白介素13与白喉毒素融合蛋白靶向治疗活性的研究

目的 研究白介素13与白喉毒素融合蛋白DT389-hIL13-13E13K对神经胶质瘤的靶向杀伤作用,为神经胶质瘤的无创性治疗和常规化疗的替代或补充治疗提供新的途径.方法 通过诱导已构建的融合蛋白表达质粒,原核表达并获得IL-13与白喉毒素融合蛋白DT389-hIL13-13E13K.分别通过两种不同方法 提纯后,用体内外实验研究不同浓度融合蛋白对神经胶质瘤的靶向杀伤活性.结果 所得融合蛋白浓度纯度均达到95%以上.在体外活性实验中,两种复性纯化方法 获得的融合蛋白DT389-hIL1-13E13K对神经胶质瘤均有很好的杀伤效果,半数抑制浓度(IC50)分别达到6×10-10moL/L和1×10-8mol/L,杀伤效果达到了国际水平.体内活性测定结果 显示,融合蛋白DT389-hIL13-13E13K对神经胶质瘤有一定的抑制作用,但效果并未达到使肿瘤完全消退的水平.结论 得到了在体内外都对神经胶质瘤有抑制杀伤作用的特异的靶向治疗融合蛋白.     

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( ) 中,构建重组表达质粒pET28a( )-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a( )中,构建了表达质粒pET28a( )-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.     

新型重组毒素hIL15M/TNFαM的构建、表达与活性测定

目的　构建、表达hIL15M TNFαM融合毒素 ,为研制可消除hIL15受体高表达细胞的特异性导向药物奠定基础。方法　人白介素 15突变体 (hIL15M)对靶细胞不具有激动作用 ,将该突变体与TNFα突变体 (TNFαM)编码基因直接融合克隆至pET表达载体 ,并纯化出融合蛋白hIL15M TNFαM ,MTT法测定该蛋白的细胞毒活性。结果　SDS PAGE分析表明 ,重组菌株诱导后可以表达出 3 0× 10 3与预期大小一致的特异蛋白带。纯化的hIL15M TNFαM对PHA激活的T细胞的杀伤作用是静止性T细胞的 13倍。结论　hIL15M TNFαM融合蛋白对高表达hIL15受体的细胞具有较强的杀伤性作用 ,提示其对由活化的异常T细胞增多所致的疾病具有潜在的治疗作用。     

人类可溶性TNFR I—GFP融合蛋白重组体的构建、表达和特性分析

目的 构建并表达hsTNFRI(human soluble tumor necrosis facto receptorI)—GFP(green fluorescence protein)—pET28a融合蛋白，用以检测跨膜型TNF—α(mTNF—α)。方法用PCR从GFP—pKEN重组质粒中扩增GFP的cDNA，将其插入hsTNFRI—pET28a重组质粒中hsTNFRI基因片段的下游，获得hsTNFRI—GFP—pET28a重组体。转化大肠杆菌BL—2l，用IPTG诱导重组蛋白表达，经镍金属螯合层析柱纯化。用MTT法检测重组融合蛋白对sTNF—α细胞毒效应的抑制活性，并用重组融合蛋白直接对转染TNF基因细胞表面的mTNF—α进行定性检测。结果 hsTNFRI—GFP重组融合蛋白可明显抑制RTNF—α细胞毒效应，且呈剂量依赖性；该融合蛋白不但可与NIH3T3细胞膜上鼠源性mTNF-α结合，而且也可与转基因NIH3T3细胞表面人mTNF—α结合。结论 hsTNFRI—GFP重组融合蛋白具有TN—FR的生物学活性，同时保留GFP的发光特性，可用来检测细胞表达mTNF—α的水平。     

新型重组毒素hIL15M/TNFαM的构建、表达与活性测定

目的构建、表达hlL15M/TNFαM融合毒素,为研制可消除hIL15受体高表达细胞的特异性导向药物奠定基础.方法人白介素15突变体(hIL15M)对靶细胞不具有激动作用,将该突变体与TNFα突变体(TNFαM)编码基因直接融合克隆至pET表达载体,并纯化出融合蛋白hIL15M/TNFαM,MTr法测定该蛋白的细胞毒活性.结果SDS-PAGE分析表明,重组菌株诱导后可以表达出30×103与预期大小一致的特异蛋白带.纯化的hIL15M/TNFαM对PHA激活的T细胞的杀伤作用是静止性T细胞的13倍.结论hIL15M/TNFαM融合蛋白对高表达hiL15受体的细胞具有较强的杀伤性作用,提示其对由活化的异常T细胞增多所致的疾病具有潜在的治疗作用.     

人BTC蛋白表达及生物学活性鉴定

目的获得大量具有生物活性的人成熟β细胞素(BTC)蛋白。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,PCR扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列,并按读框克隆入原核细胞表达载体pET32a( )中,构建重组质粒pET32a( )-hBTC。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导及亲和层析法纯化获得融合蛋白,运用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。以不同浓度BTC连续5 d作用于NIH3T3细胞,MTT比色法检测细胞增殖能力。结果融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中,其作用于NIH3T3细胞可明显促进细胞增殖。结论人成熟BTC蛋白在pET32a( )表达系统中得到高效表达,所纯化蛋白具有促进NIH3T3细胞体外增殖的作用。     

人BTC蛋白表达及生物学活性鉴定

目的 获得大量具有生物活性的人成熟β细胞素(BTC)蛋白.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,PCR扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列,并按读框克隆入原核细胞表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-hBTC.重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导及亲和层析法纯化获得融合蛋白,运用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.以不同浓度BTC连续5 d作用于NIH3T3细胞,MTT比色法检测细胞增殖能力.结果 融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中,其作用于NIH3T3细胞可明显促进细胞增殖.结论 人成熟BTC蛋白在pET32a(+)表达系统中得到高效表达,所纯化蛋白具有促进NIH3T3细胞体外增殖的作用.     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

人可溶性CD40L表达及其生物学活性初步分析

目的将已构建好的重组表达质粒pET28a -sCD40L进行优化条件表达,并将其目的蛋白纯化,对目的蛋白进行初步的活性分析.方法利用已构建好的重组表达质粒pET28a -sCD40L进行目的蛋白的表达,优化表达的条件,利用Western-blot鉴定目的蛋白,在最适条件下进行目的蛋白的表达,利用Ni2 -NTA柱纯化目的蛋白,MTT法检测重组蛋白对人外周血淋巴细胞增殖活性的影响.结果利用 Ni2 -NTA柱将目的蛋白进行了分离纯化,且纯化的重组蛋白具有刺激人外周血淋巴细胞的增殖.结论成功优化了重组表达质粒pET28a -sCD40L的表达条件,生物学活性的初步分析显示Ni2 -NTA柱纯化的重组蛋白具有刺激人外周血淋巴细胞增殖活性.     

血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-HO-1的制备及在大鼠H9c2心肌细胞的转导

目的:制备血红素加氧酶-1(HO-1)融合蛋白PEP-1-HO-1,观察融合蛋白在大鼠H9c2心肌细胞的转导。方法:设计合成hHO-1 PCR引物,扩增hHO-1 cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒pET15b-PEP-1进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;将测序和鉴定结果正确的重组质粒转化宿主菌Rosetta(DE3)pLysS,诱导表达融合蛋白PEP-1-HO-1,利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)进行亲和层析纯化融合蛋白;SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行定性检测,Bradford法定量检测纯化后蛋白;融合蛋白孵育大鼠H9c2心肌细胞,免疫组化法观察融合蛋白在H9c2细胞的转导和分布,分光度法检测蛋白转导后的活性。结果:hHO-1 cDNA与pET15b-PEP-1重组成功,重组质粒pET15b-PEP-1-hHO-1经酶切鉴定含有hHO-1 cDNA,测序分析证实与GenBank提供的原始序列完全一致;重组质粒转化后经诱导和纯化得到了融合蛋白PEP-1-HO-1,浓度达到1.0 g/L;融合蛋白可以穿透H9c2心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论:成功地构建了pET15b-PEP-1-hHO-1原核表达质粒,获得了可穿透H9c2心肌细胞膜的血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-HO-1,为应用HO-1治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。     

人白介素-12植物表达载体的构建

目的:构建人白介素-12(hIL-12)基因的植物表达载体.方法:采用PCR技术从质粒pCA13-hIL-12中扩增hIL-12基因,SmaI, SacI分别酶切hIL-12基因和植物表达载体pBI121,回收,T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121-hIL-12,双酶切和DNA测序鉴定后,通过三亲杂交法将表达载体pBI121-hIL-12分别导入根癌农杆菌EHA105和GV3101,用PCR法进行鉴定.结果:双酶切及DNA序列测定证实hIL-12已插入到表达载体pBI121中,PCR 扩增表明构建的重组表达载体pBI121-hIL-12成功转入根癌农杆菌EHA105和GV3101中.结论:成功构建了植物表达载体pBI121-hIL-12,为进一步利用转基因植物生产hIL-12奠定了实验基础.     

人宫颈癌Ca Ski 细胞 IL-24基因的克隆鉴定与真核表达

目的:克隆人IL-24基因并构建真核表达载体,转染Ca Ski细胞进行真核表达.方法:利用RT-PCR技术扩增出Ca Ski细胞中的IL-24基因.将IL-24基因克隆人pcDN3.1( )中,构建真核表达质粒pcDN3.1( )-hIL-24的表达.结果:PCR及测字结果均证实在功克隆了人IL-24,该质粒被转染人Ca Ski细胞中能表达出hIL-24蛋白.结论:成功构建了hIL-24基因的真核表达载体.     

阳离子脂质体介导的hIL-12基因在COS-7细胞中的表达

目的 观察hIL-12基因在COS-7细胞中的表达。方法 阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000将质粒pCA13-hIL-12转入COS-7细胞,PCR法检测基因转染,ELISA法检测hIL-12的表达。结果 hIL-12基因成功导入COS-7细胞,并且在COS-7细胞中获得表达。结论hIL-12可以在COS-7细胞中获得表达。     

重组免疫毒素hlL-2-Luffin P1的构建及表达

目的构建人分泌型IL-2与免疫毒素Luffin P1的重组基因原核表达载体,并对其产物进行鉴定及纯化.方法采用基因工程原理,将IL-2-Luffin P1的重组基因片段克隆入表达载体pET20b( )中,经酶切及DNA序列测定鉴定正确,转化表达宿主菌Origami(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达含His标签的融合蛋白-重组免疫毒素hlL-2-Luffin P1.结果成功构建了免疫毒素表达载体pET20b( )-hIL-2-Luffin P1,获得纯化的重组免疫毒素,并经Western blot鉴定正确.结论hIL-2-Luffin P1的成功构建,为进一步研究它在抗移植排斥中的作用奠定了基础.     

人白介素24基因诱导人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的实验研究

目的:研究人白介素24(hIL-24)在体外诱导宫颈癌Ca Ski细胞凋亡及其作用机制.方法:①以脂质体包裹重组真核表达质粒pcDNA3.1( )-hIL-24转染Ca Ski细胞; ②利用RT-PCR技术检测处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平变化; ③ Western Blot分析处理后Ca Ski细胞中抑癌蛋白P53水平的变化; ④流式细胞仪分析处理后的Ca Ski细胞凋亡情况.结果:处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平下降,抑癌蛋白P53水平增加,细胞凋亡率升高.结论:真核表达载体介导的hIL-24基因体外转染宫颈癌Ca Ski细胞后,能抑制Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的表达,使抑癌蛋白P53恢复活性,促使宫颈癌Ca Ski细胞凋亡.     

特异性结合血管内皮生长因子受体2的融合毒素

目的 制备特异性结合血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）的融合蛋白．阻断新生肿瘤血管内皮细胞和某些VEGFR-2阳性肿瘤细胞内的蛋白合成，引起细胞死亡。方法运用基因定点突变技术．制成VEGF D63A、E64A、E67A突变体。利用这个可以和VEGFR-2特异性结合的VEGF突变体．代替白喉毒素上的受体结合区，制成了特异性结合VEGFR-2的融合蛋白。结果以去除了受体结合区的DTS91作为对照．以VEGFR-2阳性肿瘤细胞做实验，验证了这个融合毒素对VEGFR-2阳性细胞的选择性杀伤作用。结论制备了特异性杀伤血管内皮生长因子受体2阳性细胞的融合毒素。     

人肌纤生成调节因子1融合蛋白在大肠杆菌的表达和抗体制备

目的研究人肌纤生成调节因子1(MR-1)的表达,获得MR-1蛋白,制备MR-1抗体,为MR-1生物功能研究提供基础.方法利用大肠杆菌质粒pGEX-5X-1、pET30a( )及pET24a( ),分别构建MR-1及其两端与不同标签序列融合的表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中比较N端和/或C端融合标签序列对该基因表达的影响.通过凝胶蛋白电泳及电洗脱制备目的蛋白,免疫家兔.酶联免疫吸咐试验(ELISA)和Western b1ot检测所制备抗体的滴度和免疫原性.结果利用GST或T7-tag序列在其N端融合,使MR-1在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到表达.利用所表达获得的MR-1-T融合蛋白,制备了针对此蛋白的多克隆抗体.ELISA检测所制备抗体滴度达到1:105,Western hlot显示所制备的多克隆抗体可用于检测天然细胞中的MR-1蛋白.结论MR-1蛋白需在N端与GST或T7-tag序列融合方可实现表达.利用在大肠杆菌表达纯化的蛋白所制备的抗体可用于MR-1生物学功能的研究.     

重组人sCD40L功能性片段在大肠杆菌中的表达

目的 克隆sCD40L功能性片段(E107-L261)基因并在大肠杆菌体系进行表达。方法 从CD40L胞外段全长基因通过PCR方法扩增出sCD40L功能性片段(E107-L261)的基因，并在其N端融合6个组氨酸(His)；经PCR、酶以及DNA测序证实；将融合得到的sCD401L基因插入pET30a表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)表达体系进行诱导表达。结果 构建了pET30a-sCl340L原核表达载体；将转化菌BL21(DE3)诱导表达后经SDS-PAGE电泳以及Western Blotting鉴定显示在18kd处有sCD40L功能性片段(E107-L261)的高效表达。结论 sC1340L功能性片段基因的克隆及其表达为进一步研制其同源三聚体形式的功能性重组蛋白奠定了基础。     

Stx2A-LHRH重组质粒的构建及分析

目的 :表达志贺毒素 2 A-黄体生成激素释放激素 ( Stx2 A- LHRH)重组毒素 ,探讨其是否具有特异杀伤癌细胞的可能性。方法 :用 PCR方法扩增带有 Nco 和 Eco R 酶切位点的 Stx2 A-LHRH DNA基因 ,克隆至 p ET- 2 0 b( + )质粒中 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,挑取单菌落培养 ,提取质粒、酶切。结果 :经鉴定、测序 ,获得重组质粒 p ET2 0 - SL。结论 :利用分子生物学技术成功地构建了带有 Stx2 A- LHRH重组毒素基因的质粒 ,使其表达 Stx2 A- LHRH重组毒素成为可能 ,为进一步研究导向药物奠定了基础。