流感嗜血杆菌表型和脉冲场凝胶电泳分型研究

目的 应用生物学分型、血清学分型和脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)分析临床分离流感嗜血杆菌的表型和分子分型特征,了解流感嗜血杆菌的分子流行病学规律.方法 1988年和2004-2007年期间,成都市儿童医院从患者的下呼吸道分泌物分离培养273株流感嗜血杆菌,菌株的分离培养与鉴定参照美国<临床微生物手册>.菌株的生物学分型和血清学分型分别参照Kilian和Pittman分类法.应用PCR方法对所有的菌株进行荚膜鉴定和血清学分型鉴定.随机选择100株流感嗜血杆菌菌株,应用PFGE技术进行分子分型研究.结果 273株流感嗜血杆菌可分为8个生物型.17.6%(48/273)的菌株为生物型I型,43.6%(119/273)为生物型Ⅱ型,22.7%(62/273)为生物型Ⅲ型,7.3%(20/273)为生物型Ⅳ型,5.9%(16/273)为生物型V型,0.4%(1/273)为生物型Ⅵ型,1.8%(5/273)为生物型Ⅶ型,0.7%(2/273)为生物型Ⅷ型.99.6%(272/273)的菌株为无荚膜的、血清学不可分型的流感嗜血杆菌,1株为血清型f型.100株流感嗜血杆菌经PFGE分析,可分为96个PFGE基因型,93株菌株各自代表一个PFGE基因型.基因型的分布与菌株的分离时间无明显的相关性.结论 引起儿童下呼吸道感染的流感嗜血杆菌主要是无荚膜的、不可分型流感嗜血杆菌菌株,生物型主要是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型.血清学不可分型流感嗜血杆菌菌株PFGE基因型呈现明显的多态性,菌株的分子多态性可能是流感嗜血杆菌感染在成都市没有形成暴发与流行的分子流行病学原因;PFGE基因分型与生物学分型和血清学分型比较,具有很强的菌株分辨能力,是流感嗜血杆菌感染流行病学研究适用的分析方法.     

致病性钩端螺旋体脉冲场凝胶电泳图谱分型研究

目的 建立我国15群15型钩端螺旋体标准菌株染色体DNA脉冲场凝胶电泳图谱,进行致病性钩体的分子遗传学分类鉴定。方法 采用低熔点琼脂糖凝胶块直接纯化钩体菌完整的染色体DNA,用限制性内切酶NotI消化后,进行脉冲场凝胶电泳分离。结果 从50-1000kb范围的DNA片段得到很好的分离效果。我国常见15群15型国内标准菌株各具特异性脉冲场凝胶电泳图谱。结论 脉冲场凝胶电泳图谱可对钩体菌进行遗传学分类鉴定,这在钩体病分子流行病学研究中具有重要意义。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的脉冲场凝胶电泳分型研究

目的　探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)的分子流行病学特点。方法　采用脉冲场凝胶电泳 (PFGE)技术对我院在 2 0 0 1年 6月～ 2 0 0 2年 4月临床分离的 5 0株MRSA作同源性分析。结果　 5 0株MRSA的PFGE图谱分为 6个组 (A～F型 )。以A型 (2 7株 )、B型 (10株 )、C型 (10株 )流行为主。 5 0株MRSA中共有 17株和重症监护室 (ICU)相关 ,占 34%。流行菌株在各病房之间传播。结论　ICU是MRSA的高发区域和疫源地 ,神经外科、肝胆胰外科和干部病房中MRSA的分离率也较高。在同一病人不同时间不同部位所采集的菌株同源性不尽相同     

无锡市2009年副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳分型研究

目的分析无锡市2009年副溶血性弧菌分子特征,以及细菌性食物中毒分离的菌株与菌株之间、食源性疾病监测分离的副溶血性弧菌之间的遗传相关性,建立无锡地区副溶血性弧菌分子分型数据库,为无锡市进行食源性疾病的快速反应和预警、监测和控制提供科学依据。方法脉冲场凝胶电泳（PFGE）对菌株进行分子分型,所得结果以BioNumericsV4.0软件UPGMA方法进行聚类分析。结果 21株菌以SfiⅠ酶切后可分为9个PFGE型别,各群间相似性系数〉60%。其中有两起食物中毒菌株DNA指纹图谱完全相同,食源性疾病监测分离株分属7个型别。3型和6型为全年的优势型别。结论 3型和6型为无锡市2009年副溶血性弧菌优势型别,需加强防范。     

香港海鸥形菌DNA脉冲场凝胶电泳的技术条件

目的 探索香港海鸥形菌（Laribacter hongkongensis,LH）DNA脉冲场凝胶电泳技术的条件。方法 从2株LH参考株中提取DNA,经过限制性内切酶SpeI的切割,再用脉冲场凝胶电泳仪进行DNA分子分型,比较5种条件的分型效果。结果 在OD值为1.8、细胞裂解4 h、SpeI 20U酶切20 h、电泳脉冲时间为2.2～54.2 s、电泳25 h的条件下,LH基因组DNA片段得到良好分离。结论 上述条件产生的LH DNA指纹图谱图像清晰,分辨率高,在没有图像分析仪的情况下,肉眼即可进行判断。证实所建方法可行,条件适合。     

脉冲场凝胶电泳技术的发展和应用现状

近年来发展起来的脉冲场凝胶电泳技术（ＰＦＧＥ），使电泳分离双链ＤＮＡ分子的上限由原来的５０ｋｂ跃迁到１００００ｋｂ以上。这一高度的分辨力使它的应用范围已涉及到细菌、病毒基因组及哺乳类基因的大小测定、酵母人工染色体文库的建立、染色体制图、基因定位等，并已渗透到分子微生物学及分子流行病学的研究，为分子生物学及遗传学的研究提供了强有力的手段。     

脉冲场凝胶电泳分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的探索一种准确、快速、可靠的分子生物学分型方法，研究耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）的流行病学。方法建立脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）的分子生物学分型方法。将细菌包埋于琼脂块中，原位溶解细菌，ＳｍａⅠ消化染色体ＤＮＡ，经脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）分离，比较染色体限制性内切酶图谱，确定菌株的亲缘关系。结果３８株ＭＲＳＡ的ＰＦＧＥ谱分１０组（Ａ～Ｊ），以Ａ型为主，Ａ型又有Ａ１～Ａ４四个亚型。１９９５年１１月～１９９６年３月发生了Ａ１亚型株暴发流行，从１８位住院病人共分离到２２株。暴发流行株在住院病人、各病房及各医院之间进行传播。结论对ＭＲＳＡ的流行病学进行研究，ＰＦＧＥ是一种准确、可靠、重复性好的分子生物学分型方法。     

脉冲场凝胶电泳应用于医院感染阴沟肠杆菌的分子流行病学

目的 建立一种快速、可靠和准确的分子方法来研究感染阴沟肠杆菌分子流行病学。方法 利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）结合低频限制性内切酶技术对阴沟肠杆菌染色体DNA进行分析。细菌包埋在低熔点琼脂糖中,经染色体DNA的原位纯化后,用低频限制性内切酶XbaⅠ进行染色体DNA的原位消化。使用PFGE对限制性酶切片段分离。通过对染色体DNA限制性内切酶谱比较,确定菌株亲缘关系。结果 28株医院感染阴沟肠杆菌呈17种克隆的多克隆构成。1998年1月至6月未曾发生阴沟肠杆菌医院感染的大规模暴发流行,但在3月5日到5月15日间有2次小型的克隆传播,即A、B克隆,分别都涉及5株菌。结论 PFGE具有分辨力高、重复性好的特点,是微生物实验室调查阴沟肠杆菌分子流行病学较好的方法。     

应用脉冲凝胶电泳技术分析肺炎克雷伯菌染色体多态性

目的 利用脉冲凝胶电泳(PFGE)技术探讨肺炎克雷伯菌3个亚种临床分离株核型特征。方法 用XbaI酶切各试验菌株染色体DNA，经脉冲凝胶电泳分离酶切片段。结果 PFGE法将28株细菌分为15个型和亚型，较准确地显示各菌株染色体多态性，并筛选出亚种间的差异DNA片段。结论 脉冲凝胶电泳技术分析肺炎克雷伯菌基因型准确、可靠，是用于流行病学监测的有效方法。     

广东省腹泻病例非伤寒沙门菌耐药谱和PFGE分型研究

目的 了解广东省腹泻病例非伤寒沙门菌的耐药状况,并对多重耐药菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型研究.方法 利用血清学方法对2009-2011年广东省腹泻病例分离的非伤寒沙门菌进行分型,并用CLSI( Clinical and Laboratory Standards Institute)推荐的纸片法对分离的沙门菌株进行抗生素敏感性检测,采用PFGE进行分型研究.结果 91.76％ (256/279)的鼠伤寒沙门菌对3种及以上抗生素耐药,40株鼠伤寒沙门菌同时对9种及以上抗生素耐药,其中有3株对全部12种抗生素耐药.96.91％ (94/97)的I4,5,12:i:-沙门菌对3种及以上抗生素耐药,9株14,5,12:i:-沙门菌同时对9种及以上抗生素耐药,其中有1株对全部12种抗生素耐药.47％(47/100)的肠炎沙门菌对3种及以上抗生素耐药,其中1株对9种及以土抗生素耐药.环内沙星的耐药率为4.27％( 27/632),其中,17株为鼠伤寒沙门菌,6株为14,5,12:i:-沙门菌.31.96％( 202/632)的沙门菌对环丙沙星显示为中介敏感性.这些多重耐药的菌株和具有相同耐药谱的菌株PFGE指纹图谱不完全一致,PFGE型别存在明显的遗传多样性.结论 广东省非伤寒沙门菌多重耐药现象严重.多重耐药菌株的PFGE型别多样,存在明显的遗传多样性.继续加强耐药监测和控制抗生素的合理使用刻不容缓.     

布鲁菌S2株感染巨噬细胞与树突状细胞的比较

目的 比较猪布鲁菌S2菌株感染巨噬细胞和树突状细胞(DC)的特点.方法 采用瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞形态并计算吞噬率;用ELISA法测定细胞培养上清中的IL-12和TNF-α以及与T细胞共培养上清中IFN-γ和IL-4的含量;用annexin-V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 感染S2菌株1h后巨噬细胞的吞噬率为(43.6±4.8)％,显著高于DC的吞噬率(13.08±2.36)％ (P ＜0.05);正常巨噬细胞凋亡率为(3.09±1.21)％感染S2菌株后6、12和24h的凋亡率分别为(19.89±1.36)％、(22.73±2.21)％和(42.44±3.12)％,明显高于DC感染后相同时间点的凋亡率(P＜0.05),正常DC凋亡率为(1.82±0.01)％,DC感染S2菌株6、12、24h凋亡率分别为(3.76±0.13)％、(7.87±0.56)％和(9.08±0.23)％.巨噬细胞在感染S2菌株后24、48 h分泌的IL-12均明显低于DC分泌IL-12的量(P＜0.05);24、48、72 h分泌的TNF-α量均明显低于DC(P ＜0.01);在24、48、72 h与T细胞共培养分泌的IFN-γ含量均明显低于DC(P＜0.01).结论 巨噬细胞吞噬猪布鲁菌S2菌株的能力高于DC,猪布鲁菌S2感染后巨噬细胞的凋亡率高于DC,感染S2菌株后DC的活化及提呈抗原并激活T细胞的能力强于巨噬细胞.     

2000年-2004年杭州地区副溶血弧菌分离株的PFGE和RAPD分型

应用脉冲场凝胶电泳（pulse field gel electrophoresis,PFGE）及随机放大多态性DNA分析（random amplified polymorphicDNA analysis,RAPD）方法对2000年-2004年在杭州地区分离的03：K6型和O4：K8型致病性副溶血弧菌菌株进行分子分型,探讨近年杭州地区分离的O3：K6型和O4：K8型副溶血弧菌菌株与国际“大流行”O3：K6型菌株间的关系.     

布鲁菌S2株诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡及免疫激活的研究

目的:研究猪布鲁菌S2株诱导巨噬细胞(M(φ))的凋亡、活化及对T淋巴细胞的激活作用.方法:用猪布鲁菌S2株体外感染M(φ),并以大肠埃希菌作为对照,采用瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪测定感染后24小时M(φ)的凋亡率;ELISA法检测感染后不同时间点M(φ)培养上清中IL-12和TNF-α及感染后M(φ)与T细胞共培养上清中IFN-γ的含量的变化.结果:瑞氏-姬姆萨染色显示布鲁菌S2株感染M(φ)后1小时体积明显增大,突起增多,胞浆内可见大量布鲁菌;6小时细胞内细菌减少,但胞膜仍完整;至12小时细胞核固缩,胞膜失去完整性.流式细胞仪检测结果显示,感染后24小时M(φ)的凋亡率均明显高于正常对照组及大肠埃希菌感染组(P＜0.05).ELISA结果显示S2株感染M(φ)12、24、48小时的上清中IL-12和TNF-α含量均明显高于正常对照组(P＜0.01),S2株感染后M(φ)与T细胞共培养24、48、72小时产生的IFN-γ量高于正常对照组(P＜0.05),但低于大肠埃希菌感染组(P＜0.01).结论:S2株可以引起M(φ)的凋亡,同时可诱导M(φ)活化,产生IL-12和TNF-α;布鲁菌感染后的M(φ)可诱导T细胞活化,产生IFN-γ免疫应答.     

应用IRS-PCR对金黄色葡萄球菌分型的研究

目的探讨低频限制性位点聚合酶链反应(infrequent-restriction-site PCR，IRS-PCR)在金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)基因分型中的应用价值。方法建立本实验室IRS-PCR方法。同时用IRS-PCR和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对金葡菌进行基因分型。根据49株社区感染分离菌的分型结果计算辨别力指数(ID)值估计分辨力。对其中30株社区感染菌重复实验一次估计重复性。比较两种基因分型方法的分型率、分辨力、重复性、结果的一致率及操作特点。结果建立IRS-PCR对金葡菌基因分型的方法。70株金葡菌均可被2种方法分型，分型率100％。IRS-PCR分为38个型，21株院内感染菌分为6个型，49株社区感染菌分为32个型，计算ID值为0．981。PFGE分为40个型，21株院内感染菌分为6个型，49株社区感染菌分为34个型，计算ID值为0．983。两种分型方法的重复性均为100％。对院内感染菌，两种方法分型的一致率为100％；对社区感染菌，两种方法分型的一致率为92％(45／49)。与PFGE相比，IRS-PCR更简单、省时、易于操作、不需特殊昂贵仪器。结论IRS-PCR能对金葡菌简易快速可靠分型，适合检验科对临床标本的快速有效分型，是一种有价值的分子流行病学研究工具。     

布鲁菌重要毒力调控基因在环境刺激和细胞侵染过程中的转录研究

目的 了解dnaK、htrA、vjbR和gntR等布鲁菌的重要毒力调控基因的功能.方法 本研究利用定量RT-PCR的方法分析了dnaK、htrA、vjbR和gntR在酸等体外刺激条件下和巨噬细胞感染过程中的转录变化.结果 这些毒力调控基因在体外刺激条件下、侵染过程中可特异的诱导表达,但是它们在这些刺激条件和胞内不同时期的转录丰度不同.结论 dnaK、htrA、vjbR和gntR在布鲁菌感染过程的不同环节发挥作用.     

鸡沙门菌基因组物理图

目的 建立鸡沙门菌287／91株的基因组物理图，与鸡沙门菌SARB21以及鼠伤寒沙门菌LT2的基因组物理图进行比较，以找出同种细菌不同菌株之间以及近缘菌之间基因组的差异，进而探讨细菌基因组进化的一般规律。方法 细菌基因组DNA用XbaⅠ、AvrⅡ和bCeuⅠ进行酶切，再用脉冲场凝胶电泳方法分离出DNA片段，通过Tn10插入等方法对这些片段进行精确排列。结果 构建了鸡沙门菌287／91株的基因组物理图。与SARB21株的基因组物理图比较发现，二者相对于鼠伤寒沙门菌LT2有相似的插入和缺失片段。结论 鸡沙门菌287／91株与SARB21株基因组很相似，其主要差异在于rrn操纵子DNA介导的同源性重组发生的具体部位不同，导致了基因组DNA片段的不同排列，因而造成二者不同的基因组结构。     

杭州地区伤寒及甲型副伤寒沙门菌流行菌株分子特征的研究

目的 了解并确定2002-2008年杭州地区伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌优势菌株的分子特征.方法 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点串联重复序列分析(MLVA)或多位点序列分型(MLST)对2002-2008年杭州地区分离的31株伤寒沙门菌、404株甲型副伤寒沙门菌进行分型并分析.结果 404株甲型副伤寒沙门菌可分为6个PFGE型,P1型和P2型属于同一个克隆系,99.0％ (400/404)菌株属于该克隆系,其中P1型菌株占该克隆系菌株的93.3％ (373/400).31株伤寒沙门菌株存在高度多样性,可分为14个PFGE型、28个MLVA型(分辨率90.3％)、3个MIST型.根据MLVA各型靶位点多态性差异,本地区流行的伤寒沙门菌株与东南亚地区菌株相近,但与欧洲菌株差距较大,呈高度多态性的可变串联重复序列(VNTR)位点TR1、TR2、Sal02可作为本地区伤寒沙门菌株的检测标志.伤寒沙门菌株MLST型别包括了目前国际上发现的所有3个型别,但以ST2型为主(23/31,74.2％).结论 近年杭州地区甲型副伤寒疫情由同一亚系菌株感染所致,但本地区流行的伤寒沙门菌株呈现高度多样性.     

布鲁菌干扰MΦ泛素依赖型自噬通路的研究

目的 探讨布鲁菌减毒株S1330对于小鼠巨噬细胞(MΦ)泛素依赖型自噬通路的影响.方法 应用布鲁菌S1330株作用于小鼠MΦ构建体外感染模型.观察MΦ内的吞噬过程、泛素化水平及自噬水平.实验设立巨噬细胞正常组、感染组、自噬诱导对照组、自噬诱导感染组,应用吉姆萨染色法、免疫荧光法、Western blot法分别观察不同时间点、不同组MΦ内泛素化蛋白含量及自噬水平变化.结果 布鲁菌感染MΦ0.5 h胞内出现泛素化菌体蛋白,随着感染时间的延长,胞内泛素化蛋白聚集持续增多,12 h MΦ死亡;与之相对应的自噬体标记物LC3B蛋白表达严重不足,而自噬诱导的感染组MΦ内泛素化的菌体蛋白比例减少.结论 布鲁菌S1330株感染MΦ启动胞内泛素化机制,却干扰泛素依赖型自噬通路的成熟,使泛素化菌体蛋白大量聚集不能有效清除,最终导致了MΦ功能障碍而死亡.     

RAPD基因指纹图谱在解脲脲原体分型研究中的应用…

采用随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）技术，以美国Ｏｐｅｒｏｎ公司生产的ＯＰＬ１￣２０十本脱氧寡核苷酸为引物，对解脲脲原体８和１０血清型标准株基因指纹图谱进行了构建。通过比较发现，两型解脲脲原体ＤＮＡ间存在同源性和多态性。初步研究结果表明，ＲＡＰＤ可用于解脲脲原体分型。