沙眼衣原体E型MOMP基因原核表达载体的构建和纯化

目的:构建沙眼衣原体E型主要外膜蛋白(MOMP)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌(BL-21)中融合表达,为沙眼衣原体疫苗的研究提供材料。方法:用PCR技术扩增E型沙眼衣原体MOMP基因片段,再将其定位插入到原核表达载体pGEX中,构建重组表达质粒。然后将重组表达质粒转化入大肠杆菌(BL-21)中,并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行了鉴定。然后诱导表达,用SDS-PAGE及蛋白印迹进行鉴定,然后进行蛋白纯化。结果:PCR扩增出约1202bp DNA片段,序列测定证实与GenBank登陆的E型沙眼衣原体一致;表达产物的相对分子量为66KD,与预期分子量相符,蛋白印迹证实表达产物为特异性蛋白,并纯化获得大量蛋白。结论:成功的构建了原核表达载体pGEX/MOMP,在大肠杆菌中得到了表达,并得到了纯化后的蛋白。     

沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpG的克隆、表达、纯化及鉴定

目的 克隆、表达、纯化E型沙眼衣原体多形外膜蛋白（PmpG）,并鉴定其免疫原性。方法 用PCR技术扩增从E型沙眼衣原体中提取的PmpG基因片段,再将其定向插入到原核表达载体PET30a（+）中,构建重组表达质粒,将其转化入E.coli DH5α中,并用酶切分析、PCR扩增及基因序列测定等对重组质粒进行鉴定,诱导表达后用SDS-PAGE及Western印迹进行鉴定,然后进行蛋白纯化,并免疫BALB/c小鼠鉴定其免疫原性。结果 PCR扩增出约1092 bp DNA片段,序列测定证实与基因库的E型沙眼衣原体一致;表达产物的相对分子质量为55 000,与预期分子量相符,Western印迹证实表达产物为特异性蛋白,纯化后的蛋白免疫小鼠获得抗原特异性抗体。结论 构建的PmpG原核表达载体在大肠杆菌中得到了表达,且具有免疫原性。     

pEGFP/MOMP真核表达重组体的构建及表达

目的：克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因，构建pEGFP／MOMP真核表达重组质粒，为沙眼衣原体核酸疫苗的研制提供依据．方法：用PCR方法从D型Ct基因组中扩增MOMP全基因片段，克隆人真核表达载体pEGFP相应的酶切位点中，阳性重组子经BanH I、Kpn I双酶切、PCR扩增及测序鉴定；并经脂质体介导转染HeLa细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果：PCR扩增得到约1．2kb的特异性MOMP基因片段；序列测定证实与GenBank卺录的D型沙眼衣原体一致；筛选鉴定出真核表达重组体pEGFP／MOMP。结论：成功地构建了pEGFP／MOMP真核表达重组体，并在HeLa细胞中表达了MOMP。     

TOPO定向克隆和表达Ⅱ型单纯疱疹病毒gG基因的免疫优势表位片段

目的 通过基因工程技术,克隆和表达Ⅱ型单纯疱疹病毒gG基因的免疫优势表位片段。方法 以PCR法扩增HSV-2的gG基因的免疫优势表位片段;将PCR产物与TOPO定向表达载体连接;然后鉴定含有目的基因的重组表达载体;并转化BL21Star^TM菌株诱导表达目的蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的蛋白。结果 PCR法扩增出616bp的DNA片段;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有616bp的DNA片段,其中99.5%序列与目的基因序列一致。SDS-PAGE结果显示重组蛋白在3h时的表达产量最高。免疫印迹法通过抗gG的单克隆抗体,证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达。结论 Ⅱ型单纯疱疹病毒的gG免疫优势表位基因片段的成功表达,为制备国产的HSV-2血清诊断试剂提供资料。     

沙眼衣原体热休克蛋白60基因的克隆和表达

目的 探讨克隆和表达沙眼衣原体热休克蛋白60(hsp60)基因.方法 PCR分离扩增hsp60的基因片段,纯化后双酶切,克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组表达载体pET-28a-hsp60.PCR、双酶切及测序鉴定.转染大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western印迹检测.结果 PCR与双酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆hsp60基因,测序结果与基因库公布的一致.SDS-PAGE检测表达产物.在相对分子量60 000处有表达条带.Western印迹鉴定是表达目的蛋白.纯化后纯度达90%以上,产量为17.85 mg/L.结论 构建pET-28a-hsp60重组体并成功表达可溶性hsp60蛋白.     

Ro60 cDNA的克隆及其重组杆状病毒表达载体的构建

目的 构建人Ro60cDNA的杆状病毒表达载体。方法 采用逆转录-PCR技术从Hela细胞RNA中扩增Ro60cDNA,定向插入杆状病毒转移载体pFastBacHTc,转化大肠杆菌DH10Bac进行转座,提取重组Bacmid,通过蓝白斑筛选和PCR进行鉴定。结果 成功从Hela细胞RNA中扩增出1.56kbRo60,所克隆的Ro60cDNA与已公布的序列完全符合,证明本克隆为Ro60cDNA的精确拷贝,并证实其目的基因与重组载体发生了特异转座和病毒重组,成功地构建了重组杆状病毒表达载体Bacmid-Ro60。结论 本实验成功克隆了Ro60cDNA并构建了其杆状病毒表达载体,为进一步表达Ro60蛋白和研究此抗原在红斑狼疮的发病机制奠定了基础。     

SV40T抗原基因转染正常人黑素细胞的研究

目的 研究SV40T抗原基因对体外培养的人正常黑素细胞的转化作用。方法 用阳离子聚合物Sofast^TM介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体SV40T-pEGFP导入原代培养的正常人黑素细胞进行稳定表达,G418筛选出阳性克隆,挑独立的单克隆扩大培养,检测SV40T抗原基因及SV40T蛋白在黑素细胞内的表达。结果 分离获得转化细胞阳性克隆。提取DNA及RNA后用PCR法成功扩增出288bp的片段,免疫组化及蛋白质印迹结果证实,转染黑素细胞核内有SV40T蛋白表达。结论 SV40T抗原基因可以成功诱导人黑素细胞的转化。     

沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpI的原核表达、纯化、抗体制备及鉴定

目的：克隆、表达沙眼衣原体多形外膜蛋白I（PmpI）基因，并进行免疫原性鉴定，分析其生物学特征。方法用生物信息软件分析沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpI的基因序列并预测PmpI蛋白的B细胞抗原表位。以D型沙眼衣原体DNA为模板，PCR扩增PmpI基因N端90~1464碱基序列，构建原核载体进行诱导表达。Ni离子亲合层析柱纯化重组蛋白，制备PmpI多克隆抗体并用Western印迹法检测其免疫原性。结果对蛋白质的二级结构和柔性区、氨基酸的亲水性、抗原指数和表面可及性预测结果综合分析，推测该蛋白含有8个优势B细胞表位。PCR扩增D型沙眼衣原体PmpI基因核苷酸序列长度为1375 bp。成功构建pET28a?PmpI原核表达重组体，经诱导表达、亲和层析纯化后获得了相对分子质量为50000的重组蛋白并制备其多克隆抗体。结论成功克隆并表达了D型沙眼衣原体多形外膜蛋白N?PmpI，为研究该蛋白的生物学功能奠定了一定基础。     

小鼠酸性哺乳动物壳多糖酶基因的表达及对真菌细胞壁的水解作用

目的 克隆和表达酸性哺乳动物壳多糖酶(AMCase),分析其对红色毛癣菌和白念珠菌细胞壁的水解作用。方法 从小鼠胃组织中提取总RNA,逆转录成cDNA,扩增AMCase基因,并构建融合表达载体pET28a(+)-AMCase,表达和纯化AMCase蛋白。测定AMCase与红色毛癣菌和白念珠菌细胞壁制备物作用后的N-乙酰氨基葡萄糖浓度。结果 成功克隆了小鼠AMCase基因,表达并纯化得到了AMCase蛋白,纯化后的AMCase可以水解红色毛癣菌和白念珠菌细胞壁。结论 在原核系统中成功表达的AMCase基因具有水解红色毛癣菌和白念珠菌细胞壁的活性,提示该蛋白具有潜在的抗真菌功能。     

淋病奈瑟菌mtrC膜蛋白基因的克隆和表达

目的 构建淋病奈瑟菌膜蛋白mtrC表达质粒,探讨淋病奈瑟菌耐药的检测和耐药机制.方法 从淋病奈瑟菌标准株中扩增淋病奈瑟菌膜蛋白mtrC基因片段.酶切后插入pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-mtrC.通过质粒双酶切和DNA测序证实该重组质粒构建正确.重组质粒转化入大肠杆菌DE3中.经IPTG诱导表达蛋白.结果 经酶切鉴定和测序分析,质粒构建正确.核苷酸序列与GeneBank(U14993)公布的序列相比较,同源性达到99.5%.通过IPTG诱导,SDS—PAGE可检测到约48500大小的融合蛋白,与预测分子量相同.结论 淋病奈瑟菌膜蛋白mtrC原核表达质粒构建和表达成功,为研究其mtrC外排系统的耐药机制打下基础.     

D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3的克隆、表达、鉴定及其免疫原性初探

【摘要】 目的 获得D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3基因及其蛋白,并鉴定其免疫原性。 方法 PCR扩增目的基因,将其定向插入原核表达载体pGEX-6P-1中,连接产物转化入大肠埃希菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序、PCR鉴定。再将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21并诱导表达,Western印迹鉴定目的蛋白,谷胱甘肽巯基转移酶（GST）磁珠纯化pgp3-GST融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫新西兰家兔,Western印迹检测抗体与pgp3蛋白的结合,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗体效价。 结果 克隆目的基因序列长度为795 bp,与基因库中一致,Western印迹显示目的蛋白相对分子质量为54 000,并得到纯化蛋白。所得兔血清可识别pgp3蛋白,ELISA检测多克隆抗体效价达1 ∶ 25 600。 结论 成功表达具有强免疫原性的pgp3-GST融合蛋白,为进一步研究奠定基础。     

重组原核表达载体pGEX-4T-1-eIF5A的构建及表达

目的构建人eIF5A基因的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pGEX-4T-1-eIF5A融合蛋白。方法以pCMV6-XL4-eIF5A作为模板,经PCR技术扩增目的片段,将获得的目的片段重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,经酶切鉴定、DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-eIF5A转化到E.coliBL21内,经IPTG诱导后,GSTpull-down后SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测人eIF5A的表达。结果成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-eIF5A,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致,GSTpull-down后电泳分析以及Westernblot结果说明大肠杆菌BL21诱导后表达出人eIF5A的glutathioneS-transferase(GST)融合蛋白。功能研究初步证明重组eIF5A在细胞增殖过程中发挥重要作用。结论构建成功的重组原核表达载体能在E.coliBL21内表达eIF5A的GST融合蛋白,为进一步研究人eIF5A蛋白的结构和生理功能如促进创伤修复提供帮助。     

人乳头瘤病毒11型E6的原核表达

目的　构建、克隆人乳头瘤病毒 11型 (HPV11)E6蛋白基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法　用PCR法 ,从尖锐湿疣 (CA)标本中扩增出HPV 11型E6蛋白基因 ,与 pET3 2a载体连接成重组表达质粒pET3 2a/E6;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达硫氧还蛋白E6融合蛋白 (Trx E6) ;该蛋白经 3SNTAResin纯化柱纯化 ,SDS PAGE和WesternBlotting检测鉴定。 结果　经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒 pET3 2a/E6成功构建 ,诱导后高表达Trx E6融合蛋白 ,WesternBlotting鉴定证实表达蛋白分子量为 3 60 0 0D的Trx E6融合蛋白。结论　获得高表达、高纯度的HPV11E6蛋白 ,为该蛋白的功能及免疫学分析及CA的疫苗研究打下了基础。     

人黑素浓集素受体1抗原表位肽的表达、纯化及其在白癜风患者中的检测

目的 表达及纯化人黑素浓集素受体1抗原表位肽,探讨其在白癜风患者自身抗体检测中的应用。方法 人黑素浓集素受体1抗原表位肽编码基因合成后克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和Western印迹鉴定目的蛋白表达。以提取的黑素细胞膜蛋白作为阻断抗原,进行阻断ELISA分析。以目的蛋白为抗原,检测100例进展期白癜风患者和30例正常人血清IgG抗体情况。结果 成功构建重组表达载体,重组蛋白成功表达并纯化,上样量低于0.0625 μg时纯化率达100％。目的蛋白与白癜风患者血清IgG抗体间的结合能被天然黑素细胞膜抗原抑制。100例进展期白癜风患者血清中有36例与目的蛋白结合反应呈阳性。结论 成功表达并纯化了人黑素浓集素受体1抗原表位肽,该目的蛋白能够结合白癜风患者血清中IgG抗体,可以用于抗人黑素浓集素受体1抗体的检测。     

人酪氨酸酶抗原表位肽的表达、纯化及生物学活性分析

目的 探讨人酪氨酸酶抗原表位肽在白癜风患者自身抗体检测中的表达.方法 目的基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE分析和蛋白质印迹鉴定目的蛋白表达,ELISA检测其生物学活性.结果 成功构建重组表达载体,SDS-PAGE和蛋白质印迹结果表明,重组蛋白成功表达.应用凝胶分析系统分析蛋白表达量发现,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的90%.融合蛋白经过试剂盒纯化后,其蛋白纯度达95%以上.ELISA检测纯化蛋白的生物学活性,结果表明,纯化蛋白具有结合白癜风患者IgG的能力.结论 成功表达了人酪氨酸酶抗原表位肽,其表达蛋白具有生物学活性.