测细胞毒性作用,流式细胞仪定量分析凋亡细胞所占比例,倒置相差显微镜、荧光显微镜下观察凋亡细胞形态改变。并采用免疫细胞化学及RT-PCR方法检测不同浓度IFN-γ作用下OS732细胞的Fas表达。结果IFN-γ对OS732有显著抑制作用,细胞形态观察及凋亡率测定也显示,IFN-γ可诱导骨肉瘤细胞凋亡;IFN-γ可上调OS732细胞的Fas表达,且调节作用呈浓度依赖性(P<0.01)。结论IFN-γ可诱导OS732细胞凋亡,这可能与其上调OS732细胞的Fas表达有关。     

加温与α—干扰素、维拉帕米联合对乳腺癌耐药逆转作用的研究

目的：研究42．5℃高温与α－干扰素、维拉帕米联合对体外培养的乳腺癌细胞多药耐药的逆转作用。方法：MTT法检测各实验组细胞存活率，计算IC50、耐药倍数和逆转倍数；RT－PCR测定细胞内多药耐药MDR1基因及GST－π基因表达；流式细胞术定量检测细胞表面P170的表达。结果：α－干扰素与维拉帕米联合应用使耐阿霉素（ADM）的IC50降低为0．32μmol/L，优于单用维拉帕米（1．23μmol/L）、α－干扰素（2．29μmol/L），而加温至42．5℃与α－干扰素、维拉帕米联合效果更佳，ADM的IC50由16．6μmol/L降至0．02μmol/L；H－E染色观察细胞形态学无明显变化；各实验组RT－PCR测定仍有MDR1和GST－π的基因表达；但P170表达均有大幅度下降。结论：单独用α－干扰素、维拉帕米、加温至42．5℃均可达到部分逆转耐药的作用，三联合使用能完全逆转乳腺癌耐药细胞（MCF－7／ADR）对ADM的耐药。     

大肠癌LoVo/Adr细胞多药耐药性与谷胱甘肽S-转移酶关系的研究

目的 阿霉素诱导大肠癌LoVo细胞产生耐药性的同时观察谷胱甘肽S-转移酶活性和含量的变化，探讨其与耐药的关系。方法 采用阿霉素浓度递增法诱导耐药；采用MTT、法检测耐药性；GST-π检测采用免疫组化染色；谷胱甘肽S-转移酶活性测定采用1氯-2，4-二硝基苯法。结果 建立了人大肠癌多药耐药LoVo／Adr细胞株；LoVo／Adr细胞GST-Ⅱ蛋白表达显著高于LoVo细胞；LoVo／Adr细胞与LoVo细胞GST活性相比，没有显著差异。结论 耐药的LoVo／Adr细胞株其耐药机制与GST有关。     

胃、大肠癌COX-2和多药耐药相关因子表达与体外化疗药敏性的关系及意义

目的 探讨胃、大肠癌细胞环氧合酶-2(COX-2)、多药耐药相关因子(P-gp、GST-π,TopoⅡα)表达与体外化疗药敏性的关系及临床意义.方法 84例胃癌、大肠癌标本采用免疫组化染色法检测COX-2、P-gp、GST-π、TopoⅡα的表达,进行MTT法体外化疗药物敏感性实验,分析4种因子表达与9种化疗药物对肿瘤细胞抑制率的关系.结果 肿瘤COX-2、P-gp、GST-π、TopoⅡα强表达率分别为48.8%、76.2%、78.6%、66.7%;COX-2与P-gp、COX-2与TopoⅡα之间表达具有正相关性(r=0.287,0.256,P均＜0.05).在各因子表达程度与药物对肿瘤细胞抑制率的关系中,COX-2强表达时,紫杉醇(PTX)、表阿霉素(eADM)、羟基喜树碱(OPT)对肿瘤细胞的抑制率降低(t=2.21、3.11、2.09;P均＜0.05);P-gp强表达组PTX、奥沙利铂(OXA)、顺铂(DDP)对肿瘤细胞的抑制率低于弱表达组(t=2.54、2.47、2.05,P均＜0.05),GST-π强表达与5-氟尿嘧啶(5-Fu)对肿瘤细胞的抑制率降低有关(t=2.13,P＜0.05),TopoⅡα强表达时,长春新碱(VCR)、PTX、eADM对肿瘤细胞的抑制率升高(t=-2.29、-2.12、-2.26;P均＜0.05).结论 COX-2在胃、大肠癌多药耐药中起一定的作用;COX-2、P-gp、GST-π、TopoⅡα各自表达程度仅与部分化疗药物耐药性有关;胃、大肠癌对化疗药物的耐药性与多种机制有关,仅检测部分多药耐药相关因子的表达不能准确预测化疗药敏性.     

氧化砷对MR2细胞耐药分子表达的影响

目的:探讨三氧化二砷(As_2O_3)对肿瘤耐药分子的作用。方法:以耐全反式维甲酸(ATRA)早幼粒白血病细胞株MR_2为研究对象,以非耐药急性早幼粒白血病细胞株NB_4为对照组,用免疫组化法观察P-糖蛋白(Pgp)、谷胱甘肽S转移酶(GST)的表达。结果:MR_2细胞Pgp表达(30％～40％)较NB_4细胞(10％～20％)明显增强(P<0.001),MR_2细胞GSTπ表达(60.4±4.0)～(66.5±4.4)较NB_4细胞(28.3±5.6)～(31.2±5.1)明显增强(P<0.05)。0.5～2.0μmol/L As_2O_3能显著降低MR_2细胞Pgp、GSTπ表达,而对GSTα、GSTμ无影响。结论:Pgp、GSTπ表达的下调,可能是As_2O_3克服耐药的敏感性指标,而GSTα、GSTμ则否。全反式维甲酸(ATRA)可能是Pgp转运底物和GSTπ催化作用底物。     

消化道恶性肿瘤组织中P糖蛋白、DNA拓扑异构酶Ⅱ及谷胱甘肽转移酶π亚型的表达

目的:检测P糖蛋白(P-gp)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)和谷胱甘肽转移酶π亚型(GSTπ)在消化道恶性肿瘤组织中的表达,并初步探讨其临床意义.方法:用免疫组化法检测P-gp、TopoⅡ和GSTπ在47例消化道恶性肿瘤(食管癌15例,胃癌12例,结直肠癌15例,肝癌4例,胆囊癌1例)组织中的表达,并对其与病理参数的关系进行了研究.结果:(1)在食管癌、胃癌及结直肠癌组织中,P-gp表达阳性率分别为0、16.7％和66.7％;TopoⅡ表达阳性率分别为86.7％、91.7％和100％;GSTπ表达阳性率分别为20.0％、25.0％和48.9％.(3)P-gp和GSTπ表达有明显相关性(r=0.979,P<0.05).(2)P-gp和GSTπ表达的阳性率在胃癌肠型与弥漫型、高和中分化型腺癌与低分化型腺癌之间均无统计学差异(P>0.05);而结直肠癌高分化型腺癌组织中P-gp的表达阳性率显著高于中分化型腺癌(P<0.05).结论:P-gp、TopoⅡ与GSTπ在食管癌和胃癌的多药耐药表型中的作用有限;结直肠癌的耐药表型与P-gp表达密切相关.     

四种耐药基因蛋白及Ki-67在浸润性乳腺癌组织中表达的临床意义

目的:探讨Pgp、TS、GST-π、TopoⅡ和Ki-67在浸润性乳腺癌组织中的表达,并探讨其临床意义。方法:采用免疫组织化学Envision法检测267例乳腺癌患者Pgp、TS、GST-π、TopoⅡ和Ki-67的表达,分析它们与患者的临床病理特征的相关性。结果:乳腺癌患者Ki-67增殖指数为:27.73%±21.85%,Pgp、TS、GST-π、TopoⅡ的阳性率分别为69.29%、64.04%、23.60%、29.21%;Ki-67与肿块直径、ER、PR具有相关性;Pgp与肿块大小具有相关性;GST-π、TopoⅡ与ER、PR具有相关性;Pgp与TS、GST-π呈正相关性,TopoⅡ与TS呈负相关性,与Ki-67呈正相关性。结论:Pgp、TS、GST-π、TopoⅡ及Ki-67在乳腺癌的表达中存在一定的相关性,联合上述指标检测对乳腺癌患者的临床诊疗及预后具有重要意义。     

R-型维拉帕米逆转肿瘤细胞多药耐药的实验研究

目的 :检测 R-型维拉帕米 (R- Verapamil)体外逆转肿瘤细胞多药耐药的作用及动物毒性 ,探讨 R-型维拉帕米成为未来化疗增敏剂的可能性。　方法 :细胞毒性的测定用 MTT法 ,细胞内阿霉素积蓄的测定用荧光分光光度法。动物毒性试验用 BAL B/ c小鼠腹腔注射法。　结果 :1 .2 5 μm ol/ L 的 R-型维拉帕米即可显著增加耐药 KBv2 0 0细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性 (P<0 .0 1 ) ,其效应与作用浓度有关。在增敏和增加细胞内阿霉素积蓄方面 ,R-型维拉帕米与混旋维拉帕米效果一样 ,但 R-型维拉帕米的动物毒性低于混旋维拉帕米。　结论 :1 .2 5 μm ol/ L 的R-型维拉帕米能部分逆转耐药 KBv2 0 0细胞的多药耐药性。此浓度能被人体所接受。R-型维拉帕米有望成为未来的化疗增敏剂     

人宫颈癌顺铂耐药细胞系SiHa/cDDP的建立

目的建立人宫颈癌SiHa细胞对顺铂(cDDP)的耐药细胞系并分析其生物学特性。方法用化疗药物cDDP与人宫颈癌细胞系SiHa共培养,逐步增加培养液中cDDP浓度以诱导细胞产生耐药性,建立SiHa细胞对cDDP的耐药细胞系。利用MTT法绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间并检测肿瘤细胞耐药指数(RI)。免疫细胞化学法检测细胞P-糖蛋白(P-gp)、胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-π)、拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)蛋白的表达。结果成功建立耐药细胞系SiHa/cDDP(耐cDDP 2μg/mL),倍增时间(45.82±3.69)h,对cDDP的RI为16.131,对多种化疗药物有不同程度交叉耐药。耐药细胞P-gp、GST-π表达较亲代细胞增多(P<0.01),TopoⅡ表达与亲代细胞间差异无统计学意义。结论本研究建立了人宫颈癌顺铂耐药细胞系SiHa/cDDP,为肿瘤细胞体外研究提供了理想的实验模型。     

急性白血病患者GSTπ、TopoⅡα和p170表达及临床意义

目的　探讨急性白血病 (AL)患者谷胱甘肽 S 转移酶π(GSTπ) ,DNA拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)及P糖蛋白(p170 )的表达及临床意义。方法　采用免疫组化S P法检测 94例AL患者白血病细胞中GSTπ、TopoⅡα和p170表达的阳性率。结果　GSTπ、TopoⅡα和 p170在ANLL中的初治组 (A组 )及复发或难治组 (B组 )中的阳性率分别为2 2 0 %、43 2 %、2 2 0 %及 5 0 0 %、5 0 0 %、46 7% ;三者在ALLA组及B组的阳性率分别为 4 3%、0、18 2 %及30 0 %、18 2 %、30 0 %。GSTл阳性、TopoⅡα阴性、p170阳性AL患者完全缓解率 (CR)与GSTπ阴性、TopoⅡα阳性、p170阴性的CR率分别为 2 5 0 %、75 0 %、38 5 %及81 8%、37 5 %、84 2 %。除TopoⅡα外 ,耐药因子阳性患者的CR率低于阴性患者 (P <0 0 1及 0 0 5 )。相关分析显示GSTπ与p170之间密切正相关 (r =0 6 4,P <0 0 1)。结论　GSTπ、p170过度表达与AL患者的化疗疗效及预后密切相关 ,且GSTπ与 p170过度表达密切正相关。