sFRP-2抑制皮肤恶性黑色素瘤增殖的实验研究

目的观察sFRP-2在皮肤恶性黑色素瘤细胞系和组织中的表达及对皮肤恶性黑色素瘤细胞A375增殖的影响,并探讨其作用机制。方法通过qRT-PCR和免疫组化实验,分析sFRP-2在皮肤恶性黑色素瘤细胞系和组织中的表达及在皮肤恶性黑色素瘤中的临床病理特征。选取sFRP-2基因表达最低的A375细胞作为实验研究对象;分别感染慢病毒载体p LVX-Gfp-sFRP-2(实验组)和pLVX-Gfp-NC(对照组);免疫蛋白印迹实验验证sFRP-2的过表达;细胞增殖实验和克隆形成实验分析sFRP-2基因对细胞增殖的影响;免疫蛋白印迹实验验证sFRP-2对WNT/β-catenin信号通路的影响。结果与正常色素痣相比,sFRP-2 m RNA和蛋白在皮肤恶性黑色素瘤细胞和组织中的表达下调(P0.001);过表达sFRP-2后,细胞活性和增殖能力明显受到抑制(P0.001),而且WNT/β-catenin信号通路及其下游细胞因子明显受到抑制。结论 sFRP-2在人皮肤恶性黑色素瘤组织中表达下调,通过拮抗Wnt/β-catenin信号通路参与皮肤恶性黑色素瘤的进展。     

miR-let-7b通过调控相关细胞周期蛋白影响皮肤黑色素瘤的增殖和凋亡

目的:探讨mi R-let-7b通过调控相关细胞周期蛋白影响皮肤黑色素瘤的增殖和凋亡。方法:q PCR法检测mi R-let-7b在黑色素瘤组织和细胞株中的表达情况;双荧光素酶报告基因检测mi R-let-7b与CCND1之间的相互作用;MTT增殖实验检测抑制mi R-let-7b后黑色素瘤细胞的增殖能力的变化情况;流式细胞术检测抑制mi R-let-7b后黑色素瘤细胞的凋亡行为的变化情况。结果:与癌旁正常皮肤组织相比,黑色素瘤组织中mi R-let-7b的表达水平相对上调,与其他黑色素瘤细胞株相比,A375细胞中mi R-let-7b表达最高;双荧光素酶实验证实mi R-let-7b能与CCND1的3’UTR特异性结合,可以调控CCND1的表达与活性;抑制mi R-let-7b的表达后可以抑制黑色素瘤细胞的增殖能力;同时可以促进黑色素瘤细胞的凋亡行为。结论:mi R-let-7b可以调控CCND1的表达从而影响黑色素瘤细胞的增殖和凋亡。     

地西他滨对恶性黑色素瘤细胞A375增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:研究甲基化抑制剂地西他滨对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖、凋亡及侵袭的影响。方法:采用不同浓度的地西他滨对A375细胞进行干预,用MTT实验检测地西他滨对细胞增殖的影响,用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化,划痕愈合实验及Transwell小室实验观察细胞体外迁徙侵袭能力的改变。结果:与对照组相比,地西他滨组A375细胞的增殖活性受到明显抑制,凋亡比例显著增加,体外迁移和侵袭能力减弱,差异有统计学意义(P0.05),地西他滨对A375细胞周期的影响则无显著差异(P0.05)。结论:地西他滨能抑制恶性黑色素瘤A375细胞的增殖,其抗肿瘤效应有可能成为恶性黑色素瘤治疗的新途径。     

串珠素shRNA慢病毒颗粒转染对小鼠胚胎成纤维细胞增殖能力的影响

目的 通过研究串珠素shRNA慢病毒转染对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)增殖能力的影响,探讨其在抑制硬膜外瘢痕形成中的作用和机制.方法培养小鼠NIH3T3,并分为3组:未转染的NIH3T3组(对照组)、GFP慢病毒颗粒转染组(GFP组)和串珠素shRNA慢病毒颗粒转染组(shRNA组).GFP组和shRNA组转染1周后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况,从而判断慢病毒载体转染目的细胞所需的合适MOI值及GFP表达时间.确定慢病毒载体转染目的细胞合适的MOI值后,以此条件进行目的基因转染.用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞.分别以逆转录聚合酶链反应[RT-PCR)、Western blot及噻唑蓝(MTT)法来检测转染后细胞mRNA、蛋白质表达及细胞增殖水平的差异. 结果 RT-PCR检测表明,串珠素RNA在对照组与GFP组高表达,在shRNA组低表达,shRNA组分别与对照组和GFP组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测表明,串珠素蛋白质水平在对照组与GFP组高表达,在shRNA组低表达,shRNA组分别于对照组和GFP组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).1～2d各组吸光度值之间差异无统计学意义(P＞0.05).3～6d对照组与GFP组细胞增殖接近正常,shRNA组细胞增殖能力减弱,对照组与GFP组增殖能力明显高于,shRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 串珠素shRNA慢病毒转染可以有效抑制NIH3T3的增殖能力.     

重组腺相关病毒介导的MDA-7基因对人肝癌细胞的选择性凋亡诱导效应

目的 探讨PEG启动子调控腺相关病人毒介导的黑色素瘤分化相关基因MDA-7对肝癌细胞的选择性凋亡诱导效应.方法 以重组腺相关病人毒rAAV-PEG-MDA-7表达系统感染人肝癌细胞株HepG2细胞和正常人肝细胞株LO2细胞,Westerm Blot检测转染细胞内MDA-7蛋白,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术分析细胞周期、Annexin-Ⅴ、线粒体跨膜电位(△Ψm),RT-PCR检测bcl-2基因mRNA.结果 重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA7可特异性转染HepG2细胞,MDA7蛋白在HepG2细胞中高效表达,并呈时间依赖性;重组腺相关病毒rAAV-PEC-MDA-7可抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,细胞周期分析处于G0/G1期细胞百分比明显增多,处于G2/M期的细胞减少,并且可见到较明显的凋亡峰的形成,从24 h开始Annexin-Ⅴ阳性细胞比例增多,△Ψm降低,抗凋亡基因bcl-2 mRNA表达降低.而重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA-7对LO2细胞无类似效应.结论 构建出的重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA-7表达系统可选择性抑制肝癌细胞增殖和诱导其凋亡,其诱导凋亡机制受到bcl-2家族经线粒体途径的调节.     

靶向RNA干扰骨桥蛋白基因的慢病毒载体对血管平滑肌细胞增殖凋亡的影响

目的 构建大鼠骨桥蛋白(OPN)基因的shRNA慢病毒表达载体,并观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响.方法 针对OPN基因的不同部位设计3对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到慢病毒载体PLKO.1中,构建靶向OPN基因的慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA,检测并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体.并将其转染大鼠血管平滑肌细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VSMCs OPN mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测VSMC OPN蛋白表达水平;噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测沉默OPN基因后对VSMC增殖和凋亡能力的影响.结果 靶向OPN慢病毒表达载体构建成功.重组慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA转染后可显著抑制VSMCs的OPN mRNA及蛋白的表达水平,OPN蛋白表达明显下降,其中以PLKO.1-OPN2-shRNA最为明显,达到90％以上;转染PLKO.1-OPN2-shRNA后72 h的细胞增殖能力[吸光度(A)值=0.365 ±0.011]明显低于未处理组(A值=0.941±0.028)和阴性对照组细胞(A值=0.941±0.040,P＜0.05);而早期细胞凋亡率(20.44±2.69)％和晚期细胞凋亡率(16.79±1.01)％均明显高于未转染组和阴性对照组(P＜0.01).结论 成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向OPN慢病毒表达载体PLKO.1-OPN2-shRNA,该载体能有效抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖,并促进细胞凋亡.     

异阿魏酸抑制人肾癌细胞A-498增殖和诱导凋亡的机制研究

目的:探究异阿魏酸(isoferulic acid,IFA)抑制人肾癌细胞A-498增殖,诱导细胞凋亡的作用机制。方法:本研究通过克隆形成实验和CCK-8增殖检测实验考察IFA对人肾癌细胞A-498增殖能力的影响;用Annexin V-FITC/PI双染色法检测IFA对A-498细胞凋亡的影响;用免疫印迹法检测IFA对PARP和caspase-3活性的影响,并测定IFA对β-catenin和c-Myc蛋白表达水平的影响。结果:IFA显著抑制人肾癌细胞A-498细胞克隆的增殖活性,促进A-498细胞凋亡,并诱导cleaved PARP和cleaved caspase-3的表达;同时,IFA可以剂量依赖地下调β-catenin和c-Myc的表达,诱导细胞凋亡。结论:IFA下调β-catenin和c-Myc的表达,诱导A-498细胞凋亡,抑制A-498细胞增殖,是治疗肾癌的潜在候选化合物。     

慢病毒介导的microRNA-21-siRNA对肝癌细胞系HepG2生物学行为的影响

目的 通过构建慢病毒介导( lentivirus,LV)的microRNA-21-siRNA,探讨下调microRNA-21对肝癌细胞系HepG2生物学行为的影响.方法 针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体pGCSIL-GFP,将重组microRNA-21-RNAi-LV转染肝细胞癌HepG2.体外设为干扰组(microRNA-21 -siRNA,SI组)、阴性对照组(negative control,NC组)和正常组(normal,N组);分别采用聚合酶链反应方法检测microRNA-21目的基因的表达的情况;用噻唑蓝比色法检测增殖情况、transwell小室迁移实验检测迁移情况、Hochest33258凋亡实验检测凋亡情况.体内实验设为SI组和NC组,观察反义microRNA-21对裸鼠移植瘤生长的影响.结果 (1)micmRNA-21 -RNAi-LV可显著降低microRNA-21的表达.(2) MTT实验96h后SI组增殖能力显著低于NC组和N组(P=0.0031,P＜0.05).(3)迁移能力减弱(P =0.0004,P＜0.05).(4)SI组细胞凋亡明显增加,促凋亡基因caspase3基因表达上调(P =0.0002,P＜0.05).(5)各组裸鼠皮下肿瘤生长比较差异无统计学意义(P=0.0624,P＞0.05).结论 microRNA-21 -siRNA通过抑制microRNA-21的表达抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,降低其迁移能力.     

Ad-aVEGF165基因在裸鼠体内对人皮肤恶性黑色素瘤的影响

目的 探讨Ad-aVEGF165基因转染对裸鼠体内人恶性黑色素瘤生长的影响。方法 裸鼠皮下接种人恶性黑色素瘤细胞（A375），1周后瘤块形成并转种和分组干预。随机分为PBS组、Ad-GFP组、Ad-aVEGF组，进行大体观察和组织形态学观察，检测Ad-aVEGF165基因的表达、微血管密度、凋亡指标的变化。结果 成功地建立了裸鼠荷瘤模型；Ad-aVEGF165能抑制体内肿瘤的生长，没有观察到明显的毒副作用；组织学切片能观察GFP基因的表达。Ad-aVEGF组有较多的组织坏死，但其对A375，细胞的凋亡没有明显的影响。Ad-aVEGF165能够抑制A375细胞VEGF的表达，并导致肿瘤的MVD明显减少。结论 Ad-aVEGF165干预人恶性黑色素瘤是可行的，其机理是通过局部缺血而不是通过凋亡起作用的。     

过表达cMA3结构域增加黑色素瘤B16细胞对达卡巴嗪的药物敏感性

目的研究过表达c MA3结构域增强黑色素瘤B16细胞对达卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)敏感性的影响及机制。方法利用脂质体转染使黑色素瘤B16细胞过表达c MA3结构域;使用实时PCR明确转染情况;分别使用CCK-8细胞增殖活力检测、流式细胞周期检测、流式细胞凋亡检测、Western-bloting凋亡蛋白检测转c MA3过表达质粒组与转空质粒组B16细胞在有无低剂量DTIC作用时的增殖活力、细胞周期、凋亡情况及凋亡蛋白的表达。结果转c MA3过表达质粒组的黑素瘤B16细胞的增殖活力可被低剂量(100μmol/L)DTIC抑制,而转空质粒组细胞的增殖活力不受影响。⑴B16细胞的细胞周期被低剂量DTIC阻滞于G2/M期;⑵B16细胞可被低剂量DTIC诱导凋亡;⑶B16细胞的凋亡相关蛋白表达可被低剂量DTIC影响。结论过表达c MA3结构域可以提高黑色素瘤B16细胞对DTIC的敏感性。     

miR-1470对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨miR-1470对人肝细胞癌增殖和凋亡的影响。 方法 采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测人正常肝细胞株（LO2）和人肝癌细胞株（HepG2、Hep3B、Huh7）中miR-1470的差异表达；采用慢病毒转染肝癌细胞株，过表达（HepG2细胞株，过表达组）或敲减miR-1470（Huh7细胞株，抑制组）后，qPCR检测各组细胞miR-1470的表达；CCK8法检测细胞增殖改变；流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 miR-1470在肝癌细胞系HepG2、Hep3B和Huh7中的表达水平高于正常肝细 胞系LO2，HepG2、Hep3B、Huh7三种细胞系相对正常细胞表达量分别为：2.304±0.366、2.851±0.508、 5.768±0.445（均P＜0.05）。CCK8实验证实，过表达miR-1470组OD值在72 h显著高于对照组（P＜0.05），而抑制组显著低于对照组（P＜0.05）。流式细胞分析结果显示过表达miR-1470抑制肝癌细胞的凋亡（P＜0.05）；而miR-1470抑制组对比对照组，凋亡细胞显著增多（P＜0.05）。结论 miR-1470促进肝癌细胞增殖，抑制肝癌细胞凋亡。     

Notch1调控PI3K/AKT信号通路促进黑素瘤细胞发展的研究

目的:分析Notch1在黑素瘤发展过程中的作用和机制。方法:采用RT-PCR检测Notch1 mRNA在黑素瘤和正常黑素细胞中的表达,采用慢病毒转染技术构建Notch1过表达的黑色素瘤细胞系,CCK法检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞侵袭能力,划线法检测细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡能力,Westernblot检测细胞Notch1过表达对PI3K/AKT信号通路中AKT磷酸化水平的影响。结果:黑素瘤细胞系MM200、Mel-CV、A2058和A375细胞中Notch1mRNA水平明显高于正常黑素细胞系HemN-MP(P0.05)。黑素瘤细胞A2058细胞中Notch1水平升高后,细胞的增殖速率显著提高,在48h、72h和96h转染组细胞增殖能力明显高于对照组(P0.05);Transwell结果显示Notch1水平升高可以显著增加穿过小室膜A2058细胞数量(P0.05);划线法结果显示24h转染组细胞迁移率明显高于对照组(P0.05);流式细胞检测结果显示转染组细胞早期凋亡率明显低于对照组(P0.05)。Notch1水平增加后,AKT蛋白磷酸化水平明显提高,说明Notch1能够促进PI3K/AKT信号通路的激活。加入了Notch信号通路特异性阻断剂DAPT后,能够有效抑制Notch1过表达引起的AKT蛋白磷酸化的升高。结论:Notch1能够调节PI3K/AKT信号通路通过促进黑素瘤的发展,本研究为临床治疗黑素瘤提供了新的思路。     

微小RNA-29b-1*和微小RNA-29c对膀胱癌T24细胞增殖的影响

目的 观察微小RNA(miR)-29b-1*和miR-29c对膀胱癌T24细胞的活性和增殖的影响.方法 构建携带目标miRNAs干扰基因的慢病毒(pGCsil-H1-CMV-GFP)载体、阳性克隆的聚合酶链反应(PCR)鉴定.用293T细胞包装慢病毒形成慢病毒重组体,并用孔稀释法测定滴度.T24细胞中转染慢病毒重组体及转染效率测定.用噻唑蓝(MTT)比色法对4组处于对数生长期的实验组[空细胞对照组、转染阴性对照慢病毒细胞组、转染miR-29b-1*基因RNA干扰(RNAi)慢病毒细胞组、转染miR-29c基因RNAi慢病毒细胞组]进行连续5d的细胞增殖分析.结果 实时定量PCR(Real-time PCR)验证结果显示:T24细胞中miR-29b-1 *和miR-29c表达水平比较于空细胞组分别为3.47和4.40;MTT比色法显示,转染阴性对照慢病毒细胞组与空细胞对照组细胞比较,增殖受到轻度抑制;而转染miR-29b-1*、miR-29c基因RNAi慢病毒细胞组与染阴性对照慢病毒细胞组和空细胞对照组细胞比较,增殖均受到明显抑制,前者抑制效果更明显.结论 细胞增殖MTT法分析显示通过RNAi降低miR-29b-1*、miR-29c的表达均能引起T24细胞的增殖抑制.     

微小RNA let-7c慢病毒载体的构建及过表达研究

目的 构建微小RNA let-7c重组慢病毒载体,验证转染该载体系统后对肝癌细胞增殖的影响 方法 构建表达含494bp let-7c基因的重组慢病毒载体,检测let-7c及对照组病毒滴度分别为5.01×10E8 TU/m1、5.15×10E8TU/ml;转染HepG2细胞,以荧光定量聚合酶链反应(PCR)对let-7e表达水平进行检测;细胞计数试剂盒(CCK-8)试验评价let-7c过表达后对HepG2细胞增殖的影响.结果 构建的let-7c慢病毒载体经质粒酶切和测序鉴定正确;转染HepG2细胞72 h后,let-7c表达上调312倍;CCK-8法检测显示HepG2细胞增殖受到明显抑制(P＜0.01).结论 成功构建Iet-7c重组慢病毒载体并感染HepG2细胞后高效表达成熟let-7c,抑制了HepG2肝癌细胞的增殖.     

shRNA稳定抑制XIAP和survivin表达对胰腺癌细胞生物学特征的影响

目的:探讨慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术对胰腺癌细胞X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和生存素(survivin)的抑制作用及对胰腺癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响。方法:应用pGCSIL-PUR和pGCSIL-NEO分别构建针对XIAP和survivin的shRNA慢病毒载体,转染胰腺癌细胞株SW1990和Panc-1,经嘌呤霉素和新霉素筛选并扩大培养得到稳定转染株;实时荧光定量PCR和Western blot检测胰腺癌细胞内XIAP和survivin的表达;MTT法检测细胞增殖和化疗敏感性;caspase-3/7活性测定和DAPI染色分析细胞凋亡情况。结果:筛选XIAP和survivin的有效干扰靶点后,获得XIAP和survivin表达稳定抑制的SW1990和Panc-1细胞株。MTT检测显示稳定抑制XIAP或survivin后,两种胰腺癌细胞增殖均明显减弱,且两者联合抑制后作用增强;虽然抑制XIAP或survivin后对两种胰腺癌细胞凋亡无明显影响,但能明显增加其对化疗药物(5-FU,吉西他滨)的敏感性,且两者联合抑制后作用明显增强。结论:慢病毒载体介导的靶向XIAP和survivin的RNAi可有效抑制XIAP和survivin的表达,降低胰腺癌细胞的增殖能力并增强其对化疗药物的敏感性,且两者联合具有协同作用。     

携带人胰岛素基因慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究

目的构建共表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin)基因的慢病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的转染情况,为今后组织工程脂肪构建与体内回植研究奠定基础。方法采用DNA重组技术,将insulin基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-EGFP中,筛选阳性克隆,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带目的基因的质粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP共同转染到293T细胞内包装病毒,荧光倒置相差显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况。收集病毒上清,纯化浓缩,测定重组病毒的滴度。取足月儿脐带以组织块培养法分离培养hUCMSCs,以不同感染复数(multiple of infection,MOI,分别为0、1、3、5、7、10、15、20)的重组慢病毒感染hUCMSCs,通过报告基因绿色荧光蛋白的表达筛选最适MOI;以最适MOI重组慢病毒感染hUCMSCs,应用实时荧光定量PCR及Western blot法分别检测细胞中insulin基因及insulin蛋白水平的表达情况。结果成功构建了共表达insulin基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并对其成功包装、纯化及浓缩,病毒滴度为1.3×108TU/mL。不同MOI的重组慢病毒感染hUCMSCs后,通过绿色荧光蛋白表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为10,此时对细胞的转染效率可达到90%。实时荧光定量PCR检测示转染组insulin mRNA表达阳性,未转染组为阴性;Western blot检测示转染组细胞内及上清液insulin蛋白表达阳性,未转染组均为阴性。结论构建的携带insulin基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP可有效转染hUCMSCs,表达insulin蛋白。     

Survivin siRNA纳米载体的制备及其对胰腺癌细胞生物学特性的影响

目的：利用纳米技术和基因干扰技术设计并合成携载survivin siRNA的纳米载体,探讨survivins iRNA纳米微粒对人胰腺癌细胞BXPC-3增殖和凋亡的影响。方法：体外培养人胰腺癌BXPC-3细胞,将BXPC-3细胞随机分为4组：生理盐水组、不含基因的纳米微粒组、survivin siRNA组和s urvivins iRNA纳米微粒组。RT-PCR检测survivin mRNA的表达;Wes tern blot法检测s urvivin蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;MTT法检测细胞增殖情况。结果：细胞培养72 h后,survivin siRNA纳米微粒组细胞的survivin mRNA和蛋白表达均低于其他3组（P〈0.05）。survivin siRNA纳米微粒组细胞增殖明显受抑制,生长缓慢,而细胞凋亡率高于其他3组（P〈0.05）。结论：survivin siRNA纳米微粒能够有效减少胰腺癌BXPC-3细胞survivin mRNA和蛋白的表达,提高肿瘤细胞的凋亡,显著抑制BX-PC-3细胞的增殖。     

血管内皮细胞生长因子促进肝内胆管细胞癌生长的机制研究

目的探究血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体对肝内胆管细胞癌（ICC）细胞生长调控的作用机制。 方法Western blotting检测VEGF在12例ICC患者肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达水平。采用外源性重组人源VEGF（rhVEGF）处理ICC细胞株Huh28后,采用细胞计数检测细胞生长情况,5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。Western blotting检测rhVEGF处理后Huh28细胞中VEGF受体VEGFR1及VEGFR2的表达情况。使用特异性抗体分别阻断VEGFR1及VEGFR2,通过ELISA法检测细胞的凋亡水平。采用慢病毒shRNA构建稳定敲低VEGFR2的ICC细胞株Huh28-shVEGFR2（实验组）和对照细胞株Huh28-shNC（对照组）。采用Huh28-shVEGFR2及Huh28-shNC细胞在10只裸鼠中构建皮下瘤模型,观察肿瘤的生长情况。 结果VEGF在ICC肿瘤组织中蛋白表达水平上调,显著高于癌旁正常组织（P<0.01）。外源性rhVEGF可以促进Huh28细胞生长,抑制细胞凋亡,而对细胞增殖能力无明显影响。rhVEGF处理后Huh28细胞中磷酸化的VEGFR1及VEGFR2表达水平升高（P<0.05）。VEGFR2抗体可以显著逆转rhVEGF介导的抗凋亡作用（P<0.05）,而VEGFR1抗体则无明显效果。皮下瘤模型结果显示,与对照组相比,肿瘤生长在实验组中受到显著抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。 结论VEGF是通过VEGFR2依赖的信号通路抑制ICC细胞凋亡,从而促进ICC细胞生长。     

血管生长抑素基因联合生长抑素治疗人胰腺癌的体外研究

目的 探讨血管生长抑素基因联合生长抑素在体外对人胰腺癌细胞BXPC-3和血管内皮细胞ECV-304增殖的抑制作用.方法 重组pcDNA3/angio质粒转染人胰腺癌细胞BXPC-3,利用RT-PCR和Western blot检测其表达及分泌血管生长抑素的情况;MTT法和流式细胞仪检测生长抑素和血管生长抑素对BXPC-3和ECV-304细胞增殖的影响.结果 转染后的BXPC-3细胞表达并分泌血管生长抑素.一定浓度(≥10μg/ml)的生长抑素对BXPC-3细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.01),并在一定浓度范围内呈剂量依赖性,同时能诱导BXPC-3细胞凋亡(P<0.01);但其对ECV-304细胞的增殖无明显影响(P>0.05).血管生长抑素对ECV-304细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.01),并能诱导其凋亡(P<0.01);但对BXPC-3细胞的增殖无明显影响(P>0.05).血管生长抑素联合生长抑素对BXPC-3及ECV-304细胞的增殖均有明显抑制作用(P<0.01),也可诱导其凋亡(P<0.01),但无协同增强效应.结论 ①生长抑素主要通过直接抑制胰腺癌细胞增殖、促进其凋亡而发挥抗胰腺癌作用;在体外其对血管内皮细胞无抑制作用.②血管生长抑素主要通过特异性地抑制胰腺癌血管内皮细胞的增殖并诱导其凋亡,从而抑制新生毛细血管的生成,致胰腺癌细胞坏死和肿瘤消退.     

胰岛素基因转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白支架构建组织工程脂肪的研究

目的 探讨携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细细( human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)与丝素蛋白支架在体外构建组织工程化脂肪(tissue engineering adipose)的可行性.方法 以最适感染复数(MOI)为10重组慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP转染hUCMSCs组为实验组(A组),EGFP基因转染组为对照组(B组);将两组细胞接种于丝素蛋白支架,观察细胞在支架上的生长及黏附情况;尔后行细胞-支架复合物成脂诱导.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测重组慢病毒转染对hUCMSCs生长增殖的影响以及基因转染后的hUCMSCs在丝素蛋白支架上的活性.结果 细胞-支架复合物成脂诱导5～7 d后,见A组支架内脂肪样细胞数量明显多于B组,差异有显著统计学意义(P=0.007,P＜0.01);逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测显示,A组hUCMSCs表达的成脂特异性基因PPARγ-2明显高于B组.MTT法检测结果显示,转染重组慢病毒的hUCMSCs与未转染组各时间点吸光度A值比较,差异均无统计学意义(P=0.056,P＞0.05).细胞组与细胞支架组A值比较,差异无统计学意义(P=0.066,P＞0.05).结论 转染胰岛素基因的hUCMSCs成脂分化能力明显提高,且能有效地与丝素蛋白支架在体外构建组织工程化脂肪.