超广谱β-内酰胺酶SHV-5的基因重组表达及酶活性鉴定

目的对blaSHV-5进行基因重组表达，为建立SHV类β-内酰胺酶抑制剂筛选模型研究奠定基础。方法以产blaSHV-5肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，自行设计一对寡核苷酸引物，通过PCR扩增获得blaSHV-5基因片断，定向克隆入质粒载体pBK—CMV构建重组质粒，对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序鉴定，重组质粒转化大肠埃希菌XL1-Blue MRF’后，Nitrocefin显色结合SDS—PAGE分析目的基因在大肠埃希菌中的表达及其酶活性。结果PCR扩增获得了大小约为900bp的DNA条带，定向克隆入质粒载体pBK—CMV后筛选到大小约为5．4kb的重组质粒，SacⅠ和EcoRⅠ双酶切后可切下大小约900bp的插入片段，DNA测序发现插入片断的基因序列与GenBank中肺炎克雷伯菌基因序列完全一致，重组质粒转化大肠埃希菌XL1-Blue MRF＇后可表达分子量约为31500的重组蛋白。重组菌裂解液对nitrocefin显示出较强水解活性。结论超广谱β-内酰胺酶SHV-5在大肠埃希菌XL1-Blue MRF＇中实现了基因重组表达。为进一步进行酶的纯化等相关后续研究奠定了基础。     

超广谱-内酰胺酶SHV-5的基因重组表达及酶活性鉴定

目的对blaSHV-5进行基因重组表达,为建立SHV类β-内酰胺酶抑制剂筛选模型研究奠定基础。方法以产blaSHV-5肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,自行设计一对寡核苷酸引物,通过PCR扩增获得blaSHV-5基因片断,定向克隆入质粒载体pBK-CM V构建重组质粒,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序鉴定,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后,N itrocefin显色结合SDS-PAGE分析目的基因在大肠埃希菌中的表达及其酶活性。结果PCR扩增获得了大小约为900bp的DNA条带,定向克隆入质粒载体pBK-CM V后筛选到大小约为5.4kb的重组质粒,S acⅠ和E coRⅠ双酶切后可切下大小约900bp的插入片段,DNA测序发现插入片断的基因序列与G enB ank中肺炎克雷伯菌基因序列完全一致,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后可表达分子量约为31500的重组蛋白。重组菌裂解液对n itrocefin显示出较强水解活性。结论超广谱β-内酰胺酶SHV-5在大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′中实现了基因重组表达。为进一步进行酶的纯化等相关后续研究奠定了基础。     

WWOX基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的 构建人WWOX基因真核细胞表达载体.方法 采用RT-PCR方法 ,从人新鲜卵巢组织的总RNA中扩增出1245 bp的人WWOX cDNA片段, 然后用Hind III和Eco RI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA 3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 WWOX基因的序列测定结果 与文献报道完全一致,其真核细胞表达载体被成功构建.结论 成功克隆出WWOX基因,并成功构建其真核细胞表达载体.     

胰高血糖素基因的合成、克隆与融合表达

选用Ｅ．ｃｏｌｉ偏爱的密码子，用计算机辅助设计合成了四段寡核苷酸序列，通过二步ＰＣＲ法构建胰高血糖皮素基因，总长１２４ｂｐ，并直接克隆在ｐＵＣ１８质粒中，序列分析证实合成与克隆的胰高血糖素基因序列与设计完全相符，将该基因引入质粒ｐＫＡ，使胰高糖素在ＡｎｓＢ的Ｃ端，实现融合表达，用ＥＬＩＳＡ和ＳＰＲ分别检测表达产物。     

SOD基因的组织结构、表达与分子克隆

超氧化物歧化酶（SOD）是一种天然的含金属抗氧化酶，它具有抗衰老、抗辐射和消炎等多种疗效。SOD包括Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三类，其中以Cu/Zn-SOD为最重要。SOD均由核内染色体上的基因编码，这类基因既有单拷贝序列，也有多基因家庭。线粒体和叶绿体内的SOD在核内合成后，再分泌到细胞器中。多数SOD基因的表达都具有组织特异性，并受许多环境因素的诱导，有关的分子机理正在研究中，并且正在尝试SOD基因的分子克隆以及重组SOD基因在培养细胞和转基因植物中的表达。     

Neuritin基因高表达系统构建及转染大鼠雪旺细胞的鉴定

目的构建neuritin基因的高表达系统,观察其转染雪旺细胞后neuritin的表达。方法根据大鼠neuritin mRNA序列体外合成编码序列(CDS区),构建到pGH载体,与酶切后的GV208-绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体片段进行连接、转化、酶切及测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆,转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞。将雪旺细胞分为三组:空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)、高表达组(C组)。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测细胞neuritin的表达。结果大鼠neuritin正确插入慢病毒载体,C组neuritin mRNA水平显著高于A组、B组(P<0.01)。检测到neuritin蛋白与GFP的融合蛋白。结论成功构建neuritin慢病毒高表达系统;其转染的雪旺细胞neuritin表达升高。     

稳定表达RASSFIA基因肝癌细胞株的建立

目的建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。方法真核表达载体pcDNA3．1( )RASSF1A经阳离子脂质体介导转染肝癌细胞株QGY-7703和Hep3B，通过G418筛选阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot鉴定目的基因的表达。结果(1)QGY-7703，Hep3B细胞株的G418最佳筛选浓度分别为800ug／ml和400ug／ml；(2)QGY-7703和Hep3B细胞株各获得2个稳定表达RASSF1A基因的细胞克隆。结论成功建立了稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。     

丙型肝炎病毒核心区基因的克隆，表达及抗原活性分析

本文通过逆转录（RT）－聚合酶链式反应（PCR）从一份来自甘肃武威地区献血员HCV阳性血中扩增并克隆到573bp的HCV核心基因全自段,用T－A克隆载体法将此片段接入克隆载体pUC19中,进行核苷酸序列测定后发现,武威地区分离株与HCV I型株HCV－I和HCV－II型株HCV－Hebei在该基因区段的核苷酸／氨基酸序列同源性分别为89．6％／95．4％和97．3％／97．4％。利用原核高效表达载体pTrCHisA在大肠杆菌中有效地表达了带有6个组氨酸的C区融合蛋白,通过中和抑制ELISA和Western-blot对占菌体总蛋白15％以上的表达产物进行了鉴定,有Probond resin column对表达产物进行了亲和层析纯化,纯化产物用于检测HCV阴阳性血清标本,初步表明该抗原有很好的免疫反应性和特异性,与日本东燃公司C11抗原活性和特异性基本一致。     

HP450基因的克隆及质粒载体的构建和鉴定

目的HP450基因的克隆载体构建.方法用RT-PCR技术克隆HP450基因,T-A连接到pMD18-T载体,经菌液PCR,酶切鉴定.构建成pMD18-HP450重组质粒载体.结果测序显示完全正确,实现了HP450基因的克隆和质粒载体的构建.结论可以对重组成功的HP450基因进行体外表达和动物的体内应用.     

幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白高效表达研究

目的高密度培养重组细菌和高效表达重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白。优化细菌培养和重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白表达的发酵工艺条件。重组细菌的培养条件：培养温度为35℃，培养基pH值为7．0～7．5，葡萄糖浓度为0．5％～2．0％，采用合理的策略控制发酵过程代谢副产物乙酸盐浓度不高于4mg/ml,，在BiofloⅢ发酵罐中，3批实验结果表明：重组细菌的平均生物量大约为60g/L发酵液(DCW)，重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白平均表达量为35％左右。     

枯草芽孢杆菌guaB基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆枯草芽孢杆菌guaB基因,构建穿梭表达载体,使其在大肠杆菌中获得表达,为构建鸟苷高产工程菌奠定基础。从枯草芽孢杆菌JSIM-G-518基因组扩增出guaB基因,将其连接到pMD19-T上,得到重组质粒pMD-guaB,进行测序和Blast比对分析。该重组质粒经PstI、BamHI双酶切,获得guaB片段连接至pHP13载体上,构建穿梭表达载体pHP13-guaB,并采用双酶切电泳进行鉴定。将该载体转化入大肠杆菌BL21中,通过SDS-PAGE电泳检测guaB基因的表达效果。克隆的guaB基因长度为1 510 bp,与GenBank登录的枯草芽孢杆菌同源性为99%,编码500个氨基酸,确认为控制IMP脱氢酶的基因。穿梭载体pHP13-guaB经双酶切后产生1 510 bp和4.9 kb两个期望的目的条带。SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量的大小为52.9 k,与预期的IMP脱氢酶分子量一致,且该目的蛋白的表达效果比对照组更明显。论文成功实现了枯草芽孢杆菌guaB基因在大肠杆菌中的表达。     

TAT-BDNF载体构建及融合蛋白表达

目的构建重组表达载体TAT-BDNF,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白,为研究TAT携带BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。方法经RT-PCR获得编码人BDNF的全基因序列,连接到原核表达载体pTAT上,得到重组表达载体pTAT-BDNF,转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-BDNF融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白。结果成功构建了TAT-BDNF融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白。结论为进一步研究TAT蛋白转导作用奠定了基础。     

重组人胸腺素α1融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高人胸腺素α1（Tα1）融合蛋白在大肠杆菌中的表达量，研究了本实验室构建的pET39-Tα1重组质粒在E.coli BL21（DE3）宿主菌中的表达条件。经SDS-PAGE和凝胶成像系统GDS-8000分析结果表明，重组菌以LB为培养基，卡那霉素浓度为50mg／L，开始诱导时的菌体密度为（OD600=0．5，所加IPTG的浓度为0．5mmol／L，27．5℃摇床200r／min振荡诱导培养10h时，可在周至空间中获得高效表达的可溶的Tα1融合蛋白，占周质蛋白总量的64．7％，为下一步纯化工作提供了方便。     

抗菌肽Cecropin B-肿瘤血管生长抑制因子 Kringle5融合蛋白表达载体的构建及其表达

通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽Cecropin B(CB)基因,从ThioA/L15-7上卸下肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)基因,将两者按正确的阅读框架融合并定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a上,构建成pET32a/CB-K5重组载体。重组载体转化BL21(DE3)细胞后,提取质粒进行PCR鉴定和序列分析,证明重组质粒pET32a/CB-K5阅读框架和融合基因序列均与预期相符。实验结果显示,成功地构建了抗菌肽CecropinB(CB)和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)融合蛋白的表达载体pET32a/CB-K5。转化E.coliBL21(DE3),SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,融合蛋白以包涵体的形式在重组转化菌株中获得高效表达,表达量达到菌体总蛋白的50%。     

Exendin-4与绿色荧光蛋白融合基因的表达与活性研究

目的:表达具有双功能特性的Exendin-4-GFP融合蛋白。方法:构建融合表达载体pET21a( )/Exendin-4-GFP,转化大肠杆菌BL21后,以IPTG诱导融合蛋白的表达,并利用镍金属螯合层析树脂对其进行纯化。采用胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)转染的CHO细胞考察融合蛋白的结合特性,并检测其生物活性。结果:含有融合表达载体的重组菌株诱导表达后,经SDS-PAGE及免疫印迹分析显示,31.0ku的融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,且具有Exendin-4的抗原活性。受体结合实验表明,该融合蛋白能够与GLP-1R特异性结合,在488nm激发光下呈现绿色荧光。体内活性实验表明,融合蛋白具有明显的降血糖活性。结论:本研究表达的Exendin-4-GFP融合蛋白同时具有Exendin-4的活性和荧光特性,为研究GLP-1受体功能以及Exendin-4与细胞相互作用的机制奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白IcDNA的克隆及分泌表达

克隆人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因全序列，并进行分泌表达。从人心肌组织提取总RNA，经逆转录得到cDNA第一链，以此为模板，PCR扩增目的条带，重新设计上游引物，用相同PCR程序完成点突变；突变后PCR产物克隆入Pfd5载体，并用PCR、SpeI XhoI双酶切、载体测序等方法鉴定；用ITPG诱导cTnI的表达。PCR扩增出630bp左右条带，Pfd5—cTnI融合表达载体用PCR、SpeI Xho1双酶切均可见630bp左右条带，测序结果与预期序列一致；诱导后培养基及细胞周质均检测到cTnI蛋白免疫原活性。人心肌肌钙蛋白I得到成功表达。     

微生物酶基因克隆与表达的初步尝试

且的探索微生物酶基因的克隆与表达,为新药的开发和利用寻找新途径。方法以黑曲霉M-1茵株总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,将扩增后的a-葡萄糖转苷酶CDNA重组到载体pSE380中构建重组质粒pSE-atg,并由其将此酶基因导入大肠杆菌BL21（DE7）．通过IPTG诱导剂诱导表达目的蛋白。结果黑曲霉M-1菌株总RNA适合作反转录PCR的模板;目标酶eDNA己正确连接到pSi80质粒上、并通过此质粒转移至大肠杆菌BL21（DE7）成功实现重组,且在重组大肠杆菌上的酶基因表达无误。结论十葡萄糖苷酶基因能被成功克隆与表达,这为新药的开发和利用开僻了一条新思路。     

人胰岛素样生长因子I基因的半合成及其克隆表达

将人胰岛素样生长因子 Ⅰ（ＩＧＦ－ Ｉ）基因克隆到 ｐＥＴ１１Ｃ中,构建成 ｐＥＴＩＧＦ－ Ｉ表达载体,完成人ＩＧＦ－Ｉ基因在大肠杆菌中的高表达。方法：利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ｉ基因的２条寡核苷酸片段,通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ｉ双链ＤＮＡ片段,然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中,构建ｐＴＶＩＧＦ－Ｉ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后,构建ＰＥＴＩＧＦ－Ｉ表达载体。结果：合成的人ＩＧＦ－Ｉ基因经测序证明与设计的一致,人 ＩＧＦ－ Ｉ基因在大肠杆菌中表达量高于 １０％。结论：选用大肠杆菌偏性密码子,小分子的人 ＩＧＦ－ Ｉ在大肠杆菌中可实现高表达