干扰素α-8与乙型肝炎病毒-S2S融合基因真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建干扰素α-8(IFNα-8)与乙型肝炎(HB)病毒(HBV)-S2S融合蛋白的真核表达质粒pVAXl／IFNα-8-S2S，作为一种高效能HBDNA疫苗的备选对象。方法：以特定引物分别从正常胎肝组织及HB患者血清中扩增出IFNα-8与HBV—S2S基因片段，克隆至相应载体。再以连接引物扩增出IFNα-8与HBV-S2S融合基因片段，并将该基因片段克隆至真核细胞表达载体pVAXl，然后扩增目的基因测序，确认无误后，转染SP2／0细胞，并分别检测目的基因mRNA，了解其短暂表达与稳定表达情况。结果：所构建的质粒经过酶切电泳后证实分子量与预期相符，目的片断IFNα-8-S1S经测序证实IFNα-8序列与Genebank公布的序列相符。HBV-S2S存在3处三联密码子的无义突变。2处有义突变是703～705位CCG突变为CAG，799～801位ATA突变为ATG。表达质粒转染SP2／0细胞后，均检测到短暂表达及稳定表达之目的基因mRNA。结论；经分析表明，HBV-S2S片段存在的两处有义突变并不影响该蛋白的空间构象及关键抗原决定簇的性质。可以认为本研究完成了真核表达质粒pVAXl／IFNα-8-S2S的构建，并成功检测到目的基因的表达，为制造高效能HBDNA疫苗提供了新的备选对象。     

preS2S/adw真核表达质粒构建及其表达的初步研究

目的：针对我国乙型肝炎（乙肝）病毒流行的血清型，采用美国药品及食物鉴定委员会承认的应用于疫苗临床使用的载体pVAX1，构建了肝病毒adw血清型核酸疫苗preS2S的真核表达质粒，对其在真核细胞中的表达进行初步研究。方法：采用PCR法扩增preS2S片段，插入pVAX1载体中，测定DNA序列后，转染SP2／0细胞，抽提转染后SP2／0细胞的总RNA，再用RT－PCR法扩增其中的preS2S片段，以检测其表达的基础，结果：测序证实了该片段为乙肝病毒adw型preS2S基因。PCR扩增法检测出的转染细胞中存在preS2S基因，结论：获得了adw血清型乙肝病毒preS2S的真核表达质粒，提示其能够在真核细胞中表达目的基因蛋白。     

胸腺素及干扰素基因表达对乙型肝炎基因疫苗的免疫增强效应

目的观察胸腺素及干扰素基因表达对乙型肝炎基因疫苗pVAX1-S2S的免疫增强效应。方法从乙型肝炎患者血清中扩增S2S基因，构建表达质粒PVAX1—S2S。从成人外周血白细胞总RNA中，逆转录聚合酶链反应扩增干扰素α基因Ⅰ，将其与S2S相连接，构建重组表达质粒PVAX1—I／S2S；将干扰素α基因Ⅰ与人工合成的胸腺素α基因T相连接，构建重组表达质粒pVAX—T／I。将上述表达质粒分组肌肉接种BALB／c小鼠：单独免疫组接种pVAX1-S2S 100μg；联合免疫组1：接种pVAX1—I／S2S 100μg；联合免疫组2：每只小鼠同时接种pVAX1—T／I与pVAX1-S2S各50μg。上述各组于2、4周后分别加强免疫1次。然后动态检测小鼠血清抗-HBS和前S2抗体。结果接种后3、5、8周，小鼠血清抗-HBS阳转率：联合免疫组1分别为12．5％、12．5％、62．5％；联合免疫组2分别为25％、50％、50％，二者总体上均优于pVAX1—S2S单独免疫组。联合免疫组2的前S2抗体水平则高于其它两组。结论胸腺素α1和(或)干扰素α8基因的表达具有分子免疫佐剂的效应，能够增强乙型肝炎基因疫苗的特异性体液免疫诱生效力。     

弓形虫表面抗原SAG1 DNA疫苗的构建

目的　构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法　采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVAX1,构建重组真核表达质粒pVAX1-SAG1,并予菌落PCR和双酶切鉴定。以此为疫苗候选分子免疫小鼠 ,检测其诱导产生的抗体。结果　PCR扩增出SAG1基因的截短型片段 ,其大小约 780bp ;测序的阳性TA克隆除两处发生同义突变外 ,其余序列与原序列一致 ;TA克隆的插入片段被亚克隆到真核表达载体 pVAX1,构建了重组表达质粒pVAX1-SAG1;该质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。 结论　成功构建了弓形虫表面抗原SAG1的DNA疫苗。     

弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒。方法设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAC而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况。结果PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达。结论成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8。     

弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4的构建

目的构建弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。方法根据弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因序列分别设计一对特异引物(分别含有HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ内切酶位点),PCR扩增目的基因,并将这两段基因分别克隆至PEGM-T Easy载体,经菌落PCR和双酶切鉴定;用HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ分别双酶切PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4和pVAX1,得到含内切酶位点的SAG1和SAG4基因片段,分别与pVAX1连接,构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4真核表达质粒,经菌落PCR和双酶切鉴定。结果PCR扩增得到目的基因SAG1和SAG4,测序结果分别与弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因比较,符合率均为100%。构建PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4克隆质粒和pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,分别经菌落PCR和双酶切鉴定,显示722bp的SAG1基因片段和511bp的SAG4基因片段均插入载体PEGM-T Easy和pVAX1中。结论成功克隆了pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,为弓形虫基因疫苗应用研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌glmM DNA重组质粒的构建及体外表达

目的构建幽门螺杆菌(Hp)pVAX1-glmMDNA重组质粒,体外转染SGC-7901细胞并鉴定其表达蛋白的抗原性。方法RT-PCR方法从国际标准株NCTC11637中获取glmM全长基因,克隆插入T载体。测序后经酶切、连接反应将glmM的开放读码框架定向克隆入真核表达载体pVAX1,酶切初步鉴定后测序确认。通过脂质体法将pVAX1-glmMDNA重组质粒转染SGC-7901细胞,检测其转染效率,确定转染成功后RT-PCR法检测glmM在转录水平的表达,ELISA法鉴定表达蛋白的抗原性。结果DNA测序结果显示扩增出的glmM全长基因与GenBank公布的HpglmM序列有96%的同源性。PCR、酶切和测序结果证实glmM目的基因成功克隆入真核表达载体pVAX1。重组质粒转染的细胞经RT-PCR扩增获得1.4kb片段,与目的基因大小相符。ELISA结果显示重组质粒转染细胞的超声破碎物及培养上清液中抗原的滴度比对照组高2倍以上。结论成功构建了pVAX1-glmMDNA重组质粒,其表达蛋白具有良好的抗原性,为进一步研究其抗Hp感染的效果及制备相应有效DNA疫苗奠定基础。     

HBsAg、HSV-2gD双抗原真核表达载体的构建

目的利用简并引物PCR法及重叠PCR法构建HBsAg(S),HSV-2gD模拟抗原表位P6及天然抗原表位NP6,IL-18真核表达载体,并对其表达能力进行鉴定,为后期疫苗的研制奠定基础。方法采用简并引物PCR法扩增IL-18-P6(包括P6-IL-18)片段及IL-18-NP6(包括NP6-IL-18);根据GenBank(FJ589066.1)公布的S基因设计引物,扩增获得含有重叠区的S片段(包括S1,S2,S3,S4);采用重叠PCR法扩增三基因融合片段IL-18-P6-S,IL-18-NP6-S,S-P6-IL-18和S-NP6-IL-18,经纯化回收后将其克隆到原核载体pMD 18-T simple vector中,测序正确的目的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建重组质粒pcDNA3.1-IL-18-P6-S,pcDNA3.1-IL-18-NP6-S,pcDNA3.1-S-P6-IL-18和pcD-NA3.1-S-NP6-IL-18,采用间接免疫荧光法检测靶基因的表达情况。结果成功构建了含有双抗原的真核表达载体pcDNA3.1-IL-18-P6-S,pcDNA3.1-IL-18-NP6-S,pcDNA3.1-S-P6-IL-18和pcDNA3.1-S-NP6-IL-18。脂质体介导真核表达载体转染CHO细胞,间接免疫荧光法检测细胞浆中有黄绿色荧光。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-IL-18-P6-S,pcDNA3.1-IL-18-NP6-S,pcDNA3.1-S-P6-IL-18和pcDNA3.1-S-NP6-IL-18能在CHO细胞中有效表达。     

仙台病毒HN基因核酸疫苗的构建及表达

用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)从仙台病毒cDNA中扩增出HN全长序列片段,构建HN基因的真核表达载体pVAX1-HN,用PCR法、酶切进行鉴定.将重组质粒用脂质体法转染至COS 7细胞,用流式细胞术检测抗原蛋白表达,RT-PCR法检测HN基因mRNA表达情况.发现经PCR法和酶切鉴定,目的 片段大小与预期相符,经测序目的 基因序列与GenBank公布结果一致.转染后抗原蛋白表达达到68.3%,明显高于转染前(P＜0.01),HN基因mRNA明显表达.提示成功构建核酸疫苗pVAX1-HN,并在COS 7中能够瞬时表达,为进一步进行免疫学评价奠定基础.     

双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达

目的 构建双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素真核表达载体,并在幼仓鼠(BHK)细胞中进行表达.方法 通过PCR方法分别改造流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA基因片段,在融合片段间引入具有柔性功能的(G_4S)_3 linker和具有自裂解功能的口蹄疫蛋白2A linker.将融合后的基因片段H5HA-H7HA克隆至真核表达载体pVAX1.选用BHK真核表达细胞系,用脂质体转染法将纯化后的表达质粒在细胞进行表达,转染后48 h,用间接免疫荧光法(IFA)检测目的基因的表达情况.结果 表达双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素基因的重组真核表达质粒pVAX1-H5HA-H7HA 经酶切和测序证明构建正确.转染重组质粒的BHK细胞可检测到目的蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pVAX1-H5HA-H7HA,并在BHK真核细胞中正确表达,为H5、H7双亚型核酸疫苗的研究奠定了基础.