CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的：构建CD80/IgG真核表达载体，使其在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中呈分泌型表达，为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法： 采用多聚酶链反应（PCR）技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA（cDNA） 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中，获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG；采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株；免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果： DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点，CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达，其分子量大小和预期的基本一致，该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论： 成功构建pcDNA／CD80-IgG真核表达载体，并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。     

蛋白表达的亚细胞定位影响基因免疫诱导的体液免疫应答水平的研究

目的研究表达产物的不同亚细胞定位对基因免疫诱导的体液免疫应答水平的影响,为基因疫苗的设计提供参考。方法利用分子克隆技术,分别构建能表达不同细胞定位的EGFP-HPVl6L1融合蛋白和截短型EGFP-HPV16L1△NLS融合蛋白的重组pcDNA-EGFP-HPV16L1和pcDNA-EGFPHPV16L1△NLS真核表达载体;通过转染CHO细胞,并在倒置荧光显微镜下观察表达产物的细胞定位;用重组pcDNA载体免疫BALB/c小鼠;EGFP作为抗原,ELISA法检测血清抗体吸光度。结果①重组pcDNA-EGFP-HPV16L1转染的CHO细胞核内可见到绿色荧光,pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS真核表达载体转染的CHO细胞质内可见到绿色荧光:②两种不同的重组pcDNA载体均可诱导BALB/c小鼠体液免疫反应,但重组pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS真核表达载体免疫组小鼠IgG抗体A_(450)值显著高于重组pcDNAEGFP-HPV16L1真核表达载体免疫组小鼠IgG抗体A_(450)值(P0.001)。结论表达产物的不同细胞定位可影响基因免疫诱发的体液免疫应答水平,定位于细胞质内的蛋白分子较定位于细胞核的蛋白分子能诱导机体更强的体液免疫反应,这为以增强体液免疫反应为目的的基因疫苗的设计提供了参考。     

人FL基因高效真核表达载体的构建及其在COS—7细胞中的表达

目的：构建人FL真核表达载体－pIRS1neo/hFL,观察其在COS－7细胞 中的表达。方法：采用RT－PCR方法自人白血病细胞系TF－1中克隆可溶型FL（Flt3-ligand)cDNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体-pIRES1 neo中的EcoR Ⅰ和BamHI位点,构建hFL真核表达载体－pIRES1neo/hFL。脂质体介质法将其转染COS－7细胞,72h以RT－PCR检测转染细胞中外源hFL基因的转录、ELISA法及脐血CD34^ 细胞增殖实验测定转染细胞上清上hFL的含量和活性。结果：酶切鉴定表明成功构建了重组真核表达载体－pIRES1neo/hFL;外源hFL基因能在转染细胞中有效转录;ELISA法测得72h后培养上清中的hFL含量为每24小时251ng/10^6 cells,并且分泌的hFL具有良好的生物学活性。结论：构建hFL真核表达载体在COS－7细胞中具有良好的表达活性。     

转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用

目的 构建转染小鼠可诱导共刺激分子配体(ICOSL)基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞株(CHO/ICOSL),探讨其对T细胞体外增殖与活化的促进作用.方法 从小鼠脾脏细胞中抽提总RNA,采用RT-PCR的方法获得小鼠ICOSL基因,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后装入EGFP-pIRES2真核表达载体中并测序鉴定,用脂质体转染技术将重组载体EGFP-pIRES2/ICOSL转染CHO细胞,经G418加压筛选,流式细胞术和RT-PCR分析其在CHO细胞中的表达.以转染空载体CHO细胞(CHO/Mock)作为对照,将CHO/ICOSL细胞与T细胞体外共培养,通过检测活化T细胞上CD25、CD69的表达及T细胞增殖实验对小鼠ICOSL转基因细胞的生物学功能进行初步研究.结果 CHO/ICOSL基因转染细胞能稳定地高表达小鼠ICOSL分子.与CHO/Mock相比,CHO/ICOSL基因转染细胞能够显著促进T细胞的体外活化与增殖(P＜O.05).结论 成功构建稳定表达小鼠ICOSL的基因转染细胞株,该细胞株能显著促进T细胞的体外活化与增殖,为进一步深入研究该分子生物学功能奠定了基础.     

mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。     

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。     

小鼠抗人CD52功能性抗体的制备与鉴定

目的 鼠抗人CD52抗血清的制备与功能鉴定.方法 由人Hut-78细胞提取细胞总RNA,运用RT-PCR方法扩增CD52基因,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),用脂质体转染法转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、FACS、免疫组织化学技术检测目的蛋白的表达.用CD52合成肽免疫小鼠,通过间接ELISA和流式细胞术分析抗血清,用MTS实验鉴定抗体对白血病LCL细胞系的增殖抑制作用.结果 建立了稳定转染的CHO细胞系.鉴定出有高效价抗体存在.MTS实验检测免疫血清有抑制LCL细胞生长作用.结论 功能性抗体制备成功并建立了稳定转染CD52的CHO细胞系.     

mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.     

人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体.方法:用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,并以ELISA、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果:在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白,用其免疫小鼠,获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体,免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子.结论:成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体,为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础.     

可诱导共刺激分子和小鼠免疫球蛋白融合基因的分泌表达及生物学活性

目的：为获得重组可诱导共刺激分子胞外段与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白（ICOS-Ig）并研究其生物学活性，以探讨它作为免疫拮抗剂阻断ICOS／B7RP-1共刺激通路的作用。方法：克隆编码人可诱导共刺激分子（ICOS）胞外片段，与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合，构建ICOS-Ig融合基因及其分泌型真核表达载体pSecTag2／Hygro A-ICOS-Ig；构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株，用Western blot和ELISA法检测其表达、流式细胞仪（FACS）检测其配体结合活性、混合淋巴细胞反应（MLR）及细胞因子检测测定其生物学活性。结果：核苷酸序列测定显示克隆基因的核苷酸与Genebank序列一致：ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达，其含量可达5～25μg／ml；该重组蛋白有配体结合活性，可体外抑制淋巴细胞增殖、减少IL-2、IFN-γ的分泌。结论：重组ICOS-Ig融合基因及其真核表达载体的构建完成并获得高效表达，该重组蛋白具有配体结合活性，可在体外通过抑制ICOS／B7RP-1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖及细胞因子分泌。     

Construction of the recombinant expression vector for CD80-IgG fusion gene and its expression in Chinese hamster ovary cells

Itiswellestablishedthatoptimalactivationof na veTcellsrequiressignalingthroughtheT cell receptoraswellasthroughothercostimulatorypathways.Na veTcellswillbecomenonrespons ive,anergicorapoptoticifthetumorantigenispr esentedtothemwithoutthecostimulatorysignal,whichmakestumorcellsescapefromtheimmuno surveillance.Oneofthemostimportantcostimula torysignalsofthiskindcanbeprovidedbythein teractionofB7.1(CD80)onantigen presenting cells(APC)withCD28onTcells.Acutemyelogenousleukemia(AML)cellsarenot…     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

人衰变加速因子DAF基因真核表达系统的构建

目的：构建含人补体调节蛋白衰变加速因子DAF分子的cDNA编码区的真核重组表达载体pcDNA3-DAF,转染NIH3T3细胞,建立稳定表达人DAF的NIH3T3细胞模型。方法：将人DAF分子的cDNA编码区克隆到真核表达载体pcDNA3,经酶切和测序鉴定后用磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NIH3T3细胞株。用PCR检测人DAF基因在NIH3T3细胞基因组中的整合;用RT-PCR、Westernblot实验和间接免疫荧光技术分别从RNA水平和蛋白质水平检测人补体调节蛋白分子DAF在细胞株中的表达。结果：成功构建了pcDNA3-DAF重组真核表达载体,并建立了稳定转染的NIH3T3细胞株,成功地表达了目的基因。PCR检测连续传代30次的NIH3T3pcDNA3-DAF细胞,结果显示人DAF基因仍稳定整合在异源细胞的染色体上,并未随着传代而丢失,为稳定的转染细胞株。结论：真核表达载体构建和稳定转染NIH3T3细胞株的建立为进一步研究人DAF功能和多种补体调节蛋白的协同作用奠定基础。     

人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

目的 建立稳定表达CD40－Ig融合蛋白的工程细胞株,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40：CD40L途径防治移植物抗宿主病（GVHD）策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG／40Ig中切下CD40－Fc融合基因,插入pcDNA3．1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo-fectamine将该载体转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆;夹心ELISA法检测上清中CD40－Ig融合蛋白的表达;Westem blot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞,ProteinA亲和层析法纯化,SDS－PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40－Fc融合基因插入pcDNA3．1载体后构建成功稳定表达载体p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化融合蛋白纯度达95％以上,该融合蛋白可特异结合Jukat细胞表面的CD40L。结论 CD40－Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合,为研究靶向CD40：CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。     

小鼠4-1BB-Fc分子的真核表达及其体外抑制T细胞增殖的效应

目的 克隆并构建含小鼠4-1BB胞外段和人IgG Fc融合基因的真核表达质粒，表达具有生物学活性的4-1BB-Fc融合蛋白，初步探讨其体外生物学效应。方法 借助RT-PCR技术，从小鼠脾脏总FLNA中扩增4-1BB全长编码基因，并导入克隆载体pGEM-T Easy。经测序证实，用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgG1 Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3．1中。应用脂质体将重组子pcDNA3．1-4-1BB-Fc转染COS-7及CHO细胞，经G418筛选，获得稳定表达4-1BB-Fc融合蛋白的CHO细胞株。双抗体夹心ELISA检测融合蛋白表达，经蛋白A亲和层析纯化，借助免疫印迹进行鉴定。应用FACS检测融合蛋白与DC细胞系DC2．4表面4-1BBL结合情况。采用MTT及CFSE（羧基荧光素乙酰乙酸）标记法检测4-1BB-Fc融合蛋白对同种异基因小鼠T细胞增殖的抑制作用。结果 经测序证实，所克隆和构建的小鼠4-1BB-Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确；ELISA与免疫印迹证实4-1BB-Fc蛋白的表达及其对T细胞增殖具有明显抑制作用。结论 成功构建4-1BB-Fc融合基因并获稳定表达，可望用于探讨4-1BB参与移植排斥的作用及其机制。并为研究4-1BB-Fc的其他生物学作用奠定初步基础。     

人CD81的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 从人外周血淋巴细胞中克隆出CD81基因，构建真核表达质粒，并在COS－7细胞中进行表达。方法 分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，采用RT－PCR扩增CD81基因。将CD81基因克隆至载体pcDNA3.1( )中，进行酶切及测序鉴定。以质粒pcDNA3.1-CD81转染COS－7细胞进行瞬时表达，并用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测蛋白的表达。结果 RT－PCR产物已插入载体pcDNA3.1( )构建成真核表达质粒pcDNA3.1-CD81。经双酶切和测序鉴定表明，克隆出的人CD81全长编码序列同GenBank收录的序列一致，并且真核表达质粒的构建正确。以脂质体转染COS－7细胞后，用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测表明，细胞可表达人CD81。结论 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-CD81，为进一步研究HCV和CD81的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型打下了基础。     

pcDNA3.1-MORC2重组质粒的构建及其在胃癌细胞SGC-7901中的表达和定位

目的 构建真核表达载体pcDNA3.1-MORC2并瞬时转染人胃癌细胞SGC-7901,观察融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以人MORC2 cDNA为模板,PCR扩增MORC2全长编码基因,亚克隆至pcDNA3.1-hisA表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,提取细胞蛋白进行Wester...     

抗人B细胞淋巴瘤DNA疫苗的构建

目的 :探讨人B细胞淋巴瘤活检组织中肿瘤细胞膜表面免疫球蛋白VH(smIgVH)基因片段能否在动物体内激发特异性抗独特型抗体。方法 :以RT PCR法获得IgVH 基因片段 ,以小鼠单核细胞趋化因子 (MCP 3)基因作为佐剂分子 ,进行重组PCR获得MCP 3和VH 基因片段的融合基因 ,克隆在真核表达载体 pcDNA3.1中 ,构建DNA疫苗质粒 pcDNA/MCP BVH。通过脂质体转染验证该质粒在真核细胞COS 7中的表达。结果 :通过上述方法获得了以活检组织肿瘤细胞mIgVH区基因片段 ;成功地构建了DNA疫苗质粒 pcDNA/MCP BVH。体外瞬时转染实验证明 ,该质粒能够在真核细胞COS 7中正确表达。结论 :成功地构建重组表达质粒 pcDNA/MCPBVH,在体外能够正确表达 ,为进一步研制抗B细胞淋巴瘤基因疫苗奠定了基础