脱细胞基质载体和表皮细胞结合构建尿道的实验研究

目的探索组织工程修复技术在尿道构建中的应用前景。方法采用同种异体家兔膀胱,经显微外科分离和脱细胞液处理,制成无细胞的生物支架,12只雄兔随机分为成实验和对照2组,剥离实验对象尿道黏膜2cm;实验组切取小块兔包皮组织,消化收集分离出的表皮细胞,经过增殖、传代培养,植入生物支架中,培养2周,并加入Brdu标记物,将其卷成管状,植入实验组人工尿道缺损区域;对照组单纯采用无细胞植入的生物支架修复尿道;术前和术后1、2、6个月每组各处死2只家兔/批,分别行尿道造影、大体外形、修复段尿道黏膜的HE染色、免疫组化和荧光标记。结果术后动物伤口愈合正常,排尿通畅,无尿瘘发生。修复尿道大体形态和尿道造影显示带细胞修复的尿道形态完整,清晰宽敞,无狭窄发生;术后1个月,HE和免疫组化显示,修复段尿道黏膜层次单一,缺乏复层和乳头结构。术后2个月基本恢复正常尿道结构,复层上皮结构形成,角蛋白染色阳性。术后6个月黏膜复层上皮结构更为丰富,角蛋白染色阳性;Brdu标记在术后1个月清晰显示植入上皮细胞层存在,术后2个月植入的原始上皮细胞显影稀少。术后6个月尿道黏膜结构中未见显影;而单纯生物支架修复组的实验对象则出现排尿变细,任何观察时段,均出...     

脱细胞膀胱粘膜下筋膜修复尿道的实验研究

目的探索组织工程方法在尿道修复中的应用。方法将12只雄兔作为实验对象,切除部分尿道的全周粘膜,长度分1cm以内(Ⅰ组)和2cm以上(Ⅱ组)两组,将制备完成的同种家兔膀胱粘膜下脱细胞筋膜用可吸收线,缝合到尿道缺损处,术后2周、6周分别处死一批实验对象,通过尿道造影,大体观察,修复段组织切片HE染色光镜研究和免疫组化等来研究修复段尿道的解剖和组织学变化。结果Ⅰ组仅1只(1/6)发生尿瘘,其余尿道造影显示尿道基本通畅；而Ⅱ组4只(4/6)发生狭窄(不伴尿瘘),1只(1/6)发生尿瘘；术后2周两组植入筋膜依然存在；术后6周时,尿道植入筋膜已降解,Ⅰ组的修复段尿道已全部被宿主自身粘膜所覆盖,粘膜光洁完整,管腔无明显狭小；Ⅱ组的修复段尿道中间苍白增厚,致密坚硬且管腔狭小。结论单纯脱细胞膀胱粘膜下筋膜能修复短距离兔尿道缺损,而对长距离缺损修复效果不理想。     

尿道细胞外基质修复尿道缺损的研究

目的 寻求一种较理想的尿道修复材料。方法 20只家兔尿道制成尿道细胞外基质(ECM)；另40只随机分3组：尿道ECM移植组(实验组)，对照组Ⅰ及对照组Ⅱ。实验组切除尿道1．O～1．5cm后用尿道ECM修复并于术后10d、3周、6周及24周行组织再生情况观察；另于术后10周、24周各取4只行膀胱尿道造影；24周时实验组及对照组Ⅰ各取4只行尿流动力学检测；24周实验组取4只行尿道镜检查。结果 缺损修复术后10d，基质中见单层上皮细胞且有血管长入ECM；3周时尿道ECM管腔已完全被上皮细胞覆盖；6周时可见平滑肌细胞再生，炎性细胞消失；24周后其组织结构与正常组织相比差异无统计学意义。膀胱尿道造影无尿液外渗，无梗阻及结石形成。尿流动力学检测结果实验组与对照组Ⅰ差异无统计学意义；尿道镜检查证实尿道黏膜完整光滑，尿道内径及其形态正常。结论 尿道细胞外基质是一种理想的尿道修复材料。     

冻干无细胞膀胱黏膜下基质修复兔尿道缺损

目的　探讨冻干无细胞膀胱黏膜下基质修复尿道缺损的效果。方法　应用反复冻融-酶法及冷冻干燥技术制备冻干无细胞人体膀胱黏膜下基质。 18只新西兰白兔建立尿道中段部分缺损模型 ,尿道缺损面积约 1 0cm× 0 5cm。其中 14只兔作为实验组 ,以冻干无细胞膀胱黏膜下基质修补尿道缺损 ,术后 1、2、3、4、8、12、2 4周分别取 2只行逆行性尿道造影 ,观察尿道情况 ,并采取尿道组织进行大体、组织学及超微结构观察 ;4只兔作为对照组 ,未采用任何材料修补尿道缺损 ,直接缝合尿道海绵体包膜、皮下组织及阴茎皮肤 ,术后 2、4周分别取 2只行逆行性尿道造影 ,采取尿道组织进行大体观察。结果　实验组 14只兔均未发现明显的尿道狭窄。冻干无细胞膀胱黏膜下基质组织相容性良好 ,移植后无细胞膀胱黏膜下基质内有细胞长入 ,新生血管形成 ,术后 2周无细胞膀胱黏膜下基质移植区完全上皮化。随着移植时间的延长 ,移植区胶原纤维排列由紊乱趋于规则。结论　冻干无细胞膀胱黏膜下基质能够诱导尿道黏膜细胞迁徙、生长和上皮化 ,初步认为可以作为尿道缺损修复材料。     

组织工程化膀胱壁复层结构的体外构建

目的 探讨膀胱缺损组织工程修复方法.方法 机械法去除膀胱黏膜层、肌层和浆膜层,仅保留膀胱黏膜下层.经SDS、Trixon-100和三蒸水处理去除细胞结构,制备获得膀胱脱细胞基质移植物(BAMG)作为支架材料.取成年猪膀胱壁,机械法分离膀胱肌层和黏膜层.以酶消化法分别获取膀胱尿路上皮细胞和平滑肌细胞.常规细胞传代和扩增后,将膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞分别接种在BAMG浆膜面和黏膜面.细胞-材料复合物体外培养4周并行组织学鉴定.结果 HE和Masson染色鉴定发现,BAMG以胶原成分为主,内部未见明显细胞残留.免疫荧光方法鉴定结果显示,膀胱尿路上皮细胞uroplakin Ⅱ阳性,膀胱平滑肌细胞α-平滑肌肌动蛋白阳性.体外培养4周后,BAMG浆膜面和黏膜面分别形成连续的复层结构尿路上皮层和膀胱平滑肌层,免疫组化显示平滑肌层α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,尿路上皮层广谱角蛋白表达阳性.结论 以膀胱脱细胞材料作为支架,尿路上皮细胞和膀胱平滑肌细胞作为种子细胞,能够在体外构建形成包含膀胱黏膜层及平滑肌层的复层膀胱壁结构.细胞-材料复合物的体外构建将为体内膀胱缺损的组织工程修复提供实验依据.     

口腔黏膜细胞与膀胱黏膜下脱细胞基质复合物构建组织工程化尿道的实验研究

目的 探讨以兔口腔黏膜细胞与同种异体膀胱黏膜下脱细胞基质(BAMG)复合物构建组织工程化尿道的可行性.方法 新西兰雄性兔24只,距尿道外口2.0 cm剥离尿道黏膜(2.0 cm×0.8 cm)后,随机分实验组和对照组,每组12只.切取实验组兔口腔黏膜组织分离细胞,在有灭活的3T3细胞培养皿上进行培养扩增,将培养获得的第2代口腔黏膜细胞种植于BAMG(2.2 cm×1.0 cm)上,植入实验组兔尿道缺损区域;对照组单纯采用无细胞植入的BAMG修复尿道.分别于术后1、2、6个月观察动物排尿情况,行尿道造影,8 F尿管插管确定有无狭窄;随后处死实验兔,取修复段尿道黏膜组织行组织学检查.结果 细胞培养获得的口腔黏膜细胞形态均一,生长良好;组织形态学、扫描电镜观察见口腔黏膜细胞与BAMG具有良好的相容性.实验组兔术后1、2、6个月伤口愈合良好、排尿通畅,无尿瘘发生,组织学和尿道造影检查显示带细胞修复的尿道形态完整、清晰宽敞,无狭窄发生;术后6个月植入的口腔黏膜细胞仍然存在,并明显扩增.对照组兔则出现排尿困难、尿道狭窄,光镜下发现黏膜及黏膜下存在严重的炎症反应.结论 兔口腔黏膜细胞与同种异体BAMG复合后,可成功用于尿道缺损的修复,构建组织工程化尿道.     

尿道细胞外基质的研制

目的 探讨尿道细胞外基质(ECM)的制备方法。方法 采用4因素3水平，9次实验的正交设计[L9(3^4)]。切取37只兔的尿道，27条按正交设计随机分为9组行尿道脱细胞处理，试验重复3次。采用HE染色及计算机图像分析对尿道基质进行残余细胞成分计数，统计分析获得最佳方法：0．4％胰蛋白酶、l％甲醛加0．2％戊二醛、40U／ml DNA酶(A3B2C3方案)。另l0条兔尿道制备成尿道ECM并用于同种异体尿道缺损修复实验；分别于修复术后l0d，3、6及24周取材观察缺损修复处组织再生情况。结果 各组脱细胞后残余细胞成分量均不相同，第7、9组未发现细胞残余成分；制备的尿道ECM经扫描电镜分析未发观细胞残片。缺损修复实验术后10d，基质中见单层上皮细胞，且有血管长入ECM中，但管径较小，基质和受体尿道连接处有炎性细胞浸润；3周时尿道ECM管腔已完全被上皮细胞覆盖；6周时可见平滑肌细胞再生，炎性细胞消失。24周后基本结构近似正常。结论 制备尿道细胞外基质中3个关键条件的最佳水平为A3B2C3，即在尿道脱细胞处理过程中采用0．4％胰蛋白酶、1％甲醛加0．2％戊二醛、40U／ml DNA酶。     

组织工程尿道粘膜的体外构建

目的:利用组织工程方法在体外构建形成尿道粘膜结构。方法:酶消化法获得猪膀胱尿路上皮细胞(UC),以免疫荧光和RT-PCR方法进行UC鉴定。制备膀胱脱细胞基质移植物(BAMG)作为支架材料,以苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组化和扫描电镜进行评价。经过体外培养和扩增后,将P3代UC接种在BAMG上。结果:BAMG支架上的UC经过体外培养1周后即可形成沿基膜排列的复层上皮结构。扫描电镜显示细胞-材料复合良好,免疫组化检测支架上的UC广谱角蛋白表达阳性。结论:运用组织工程方法能够在体外快速进行尿道粘膜上皮结构的初步构建,为进一步临床修复诸如尿道下裂、尿道狭窄等尿道缺损奠定技术基础。     

应用异体脱细胞尿道基质修复尿道缺损

目的探讨应用同种脱细胞尿道基质修复尿道缺损的可行性。方法将14只雄性新西兰兔分为两组，切除实验组长约1.0～1．5cm的尿道，用相应长度脱细胞尿道基质修复；对照组行假手术。术后行尿道造影并取尿道标本作病理检查。结果12只实验兔的脱细胞基质移植物没有移位。除2例狭窄、2例尿瘘外，其余满意效果。病理检测示，术后3周尿道管腔上皮化，6个月基质中平滑肌及血管再生明显。结论同种脱细胞尿道基质材料可以修复兔尿道部分缺损。     

同种脱细胞软骨基质与软骨细胞复合物修复兔甲状软骨缺损的实验研究

目的 探讨脱细胞软骨基质(acelluar cartilaginous matrix，ACM)与软骨细胞复合后植入兔体内，能否形成软骨修复甲状软骨缺损。方法 分离培养免甲状软骨细胞，与ACM体外复合培养，形成ACM-软骨细胞复合物，进行组织学分析及用于修复兔甲状软骨缺损。新西兰大白兔18只，制成两侧甲状软骨缺损模型，随机分为3组，每组6只。对照组：只制备缺损，不作修复；ACM修复组：采用单纯ACM修复缺损；实验组：用ACM-软骨细胞复合物修复。术后8周处死动物，取出标本，进行大体和组织学观察。结果 体外培养时，软骨细胞能在ACM表面生长，未长入基质内。动物实验结果，对照组：甲状软骨缺损处被肌肉、结缔组织充填；ACM修复组：ACM内炎性细胞浸润，轻度吸收变形；实验组：复合物植人体内后8周未形成软骨，甲状软骨缺损修复不理想。结论 ACM体外培养和体内植入均未能为软骨细胞生长提供支持，作为一种天然细胞培养支架，尚有待进一步改进与完善。