阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞与CD34+CD59-细胞生物学性能的研究

目的 探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患CD34^ CD59^ 细胞的特性及PNH克隆呈优势造血的可能原因，以探索PNH发病的内在机制。方法 用免疫磁珠吸附法富集纯化CD34^ 细胞，再用流式细胞仪分选出PNH患的CD34^ CD59^ 细胞、CD34^ CD59^ 细胞及正常对照CD34^ 细胞。分别进行体外扩增液体培养2周，并对扩增前、后的细胞进行半固体培养。结果 ①PNH患CD34^ CD59^ 细胞与正常对照CD34^ 细胞形成集落形成单位(CFU)均在第7天达到扩增高峰，并且扩增后的细胞仍能保持CD59抗原，无GPI锚连蛋白的丢失。②正常对照的CD34^ 细胞在生存、增殖、形成CFU及扩增能力上均明显强于FHN患的CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^-细胞.③PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞体外半固体培养，其形成CFU的能力无明显差异。④PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞在SCF IL3 IL6 FL Tpo及SCF IL3 IL6 FL Tpo Epo组合下液体培养，其生存、增殖、扩增等能力上均无明显差异。但在SCF IL3 IL6 FL Tpo Epo GM-CSF组合下液体培养，CD34^ CD59^ 细胞的生存、增殖、扩增能力均明显强于CD34^ CD59^ 细胞。结论 ①正常对照的CD34^ 细胞在生存、增殖、形成CFU及扩增能力上均明显强于PNH患的CD34^ CD59^ 细胞。②PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞体外半固体培养，以及在SCF IL3 IL6 LF Tpo及SCF IL3 IL6 FL Tpo Ep组合下液体培养，其生存、增殖、扩增等能力上均无明显差异，说明CD34^ CD59^ 细胞在造血能力上并无内在的优势。GM—CSF或许是使PNH克隆呈造血优势的原因之一。     

裸鼠腹腔输注体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症病人骨髓CD34+CD59+细胞的研究

应用BALB／c裸鼠为移植模型，将在体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）病人的CD34^＋CD59^＋细胞进行移植。研究其增殖能力和重建造血的情况，为实现PNH患者进行临床自体骨髓移植（ABMT）或自体外周血干细胞移植（APBSCT）奠定基础。本研究利用免疫磁珠双阳性分选法。从PNH患者骨髓中分离出足够数量的CD34^＋CD59^＋细胞进行体外扩增，并将体外扩增的细胞输注给接受亚致死剂量照射的BALB／c裸鼠。结果显示：移植6周后，用流式细胞术和DNA检测方法均检测到裸鼠骨髓、脾脏和外周血中人的CD45^＋细胞，而接受PNH病人CD34^＋CD59^＋细胞移植后的裸鼠，其血常规指标有一定恢复，但并未完全恢复。结论：PNH病人骨髓CD34^＋CD59^＋细胞体外扩增后仍能保持造血祖细胞的生物特性，在照射的裸鼠中能重建造血。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血清对CD34+细胞生长的影响

为探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）患血清对造血干／祖细胞增殖的影响，应用单个细胞培养及液体、半固体群体细胞培养方法，将病人血清与正常人血清分别加入培养体系中，观察不同血清对正常人及病人正常及异常表型的CD34^ 细胞的直接影响。发现在单个细胞培养条件下，加入PNH血清与加入正常人血清时，正常人及PNH两种表型的CD34^ 细胞在细胞分裂、集落形成、较大集落形成的比例、单个细胞扩增能力及细胞总数诸方面均无明显差别（P＞0．05）。在半固体集落培养时，加入病人或正常人血清，对正常人及病人正常表型CD34^ 细胞的集落形成能力的影响无显差异（P＞0．05），而病人CD34^ CD59^-造血干／祖细胞的集落形成率在加入病人血清组高于加入正常人血清组（P＜0．05）。结果说明，在单个细胞及群体细胞液体培养条件下，加入病人血清与加入正常人血清，对正常人以及病人正常或异常表型造血干／祖细胞和长的影响无显差别，而在半固体培养条件下，则显示病人血清更有利于患的异常表型CD34^ 细胞的集落生成。     

CD59检测在阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断中的意义

目的　探讨CD5 9检测对阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (paroxysmalnocturnalhemoglobinuria ,PNH)及再生障碍性贫血 (AA) PNH综合征的临床诊断意义。方法　用FITC标记的CD5 9单抗 ,以流式细胞仪检测 13例PNH、37例AA和 2 0例正常人外周血红细胞和粒细胞膜表面CD5 9的表达情况。结果　正常人红细胞和粒细胞CD5 9表达阳性率均 >98% ;13例PNH患者红细胞及粒细胞CD5 9表达阳性率均 <90 % ;37例再障患者中 2 4例表达正常 ,13例红细胞或粒细胞CD5 9表达阳性率均有不同程度的减低。结论　CD5 9检测是诊断PNH较直接而又特异、敏感的方法 ,特别是对表现不典型的PNH及AA PNH综合征的诊断具有重要意义     

PNH患者骨髓CD34^＋CD59^＋细胞体外扩增及植入体内重建造血的活性研究

本研究应用BALB／c裸鼠为移植模型探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobin—uria，PNH）患者CD34^＋CD59^＋的增殖和重建造血的能力，为实现PNH患者自体骨髓移植或自体外周血造血干细胞移植提供实验依据。利用免疫磁珠双阳性分选法，从正常人及PNH患者骨髓中分离出两组CD34^＋CD59^＋细胞，分别进行体外扩增，并将体外扩增的正常人和PNH患者骨髓CD34^＋CD59^＋细胞分别输注给接受亚致死剂量照射的BALB／c裸鼠。应用流式细胞技术和DNA检测技术检测受鼠骨髓、脾脏和外周血中人CD45^＋细胞。结果表明：PNH组的CD34^＋CD59^＋细胞在体外生存、扩增能力似弱于正常人对照组。但CD34^＋CD59^＋细胞输注给受鼠后6周，在受鼠骨髓、脾脏和外周血中可检测到人CD45^＋细胞，PNH组受鼠CD45^＋细胞水平与正常人对照组相比，无统计学差异。结论：PNH患者CD34^＋CD59^＋细胞仍具有同正常人CD34^＋CD59^＋细胞相同的生物特性，能体外扩增并能保持正常干／祖细胞的特性。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症实验室诊断

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种后天获得 的血细胞膜缺陷的克隆性疾病,临床上可表现血管内溶 血、栓塞、全血细胞减少等,有时可出现骨髓衰竭[1]。现 已证实,大多数PNH患者异常克隆与正常造血并存,使本 病的诊断和发病机制的研究受到限制。PNH患者红细胞 膜表面缺乏加速衰变因子(DAF,CD55)、反应性溶血的膜 抑制物(MIRL,CD59)和C8结合蛋白(或称同种限制因 子,HRF)等,使红细胞对补体敏感而溶血。上述3种蛋 白都经糖基化磷脂酰肌醇(GPl)连接在细胞膜上[2]。近 年来,由于各种检测技术的发展使得PNH发病机制的研 究、PNH…     

41例阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血细胞CD55和CD59抗原检测

采用流式细胞术(FCM)和免疫荧光标记技术对阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者完全或部分缺乏退变加速因子(DAF,CD55)和反应性溶血膜抑制物(MIRL,CD59)的异常红细胞和粒细胞进行分析[1-5],提高了对PNH 的诊断水平,但各实验室之间缺乏统一的判断标准.我们应用Biocytex公司提供的标准化的Redquant CD55/CD59 和Cellquant CD55/CD59试剂盒,可以简便、快速地对PNH细胞表型进行定量分析,现报道如下.     

CD55、CD59检测阵发性睡眠性血红蛋白尿症标准方法建立

目的建立流式细胞术(FCM)检测阵发性睡眠性血红蛋白尿症(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuriaP,NH)的标准方法。方法应用FCM对49例PNH病人,18例自身免疫性溶血性贫血(AIHA),10例缺铁性贫血(IDA),正常对照40例;采用活细胞直接免疫荧光标记法检测红细胞和粒细胞膜表面的CD55和CD59的表达。结果49例PNH病人除2例红细胞CD55-、CD59-的百分率小于5%,其余病例红细胞和粒细胞CD55-、CD59-的百分率均大于5%(5.9%￣79.1%)。18例AIHA病人红细胞和粒细胞CD55-、CD59-的百分率均小于5%。10例IDA病人有8例红细胞CD55-、CD59-的百分率均大于5%(5.0%￣9.1%),而粒细胞CD55-、CD59-的百分率均小于5%。40例正常对照红细胞和粒细胞CD55-、CD59-的百分率均小于5%。49例PNH病人蛇毒因子试验5例阴性;糖水试验4例阴性、酸溶血试验5例阴性。而这其中仅2例病人蛇毒因子试验、糖水试验、溶血试验同时阴性。其余病人蛇毒因子试验、糖水试验、酸溶血试验均阳性。结论同时检测红细胞和粒细胞膜的CD55和CD59诊断PNH,该方法的灵敏度与特异性均高达100%。因此,针对国内其他单位在开展此项目时仅检测CD55或CD59,或者只检测红细胞或白细胞的CD55、CD59的情况,作者认为同时检测红细胞和粒细胞膜的CD55和CD59诊断PNH是值得在临床推广的标准方法。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症实验室诊断

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种后天获得的血细胞膜缺陷的克隆性疾病,临床上可表现血管内溶血、栓塞、全血细胞减少等,有时可出现骨髓衰竭。现已证实,大多数PNH患者异常克隆与正常造血并存,使本病的诊断和发病机制的研究受到限制。PNH患者红细胞膜表面缺乏加速衰变因子(DAF,CD55)、反应性溶血的膜抑制物(MIRL,CD59)和C8结合蛋白(或称同种限制因子,HRF)等,     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓造血细胞对粒细胞集落刺激因子反应的研究

目的　观察阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者骨髓造血细胞对粒细胞集落刺激因子(G CSF)的反应并研究其机制。方法　①用半固体培养基体外培养17例PNH患者和12名正常人骨髓单个核细胞(BMMNC),观察加与不加G CSF两组粒单核细胞集落(CFU GM)和集簇(cFU GM)形成情况。PNH患者骨髓GPI+CD34+和GPI-CD34+细胞表达粒细胞集落刺激因子受体(G CSFR、CD114)和干细胞生长因子受体(C KIT、CD117)的差异。②用流式细胞术检测20例初发PNH患者和12名正常对照BMMNC和CD34+细胞表面GPI锚定蛋白CD59以及CD114和CD117的表达。结果　①无G CSF及加G CSF培养PNH组cFU GM数量分别为( 112. 41±22. 74 )和( 133. 82±25. 85 ) /105BMMNC,均较正常对照的(190. 33±36. 05)和(309. 42±92. 94) /105 BMMNC少(P<0. 05);无G CSF及加G CSF培养PNH组CFU GM数量分别为(24. 29±9. 05)和(27. 53±10. 65) /105 BMMNC,也较正常对照的(77. 42±36. 01)和(98. 00±43. 14) /105 BMMNC少(P<0. 05 )。PNH组加G CSF后,cFU GM增加率为(20. 29±6. 82)% (P<0. 05),CFU GM增加率为(16. 45±3. 28)% (P>0. 05)。正常对照加G CSF后,cFU GM增加率为(56. 11±37. 59)%,CFU GM增加率为(48. 03±13. 60)% (P值均<0. 05),PNH组增加率均低于正常对照(P<0     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓中正常及异常造血干/祖细胞含量分析

OBJECTIVE: To explore the contributive role of CD34+ cell amount in pathogenesis of clonal dominance in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH). METHODS: Bone marrow nuclear cells (BMNCs) were doubly labeled by PE-conjugated anti-CD59 monoclonal antibody (McAb) and FITC-conjugated anti-CD34 McAb, and CD34+ cells contained in different cell populations were determined by flow cytometry. RESULTS: 1. CD34+ cells mainly appeared in window A (containing mainly of lymphocytes) and window D (composed of blasts, other immature cells and monocytes) in both normal controls and PNH patients. 2. The numbers of CD34+ cells in normal controls were (3,701 +/- 896)/10(5) cells and (11,373 +/- 1,574)/10(5) cells in window A and window D, respectively. Compared with normal controls, PNH patients possessed significantly decreased number of CD34+ cells [(1,215 +/- 749)/10(5) cells and (6,420 +/- 2,337)/10(5) cells in window A and window D, respectively]. 3. In normal controls, nearly all CD34+ cells in windows A and D expressed CD59 antigen (99.2% +/- 1.0% in A and 98.7% +/- 0.8% in D), whereas in PNH patients, the CD34+ cells clearly showed two immunophenotypes of CD34+CD59+ and CD34+CD59- with the latter being predominant in both window A and window D(CD59- cells constituting 79.3% +/- 15.5% and 85.9% +/- 7.8% of CD34+ cells, respectively). 4. The amounts of CD34+ cells in CD59+ populations [(463 +/- 276)/10(5) cells in window A and (3,841 +/- 1,188)/10(5) cells in window D] reduced to a greater extent than that in CD59- population [(2,603 +/- 2,084)/10(5) cells in window A and (7,105 +/- 2,739)/10(5) cells in window D]. CONCLUSION: Hematopoietic stem/progenitor cells in BMNCs of PNH patients are markedly decreased. Reduction of CD34+ cells in CD59+ cell population is even more obvious than that in CD59- population. The dominance of the abnormal clone in hematopoiesis might be a relative one in the setting of severely impaired normal hematopoiesis.     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓造血干/祖细胞体外单个细胞培养

目的 研究阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）患者单个不同表型骨髓造血干／祖细胞体外生长特性。方法 用免疫磁珠富集C34^ 细胞，用流式细胞仪自动分选系统将患者CD34^ CD59^ 和CD34^ CD59^-造血干／祖细胞单个分选入96孔培养板，进行单个细胞培养，观察不同细胞各个生长指标，并与正常对照细胞比较。结果 ①单个细胞培养条件下，患者CD34^ CD59^-细胞在细胞发生分裂（细胞数≥2个）的比率、形成集落（细胞数≥50）的比率及扩增的总数（所有细胞发生分裂的孔的细胞数的总和）都超过了其CD34^ CD59^ 细胞（P＜0．05）。②PNH CD34^ CD59^-细胞单个细胞扩增的数目及细胞扩增的总数代于正常对照（P＜0．05）。③PNH CD34^ CD59^ 细胞在较大集落（细胞数≥500）形成、单个细胞扩增的数目及细胞扩增总数均低于正常对照（P＜0．01）。④患者异常与正常表型细胞单个细胞次级集落的形成能力差异无显著性（P＞0．05），但都明显低于正常对照。（P＜0．001）。结论 在单个细胞培养条件下，患者异常表型的造血干／祖细胞较其正常表型的造血干／祖细胞具有一定的生长优势。但它们与正常骨髓细胞相比，都存在一定的生长缺陷，正常表型细胞的缺陷尤为明显。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症临床缓解患者仍可查出异常血细胞

目的观察临床完全缓解的阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ＰＮＨ）患者体内是否仍有异常造血细胞并探讨其临床意义。方法用免疫荧光标记及流式细胞术检测患者骨髓有核细胞、外周血红细胞ＣＤ５９抗原表达及骨髓ＣＤ３４＋造血干／祖细胞数。结果２例临床完全缓解的ＰＮＨ患者体内仍呈正常造血细胞与异常克隆并存状态,但与未缓解ＰＮＨ患者相比,完全缓解患者外周血红细胞、骨髓单个核细胞及ＣＤ３４＋细胞中均以正常的ＣＤ５９＋细胞为主,表明体内异常克隆造血优势已经消失。结论临床完全缓解的ＰＮＨ患者仍可有残存的异常克隆;ＰＮＨ达到临床完全缓解并不一定需要体内异常克隆的彻底消灭;ＰＮＨ患者体内异常克隆的造血优势在一定条件下是可以消失的。     

PNH患者淋巴细胞CD59和CD45的表达

目的分析阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者淋巴细胞及其亚群上糖化肌醇磷脂结合蛋白(CD59)的表达和功能转化.方法采用流式细胞术多色分析法,配合多种细胞特异性抗体,对PNH患者不同类型的淋巴细胞及其亚群上CD59的表达进行分析,并通过细胞刺激实验对CD59表达阴性和部分阳性的异常淋巴细胞(即病态细胞)表面分化抗原CD45异构表型的功能转化进行研究.结果14例PNH患者病态淋巴细胞的百分率较病态的中性粒细胞和红细胞低;所有PNH患者均可检测到病态B淋巴细胞的存在,B淋巴细胞病态比例高于NK细胞和T细胞;在T细胞亚群中,抑制性T细胞病态比例高于辅助性T细胞(P＜0.001);病态T细胞上HLA-DR和CD45RO的表达率明显低于正常T细胞(CD59表达完全阳性的细胞)(P＜0.01),而其CD45RA的表达率明显高于正常T细胞(P＜0.01);病态T细胞经植物血凝素刺激后培养7 d,其CD45RA的表达率明显下降(中位数从82.7%降至26.6%),而CD45RO表达率明显升高(中位数由19.6%升至64.3%).结论PNH患者各种淋巴细胞及其亚群均存在病态细胞,B淋巴细胞上CD59的表达情况可作为诊断PNH的指标,病态的T淋巴细胞以无活性的初始细胞(CD45RA+HLA-DR-)为主,受到抗原刺激后,可获得有活性的记忆细胞表型(CD45RA+HLA-DR+).     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者T淋巴细胞对造血祖细胞的影响

目的：研究阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ＰＮＨ）患者的Ｔ淋巴细胞对造血祖细胞的影响。方法：将ＰＮＨ患者外周血制备的植物血凝素刺激的Ｔ淋巴细胞条件培养液（ＰＨＡＴＣＭ）加入造血祖细胞的培养基中，用于ＰＮＨ患者和正常人骨髓的粒巨噬细胞系集落形成单位（ＣＦＵＧＭ）和红系爆式集落形成单位（ＢＦＵＥ）的培养。结果：在含有初发ＰＮＨ患者的ＰＨＡＴＣＭ培养条件下，ＰＮＨ患者和正常人骨髓ＣＦＵＧＭ和ＢＦＵＥ数明显低于含有正常人ＰＨＡＴＣＭ培养条件下的集落数；在含有好转和治愈的ＰＮＨ患者的ＰＨＡＴＣＭ培养条件下，正常人骨髓ＣＦＵＧＭ和ＢＦＵＥ数增加和恢复到正常范围。结论：初发ＰＮＨ患者的Ｔ淋巴细胞对造血祖细胞的支持作用减弱，治愈的ＰＮＨ患者的Ｔ淋巴细胞对造血祖细胞的支持作用恢复正常     

CD59单抗封闭红细胞与阵发性睡眠性血红蛋白尿症溶血试验的研究

目的研究ＣＤ５９抗原与传统的阵发性睡眠性血红蛋白尿症溶血试验之间的关系。方法通过ＣＤ５９单抗封闭正常红细胞表面ＣＤ５９抗原的表达,并通过建立不同浓度的ＣＤ５９单抗封闭红细胞分别进行溶血试验检测。结果溶血试验中溶血程度与有ＣＤ５９抗原缺陷红细胞的比例呈直线正相关。当ＣＤ５９抗原缺陷红细胞所占比例小于１６％时,ＣＤ５９抗原缺陷红细胞在蛇毒因子溶血试验中的溶血程度最大,酸溶血试验次之。当ＣＤ５９单抗封闭红细胞所占比例大于１６％时,ＣＤ５９抗原缺陷红细胞在酸溶血试验中的溶血程度最大,蛇毒因子溶血试验次之。结论溶血试验的发生机制可能与ＣＤ５９等锚连蛋白的缺陷有关。蛇毒因子溶血试验在检出较小的ＣＤ５９抗原缺陷方面最为敏感。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血栓前状态的研究

目的：探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ＰＮＨ）患者易发生血栓形成的机制。方法：对２１例ＰＮＨ患者测定了１３项能反映血栓前状态的分子标志物或指标。结果：与正常对照比较，患者血浆纤维蛋白肽Ａ（ＦＰＡ）水平明显增高，抗凝血酶－Ⅲ（ＡＴ－Ⅲ）和蛋白Ｃ（ＰＣ）降低，血浆组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）活性明显降低，ｔ－ＰＡ抑制物（ＰＡＩ）活性增高。血红蛋白尿急性发作期上述凝血与纤溶指标的变化较静止期更显著，合并血栓形成者变化的幅度最大。患者血小板相关指标无明显变化，血浆内皮素－１（ＥＴ－１）和ｖＷＦ∶Ａｇ水平正常。结论：ＰＮＨ患者存在血栓前状态，其发生可能主要与凝血机制亢进和纤溶机能减弱有关。