杜氏盐藻叶绿体转化载体pDS16S-CAT的构建

目的:利用同源重组方法,将外源基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)转入杜氏盐藻叶绿体中.方法:以杜氏盐藻叶绿体16S rRNA序列为同源片段,构建盐藻叶绿体表达载体,并利用基因枪法转化盐藻,使CAT基因得到表达.结果:转化后的盐藻可以在含有氯霉素的培养基中生存3～4周,表明CAT基因已转入盐藻叶绿体中并表达.结论:盐藻叶绿体转化是可行的,为获得稳定转化的盐藻,需要合适的同源片段.     

杜氏盐藻叶绿体16S rRNA基因的克隆

目的：克隆和鉴定杜氏盐藻叶绿体16Sr RNA基因。方法：根据衣藻、小球藻等绿藻叶绿体16Sr RNA基因序列,利用软件分析找出其高度保守区,据此设计引物,PCR扩增杜氏盐藻叶绿体16Sr RNA序列,并与莱茵衣藻、普通小球藻、绿肾藻和原始绿藻Mesostigma Vivide进行同源性比较。结果：序列分析表明所克隆的序列1110bp与莱茵衣藻、普通小球藻、绿肾藻和原始绿藻Mesostigma Vivjde 4种绿藻的序列同源性分别为85．0％、79.9％、81．3％和81．6％。结论：本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻的叶绿体16S rRNA基因。     

杜氏盐藻叶绿体转化载体pchlN-CAT-BAR的构建

目的：利用同源重组方法将外源选择标记基因转入杜氏盐藻叶绿体中并表达。方法：以光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶chlN基因为同源片段,以氯霉素乙酰转移酶（cat）基因和除草剂草丁膦（PPT）抗性bar基因为选择标记,构建盐藻叶绿体转化载体pchlN-CAT-BAR,并通过基因枪法转入野生型盐藻细胞,筛选转化藻株。对转化株和野生对照组的细胞计数结果进行统计学分析。结果：在200mg/L氯霉素的选择下,野生型盐藻12d左右死亡,转化藻仍正常生长,再经4mg/LPPT继代筛选3～5代,得到表达氯霉素和PPT抗性的盐藻转化株。盐藻转化株和野生株1个月内藻株生长差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：以chlN基因作为同源片段构建盐藻叶绿体转化载体是可行的。     

杜氏盐藻叶绿体转化载体pUC-chlN1622-CAT的构建

目的:构建杜氏盐藻叶绿体转化载体pUC-chlN1622-氯霉素乙酰转移酶(CAT)。方法:以光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶chlN基因为同源片段,以CAT抗性基因为选择标记,构建盐藻叶绿体转化载体pUC-chlN1622-CAT,并通过电击法转入野生型盐藻细胞,筛选转化藻株。结果:在氯霉素浓度为300mg/L的选择压力下,野生型盐藻10d左右死亡,转化藻仍正常生长,得到表达氯霉素抗性的盐藻转化株。结论:以chlN基因作为同源片段构建盐藻叶绿体转化载体是可行的。     

杜氏盐藻高纯度叶绿体DNA的提取

目的:分离大量完整的杜氏盐藻叶绿体,提取高纯度的叶绿体DNA(cpDNA).方法:取对数生长后期的杜氏盐藻细胞进行高压破碎,利用差速离心和蔗糖密度梯度离心得到完整的叶绿体.采用优化的SDS-蛋白酶K-酚/氯仿/异戊醇方案抽提cpDNA,并经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.结果:蔗糖密度梯度离心结果表明分离到了大量的叶绿体,相差显微镜及电镜观察证实所得叶绿体的完整性.紫外分光光度仪检测3个批次cpDNA的浓度蛋白酶为(2.21±0.02) mg/L,A(260 nm)/A(280 nm)为(1.772±0.012).结论:获得了高纯度的杜氏盐藻cpDNA,为进行叶绿体的转化研究奠定了实验基础.     

杜氏盐藻荧光素酶基因表达载体的构建

目的：构建盐藻荧光素酶基因表达载体。方法：分别用合适的限制性内切酶消化载体pGL3-Enhancer vector、pD—B、pMD—CA和pMD—rbcS,胶回收适当的片段,T4 DNA连接酶过夜连接,转化宿主菌大肠杆菌JM109。挑取阳性克隆,提取质粒DNA,酶切鉴定。结果：得到含盐藻自身启动子碳酸酐酶(CA)基因启动子、双倍重复碳酸酐酶(DCA)基因启动子和来自衣藻的1,5二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶小亚基(rbcS)基因启动子,以及荧光素酶(Luc)基因为外源基因的3个盐藻表达载体。结论：构建了3个杜氏盐藻荧光素酶表达载体。     

含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体表达载体的构建

目的:构建含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体。方法:采用RT-PCR的方法,获得含有人canstatin的cDNA片段以及分别在5’UTR下游和3’UTR上游添加了翻译增强序列(UUAACUUUA)的人canstatin cDNA片段,将得到的目的片段分别连接到PMD18-T载体上,利用该载体将目的片段连接到荧光素酶基因Lux Ct表达盒中并进行酶切鉴定。结果:RT-PCR分别得到约700 bp的cDNA片段并克隆到PMD18-T载体上。用PaeR7Ⅰ、SphⅠ双酶切Lux Ct质粒,得到2 100 bp和10 000 bp的2条片段。然后,将大片段回收后分别与上一步得到的cDNA片段进行连接,酶切鉴定结果显示含有翻译增强序列的人canstatin片段成功插入到Lux Ct质粒中。结论:成功构建了含有翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体。     

莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻中转录活性的检测

目的：验证莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的转录活性。方法：以绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)为报告基因,将报告基因插入莱茵衣藻叶绿体atpA启动子与rbcL终止子之间,构建载体pSP71-atpA—EGFP,用基因枪法转入杜氏盐藻叶绿体中,通过荧光显微镜观察EGFP基因在atpA启动子控制下的表达,以验证atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性。结果：荧光显微镜下观察到：EGFP在杜氏盐藻叶绿体中得到了表达。结论：莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中有转录起始活性,可以应用于杜氏盐藻的叶绿体转化。     

PCR法扩增盐藻叶绿体atpA基因

目的：克隆杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段。方法：把GenBank中近10种藻类的atpA全基因的氨基酸序列进行比较,设计简并引物,利用PCR方法从盐藻叶绿体DNA中扩增atpA基因片段,然后胶回收所扩片段并与T—vector相连,转化大肠杆菌JM109,挑阳性克隆鉴定,并测序,再将序列与所选藻类有关序列比较同源性。结果：从盐藻叶绿体基因组中扩增出约400bp的片段。测序结果显示此片段长405bp,推导的氨基酸序列与莱茵衣藻的同源性为920k,,普通小球藻为88％,,原始绿藻为87％,卵形肾藻为86％,Cyanidioschyzon merolae为85％。结论：本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻的叶绿体atpA基因片段。     

人canstatin基因转化盐藻反应器真核表达载体的构建

目的:构建人canstatin基因转化盐藻反应器的真核表达载体.方法:采用RT-PCR扩增得到人canstatin cDNA,克隆到pMD18-T载体形成pMD18-T/Can重组质粒.对pMD18-T/Can进行酶切鉴定和测序鉴定,将鉴定正确的canstatin基因定向连接到真核表达载体pUΩ上,然后连接上筛选标记bar盒,构建了含有人canstatin基因的真核表达载体pUΩ-Can-Bar.结果与结论:鉴定结果显示,转化盐藻反应器的真核表达载体pUΩ-Can-Bar构建成功.     

藻类及陆生高等植物叶绿体16S rRNA基因进化谱系及同源性分析

目的：了解杜氏盐藻与其他藻类和高等植物间的亲缘关系。方法：将杜氏盐藻的叶绿体16S rRNA序列与一些藻类和陆生植物叶绿体的16S rRNA序列资料进行同源性比较与分析,并构建进化树。结果：进化树显示整个植物界明显分为3个大的类群：蓝藻门、红藻门、隐藻门、金藻门、褐藻门、硅藻门和甲藻门形成一个类群,裸藻门单独形成一个类群,而绿藻门和陆生高等植物共同形成一个大的类群。陆生高等植物间的亲缘关系非常近,拥有一个共同的绿藻祖先,而杜氏盐藻、莱菌衣藻等所归属的团藻目则与其他绿藻及高等植物分离,独立形成一个极为分散的类群。结论：杜氏盐藻所隶属的团藻目属于较为原始的绿藻,彼此之间亲缘关系较远,而且与进化主干上的其他绿藻及高等植物较早分离。     

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用。结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性。在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1。结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白。