吸水链霉菌17997产生氢醌型格尔德霉素及其生物合成中间产物

目的 了解格尔德霉素生物合成PKS后修饰过程中的一些细节.方法 对格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997及其格尔德霉素生物合成聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)后修饰基因阻断变株(gdmP-和gdmN-)在ISPII平板不同时间的培养物进行乙酸乙酯提取,硅胶板TLC和NaOH显色分析,检测GDM及其生物合成中间产物,并利用LC-MS对中间产物进行鉴定.结果 吸水链霉菌17997原株、gdmN-和gdmP-变株在培养时间72～96h,发现氢醌型格尔德霉素(GQH2)、氢醌型4,5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基格尔德霉素(H2GQH2-dC)和氢醌型4,5-双氢格尔德霉素(H2GQH2)分别为主要组分,相应的醌型化合物为次要组分;之后,这些氢醌型化合物随培养时间延长逐渐消失,相应的醌型化合物成为主要组分.双向硅胶板TLC分析证实GQH2、H2GQH2-dC和H2GQH2均可在空气中自发氧化为相应的醌型化合物.结论 在吸水链霉菌17997的GDM生物合成PKS后修饰过程中,首次提出GQH2自发氧化为GDM可能是氢醌型向醌型转变的位点,同时它也是GDM生物合成最后一步.     

吸水链霉菌17997产生的4，5-双氢格尔德霉素的鉴别与检测

本文对从吸水链霉菌17997发酵提取获得的格尔德霉素精制品进行了LC-MS-MS分析,发现其中含有4,5-双氢格尔德霉素组分.对吸水链霉菌17997摇瓶发酵产物的硅胶板薄层层析分析表明,4,5-双氢格尔德霉素组分在发酵中期有积累.已知4,5-双氢格尔德霉素的抗肿瘤活性比格尔德霉素差,因而需要限制其在格尔德霉素制品中的含量.本文研究结果对以吸水链霉菌17997等为产生菌研究格尔德霉素发酵,促进4,5-双氢格尔德霉紊转化为格尔德霉素以提高发酵液的品质,以及检测格尔德霉素制品中的4,5-双氢格尔德霉素组分具有实际意义.     

反相高效液相色谱法检测红霉素发酵过程中S-腺苷甲硫氨酸

建立用反相高效液相色谱（RP—HPLC）检测红霉索发酵液中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的方法，观察其在发酵过程中的变化。样品经离心、超声等处理，进行RP—HPLC分析，梯度洗脱。实验结果说明，该方法可以使SAM与发酵液中其它复杂组分得到较好的分离。红霉素发酵过程中SAM量随时间呈曲线变化，高峰值出现在96h左右。     

反相高效液相色谱法检测非那西丁血药浓度

目的观察采用反相高效液相色谱法进行非那西丁血药浓度检测的效果。方法选取健康人空白血浆为对象,将非那西丁、硫酸阿托品加入其中,观察和研究方法的精密度、线性和回收率。结果检测范围在4－64μg/mL,r=0.999 7,线性关系良好,日内变异系数在低浓度时为1.28%,中浓度时为1.13%,高浓度时为0.89%,日间变异系数在低浓度、中浓度、高浓度时分别依次为2.16%、1.62%、2.11%;低浓度加样回收率为（98.52±2.46）%,中浓度加样回收率为（102.31±2.12）%,高浓度加样回收率为（102.85±1.61）%。结论临床非那西丁血药浓度的检测可以通过反相高效液相色谱法实现,具有较高的监测灵敏度,操作简便,快捷。     

非那雄胺有关物质及经化学降解产物的反相高效液相检测

目的 :建立分离非那雄胺有关杂质的反相高效液相色谱法。方法 :以ODS柱 (2 5cm× 4 .6mm ,5 μm)为固定相 ,乙腈 0 .0 4mol/L磷酸 (用NaOH溶液调至pH =4 .0 ) (5 5 :4 5 )为流动相 ,2 15nm为检测波长 ,分离非那雄胺有关杂质及中间体 ,酸、碱、过氧化氢强烈破坏产物。结果 :非那雄胺有关杂质及合成中间体 ,酸、碱、过氧化氢强烈破坏产物分离良好。结论 :本方法专属性强 ,灵敏度高。可用于检查非那雄胺有关杂质     

己酮可可碱中杂质的反相高效液相色谱检测

以反相高效液相色谱法测定己酮可可碱中的杂质，采用ＯＤＳ柱，以甲醇－水－冰乙酸（４５：５５：５）为流动相，紫外检测波长为２７４ｎｍ，本法比薄层色谱法分离效果好，精密度高，且具有良好重现性。     

反相高效液相色谱测定人体甲氧苄胺嘧啶血药浓度分析

目的探讨反相高效液相色谱测定人体甲氧苄胺嘧啶血药浓度的方法与效果。方法选择Agilent1100反相高效液相色谱仪测定人体甲氧苄胺嘧啶的血药浓度。结果甲氧苄胺嘧啶的线性方程为Y=6.25×10-4X＋1.08×10-2,线性范围为0.05～10.00μg/ml。甲氧苄胺嘧啶日内和日间精密度的相对标准偏差分别为4.4%和4.5%,提取回收率为92.1%,平均血药浓度为0.260μg/ml。结论采用反相高效液相色谱测定人体甲氧苄胺嘧啶血药浓度,方法简单、可行、灵敏度高,具有良好的回收率、准确度和精密度。     

反相高效液相色谱法检测盐酸帕洛诺司琼及其有关物质

目的建立反相高效液相色谱法分离盐酸帕洛诺司琼及其有关物质的方法。方法采用Agilent ZORBAX Ec ilipse C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-25 mmol.L-1磷酸二氢钠溶液(含0.1%三乙胺,用磷酸调pH值至4.0)(25∶75)为流动相,检测波长为210 nm,流速:1.0 mL.m in-1。结果帕洛诺司琼能与杂质及降解产物分离。结论本方法准确、简便,适用于盐酸帕洛诺司琼和有关杂质及降解产物的检查。     

反相高效液相色谱法测定曲马多及其代谢产物O-去甲基曲马多人血药及尿药浓度

目的 建立血浆和尿液中曲马多(镇痛药)及其代谢产物O-去甲基曲马多的反相高效液相色谱分析方法.方法 用zorbax SB-C_(18)色谱柱,0.05 mol·L~(-1)KH_2PO_4(用磷酸调节pH至4.0)-乙腈(90:10)为流动相,流量1.0 mL·min~(-1);荧光检测波长E_x=216 nm,E_m=308 nm.结果 血浆中,曲马多、O-去甲基曲马多的线性范围分别为12.5～800.0、5～320 ng·mL~(-1),低、中、高3种浓度绝对回收率均大于86%,相对回收率为93%～105%,日内和日间RSD分别小于9%和8%.尿液中,曲马多、O-去甲基曲马多线性范围分别为12.5～4 000、5～1 280 ng·mL~(-1),低、中、高3种浓度绝对回收率均大于80%,相对回收率为91%～107%,日内和日间RSD均小于9%.在血浆和尿液中均稳定,差异均在±10%以内.结论 本方法准确可靠、专一性好、操作简便.     

高效液相色谱质谱法测定格尔德霉素基因阻断变株产物

目的:在研究格尔德霉素(GDM)生物合成的过程中利用基因阻断技术分别阻断 GDM 生物合成的起始基因3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)基因、含 AHBA 基因并与之相连的聚酮合酶(PKS)基因簇以及 GDM 生物合成相关的 PKS 和 PKS 后修饰基因簇 CT-PKS 获得3个 GDM 基因阻断变株。为了比较分析他们的次级代谢产物,采用高效液相色谱质谱法测定发酵液组分。方法:发酵液经过乙酸乙酯提取后用反相高效液相色谱分析。分析柱为迪马公司 Diamonsil~(TM)(钻石)C_(18)(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相是40%～100%甲醇,30 min 梯度洗脱;流速1 mL·min~(-1);二极管阵列检测器(DAD),检测波长304nm。利用电喷雾质谱(ESI)通过正负离子扫描获得相应化合物的相对分子质量信息;利用质谱的源内裂解技术获得相应化合物的结构信息。结果:检测发现,阻断2个不同的 GDM 生物合成基因以后主要产生2个不同于 GDM 的化合物。结论:该方法可快速、准确地对基因工程变株发酵新产物进行早期鉴别,指引后续的化学分离,并用于其他 GDM 基因阻断变株产物的定性。     

Geldanamycin产生菌生物合成相关基因的克隆与分析

目的：从geldanamycin产生菌吸水链霉菌（S.hygroscopicus)中克隆生物合成基因，为阐明生物合成机制及改造其结构奠定基础。方法：以链霉菌／大肠埃希氏菌穿梭cosmids pKC505为载体构建了插入片段为20－30kb的S.hygroscopicus总DNA文库，以利福霉素中与3－氨基－5－羟基苯甲酸（AHBA）合成相关基因为探针，经菌落杂交，Southern杂交筛选同源基因片段，测序结果与Genbank进行同源性比较分析，并以attp-噬菌体载体KC515利用基因阻断实验对克隆的基因片段进行功能鉴定。结果：构建的基因文库含重组基因比率高，基因组覆盖率高，稳定性好，经同源基因探针杂交，从文库中筛选出9个阳性cosmids克隆pCGB20,pCGB26,pCGB28,pCGB29,pCGB36,pCGB45,pCGB49,pCGB63,pCGB75，测序分析表明，cosmid pCGB20中BamHI-BamHI 8kb片段两端的不完整ORF编码蛋白与竹桃霉素（oleandomycin)PKS Module 5,Module 6(一致性为79％）和红霉内酯合成酶ORF2（一致性为75％），ORF1（一致性为73％），ORF3（一致性为70％），高度同源；BamHI-BamHI 3kb片段一端与编码类结核分枝杆菌的磷酸吡哆醛依赖的氨基转移酶家族中半胱氨酸脱硫酶的DNA有同源性，该家族与AHBA合成酶关系密切，Cosmid pCGB20的BamHIBamHI 8kb及BamHI-BamHI 3kb基因片段已通过基因阻断实验初步鉴定，证明它们参与geldanamycin生物合成，而其他cosmids阳性克隆的序列分析及功能研究尚在进行中。     

黑暗链霉菌安普霉素生物合成基因aprG的克隆和功能研究

从安普霉素产生菌S．tenebrarius H6总DNA中已克隆得到8．2kb的安普霉素抗性基因连锁片段。对距离抗性基因下游4．5kb的SacI-Sau3AI片段进行测序分析，发现了一个新的891bp开放阅读框架。推测其编码为296个氨基酸的蛋白质。经BLASTX程序分析，没有发现与之同源的基因，是一个新基因，该基因命名为aprG。构建基因阻断穿梭载体pSPU58，经接合转移导入S．tenebrarius H6，筛选单交换阻断变株，并用Southern blot验证阻断变株的aprG已经被破坏。经发酵分析，阻断变株不再合成安普霉素，表明aprG与安普霉素生物合成直接相关。     

RP—HPLC法测定布洛芬-聚乙二醇6000固体分散体中布洛芬的含量

目的 建立反相高效液相色谱法测定布洛芬-聚乙二醇6000固体分散体中布洛芬的含量.方法 色谱柱为Shimadzu C18柱,流动相为0.02 mol·L^-1醋酸钠（冰醋酸调节pH至3.0±0.1）-乙腈（40：60）,流速1.0ml·min^-1,检测波长为264nm,进样量为20μl.结果 布洛芬质量浓度在0.051～1.02 mg·ml^-1范围内与相应峰面积呈良好线性关系（r=0.999 9,n=6）,平均加样回收率为98.40%,RSD为0.92%（n=9）.结论 所用方法准确、简便、快速,适用于布洛芬-聚乙二醇6000固体分散体中布洛芬的含量测定.     

A 28-day oral dose toxicity study enhanced to detect endocrine effects of hexabromocyclododecane in Wistar rats.

A 28-day repeated dose study in rats (OECD407) enhanced for endocrine and immune parameters was performed with hexabromocyclododecane (HBCD). Rats were exposed by daily gavage to HBCD dissolved in corn oil in 8 dose groups with doses ranging between 0 and 200 mg/kg bw per day (mkd). Evaluation consisted of dose-response analysis with calculation of a benchmark dose at the lower 95% one-sided confidence bound (BMDL) at predefined critical effect sizes (CESs) of 10-20%. The most remarkable findings were dose-related effects on the thyroid hormone axis, that is, decreased total thyroxin (TT4, BMDL 55.5 mkd at CES--10%), increased pituitary weight (29 mkd at 10%) and increased immunostaining of TSH in the pituitary, increased thyroid weight (1.6 mkd at 10%), and thyroid follicle cell activation. These effects were restricted to females. Female rats also showed increased absolute liver weights (22.9 mkd at 20%) and induction of T4-glucuronyl transferase (4.1 mkd at 10%), suggesting that aberrant metabolization of T4 triggers feedback activation of the thyroid hormone system. These effects were accompanied by possibly secondary effects, including increased cholesterol (7.4 mkd at 10%), increased tibial bone mineral density (> 49 mkd at 10%), both in females, and decreased splenocyte counts (0.3-6.3 mkd at 20%; only evaluated in males). Overall, female rats appeared to be more sensitive to HBCD than male rats, and an overall BMDL is proposed at 1.6 mkd, based on a 10% increase of the thyroid weight, which was the most sensitive parameter in the sequence of events.     

不同方法炮制对巫山淫羊藿中主要成分朝藿定C和淫羊藿苷的影响

目的:研究不同方法炮制对巫山淫羊藿中主要成分朝藿定C及淫羊藿苷的影响。方法:采用RP-HPLC法,使用Shim-pack VP-ODS(5μm,150 mm×4.6 mm)色谱柱,以乙腈-水(25∶75)流动相,流速为1 mL·min-1,检测波长270 nm,柱温30℃,比较不同炮制品中朝藿定C及淫羊藿苷含量的变化。结果:巫山淫羊藿不同炮制品中活性成分淫羊藿苷含量均有较大程度的上升;而朝藿定C变化则比较复杂,除羊脂油炙巫山淫羊藿中朝藿定C含量有较大的下降外,其余均有较小程度的上升。结论:加热炮制可能促使巫山淫羊藿中的其他成分分解或转化为淫羊藿苷;羊脂油炙巫山淫羊藿中朝藿定C含量有较大的下降,提示朝藿定C可能不是淫羊藿中的助阳成分;不同方法炮制对巫山淫羊藿主要成分影响较大,提示巫山淫羊藿在临床应用时必须选择合适的炮制方法。     

白刺链霉菌(Streptomyces albospinus)CT205次生代谢产生活性物质的分离纯化及结构鉴定

目的 为了确定白刺链霉菌(S. albospinus)CT205次生代谢产生抗菌活性物质的结构。方法 S. albospinus CT205进行液体摇瓶发酵，对发酵上清液进行溶媒萃取、减压浓缩、薄板检测Rf值，采用制备型薄板分离获得单体化合物。紫外扫描检测吸收峰的波长范围，以HPLC-TOF-HR-MS检测物质分子量，并检测其核磁共振波谱(1H NMR、13C NMR)及红外光谱。结果 GF254薄板在氯仿:乙酸乙酯:甲醇:甲酸(16:1:2:0.04)的层析系统展层时，Rf 值为0.68的组分具有抗菌活性。紫外扫描显示在λ=215nm处有最大吸收峰，HPLC-TOF-HR-MS检测分析一级质谱、二级质谱表明活性物质分子量为282.2，该物质与放线酮分子量相同，1H NMR、13C NMR检测其骨架结构，红外光谱佐证活性物质各功能基团(羰基，羟基，氨基等)的存在。结论 确定活性物质成分为放线酮，又名环己酰亚胺(cycloheximide)。     

A 28-day oral dose toxicity study in Wistar rats enhanced to detect endocrine effects of decabromodiphenyl ether (decaBDE)

Decabromodiphenyl ether (decaBDE) is a widely used brominated flame retardant, considered to be of low toxicity. However, previous toxicity studies applied exposure methods with low bioavailability of this compound, and the actual hazard of decaBDE for humans, which are environmentally exposed to decaBDE, may thus be underestimated in current risk assessments. The present 28 days oral toxicity study in Wistar rats was designed to facilitate detection of endocrine and immune modulating effects of decaBDE using an exposure protocol with improved bioavailability. A technical preparation of high purity decaBDE was thus tested by daily exposure through gavage with an emulsion of soy phospholipon/lutrol as a carrier. Most sensitive effect in males were increased weight of seminal vesicle/coagulation gland with BMDL of 0.2mg/kg bw/day and increased expression of hepatic CYP1A and CYP2B (BMDLs 0.5-0.7 mg/kg bw/day). In females the most sensitive effect was decreased activity of P450c17 (CYP17), which is a key enzyme in the androgen synthesis pathway, in adrenals (BMDL 0.18 mg/kg bw/day). These results suggest that decaBDE may represent an as yet unreported hazard for reproductive health.     

Microarray analysis of gene expression in rat alveolar epithelial cells exposed to fractionated organic extracts of diesel exhaust particles

Diesel exhaust particles (DEP) affect health adversely. Our previous studies revealed that DEP extracts up-regulated expression of genes related to drug metabolism, antioxidant enzymes, cell cycle/apoptosis and coagulation, and in addition, n-hexane soluble fraction (n-HSF) of DEP extracts contains aliphatic and polycyclic aromatic hydrocarbons, and n-hexane insoluble fraction (n-HISF) contains oxygenated compounds and has strong oxidative property. However, the relationship between the properties of chemicals in DEP extracts and the gene expression has not been fully elucidated. Here, we used a microarray analysis to identify and characterize genes whose expression is regulated by exposure to fractions of DEP extracts. A dichloromethane-soluble fraction (DMSF) of DEP was further fractionated into n-HSF and n-HISF. We exposed rat alveolar epithelial (SV40T2) cells to these fractions (30 μg/ml) for 6 h and identified regulated genes. DMSF predominantly up-regulated genes associated with drug metabolism (Cyp1a1, Gsta3), oxidative stress response (HO-1, Srxn1) and cell cycle/apoptosis (Okl38). Genes up-regulated by n-HSF were mainly associated with drug metabolism (Cyp1a1, Gsta3). The genes up-regulated by n-HISF included antioxidant enzymes (HO-1, Srxn1); genes response to cell damage, such as those functioning in cell cycle regulation or apoptosis (Okl38); and genes in coagulation pathways. Our present results suggested that n-HSF and n-HISF regulated characteristic genes which respond to chemical properties of each fraction.