小鼠骨髓基质干细胞的鉴定及体外诱导分化为肝细胞的可行性

目的:分离、鉴定小鼠骨髓基质干细胞(MSCs)并探讨在体外多种细胞因子的诱导下分化为肝细胞的可行性.方法:获取小鼠骨髓干细胞,进行体外贴壁培养、纯化,观察不同传代次数细胞形态特点.流式细胞法检测不同传代细胞的表面标志物CD45和CD90.分离后的MSCs再经含有HGF,FGF-4,EGF三种细胞因子的诱导体系继续培养21 d,分别以半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测诱导后细胞的白蛋白(ALB)、细胞角化蛋白18(Cg18)、以及甲胎蛋白(AFP)在基因和蛋白水平的表达.结果:培养的骨髓干细胞随传代次数增多细胞形态趋向为长梭形.传代到第5代,基质干细胞的表面标志CD90阳性细胞从原代的25.42%增加到93.47%,造血干细胞的表面标志CD45表达阳性细胞从原代的86.49%降低到2.77%.通过RT-PCR可检测出诱导第7天细胞表达AFP mRNA,ALB mRNA及CK18 mRNA;通过Western blot可检测出诱导第21天的细胞表达ALB和CK18.结论:小鼠MSCs可以在体外被有效地分离纯化,可以被诱导为表达肝细胞表面标志的肝细胞样细胞.     

骨髓基质干细胞向肝细胞的定向分化及体内移植

目的:研究骨髓基质干细胞(BMSCs)在体外向肝细胞的定向分化和体内移植后对小鼠受损肝脏的修复作用.方法:在体外培养体系中用肝细胞提取液(HE)模拟体内肝脏微环境,诱导BMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学和吲哚靛青绿(ICG)染色检测其分化程度.将5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的BMSCs移植入小鼠体内,免疫组织化学方法显示BMSCs在肝脏的分布,血清酶学检测肝脏受损小鼠移植后7,14,28d谷草转氨酶(AST,nkat/L)、谷丙转氨酶(ALT,nkat/L)和碱性磷酸酶(AKP,nkat/L)的含量变化.结果:在体外BMSCs可由HE诱导分化成肝细胞,但HE诱导组α1-抗胰蛋白酶(4d:52.5±3.9vs76.8±4.5,P<0.05;14d:60.3±6.1vs85.4±7.6,P<0.05;21d:80.5±8.0vs105.7±8.6,P<0.05)和白蛋白(4d:43.2±6.5vs71.6±7.6,P<0.05;14d:61.5±10.4vs93.6±13.9,P<0.05;21d:80.6±17.1vs128.3±22.2,P<0.05)表达量少于HGF诱导组;体内移植后BMSCs整合于肝实质内;肝脏受损小鼠移植BMSCs后,血清中ALT(7d:493.43±120.02vs696.81±140.03,P<0.01;14d:558.45±130.03vs780.16±151.7,P<0.01;28d:583.45±138.36vs880.18±170.53,P<0.01)、AST(7d:1521.97±186.7vs2342.14±208.38,P<0.01;14d:1590.32±200.04vs2692.21±238.38,P<0.01;28d:1625.33±208.38vs2872.24±281.72,P<0.01)和AKP(7d:1.24±0.22vs1.78±0.18,P<0.01;14d:1.21±0.21vs2±0.19,P<0.01;28d:1.32±0.19vs2.27±0.2,P<0.01)比损伤组小鼠相应值均有下降,但仍高于正常对照组.结论:BMSCs在体外可由HE诱导分化成肝细胞,在体内移植后可促进小鼠受损肝脏的修复.     

小鼠骨髓干细胞诱导分化为肝细胞的实验研究

目的探讨成年小鼠骨髓干细胞在肝细胞生长因子(HGF)作用下分化为肝细胞的可能性及其分化特性，为肝细胞移植提供实验基础。方法HGF100ng／ml体外诱导小鼠骨髓干细胞向肝细胞分化，于诱导的第0、7、l4、21、28天，观察细胞形态特征；半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)mRNA水平的表达；免疫细胞化学法检测ALB、AFP和细胞角蛋白l9(CK19)蛋白水平的表达。结果新鲜分离的骨髓干细胞ALB及AFP mRNA呈弱阳性。在非诱导组，培养7d时ALB mRNA已检测不到，AFP mRNA明显减弱，14d时消失。在诱导组，7d时ALB mRNA检测不到，14d时再次出现阳性条带，21d时表达量最大，而AFP mRNA在诱导组始终呈阳性，14d时表达量最大，以后逐渐减少。免疫细胞化学结果与RT-PCR结果基本一致，但CK19蛋白始终阴性。结论小鼠骨髓干细胞在HGF单独作用下能诱导分化为肝细胞样细胞，诱导分化的最佳时期是2～3周。     

体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的:体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化(BMSCs)为肝样细胞,提高分化效率.方法:将第一代BMSCs随机分为诱导组和对照组.诱导组加肝细胞生长因子、成纤维生长因子、表皮生长因子、抑瘤素M等进行诱导培养,观察细胞形态,检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(A1b)、细胞角蛋白18(CK18)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)和细胞色素P450 2b9(CYP2b9)的mRNA表达,A1b合成以及A1b和CK18蛋白标记细胞阳性率.结果:诱导组第3天出现多边形细胞,5—7d上皮样细胞呈岛状分布,14 d呈铺路石状.对照组细胞为长梭形.第7,14,21天,诱导组细胞AFP,A1b,CK18 mRNA和A1b蛋白检测阳性;第14,21天,细胞表达TAT和CYP2b9 mRNA.对照组除AFP mRNA呈弱阳性外,其余均为阴性.第7,14,21天,诱导组CK18阳性率分别为71.4%.75.9%,80.6%:A1b阳性率分别为75.0%,79.7%.81.1%.而对照组第7天CK18和A1b阳性率仅2.3%,1.7%,与诱导组相比有显著差异(P_(CK18)=1.97×10~(-5),P_(A11b)=3.08×10~(-6)).结论:BMSCs在体外可以被诱导分化为肝样细胞,诱导率最高可达80%以上.     

共同培养诱导骨髓基质干细胞向肝细胞分化的研究

目的 探索大鼠骨髓皋质干细胞（MsCS）向肝细胞分化的能力，及肝细胞生长的微环境埘其诱导分化的作用。方法 采用梯度离心法，获取大鼠骨髓基质干细胞；改良的两步法获取大鼠肝细胞。将鉴定的MsCS和肝细胞以半透膜相隔共同培养，以单独培养的MSCs作对照。在第1、3、7．14．21、28天，分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学分析检测甲胎蛋白（AFP）、白蛋白、细胞角蛋白l8（CK-l8）的基因和蛋白表达。结果在MSCs与肝细胞共同培养过程中，MSCs出现明显的细胞形态、体积和数量变化，可见双核或多核细胞，细胞轮廓较清晰。RT-PCR检测：共同培养的MSCs第7天即出现AFP基因表达，第14天表达增强，第21天表达减弱；第14天开始出现白蛋白、CK-18基因表达，并持续表达。单独培养的MSCs均无表达。共同培养的MSCs，于第7天进行免疫细胞化学检测，AFP即呈阳性；第14天白蛋白和CK-18也呈阳性；单独培养的MSCs未见AFP、白蛋白及CK-18表达。结论 大鼠骨髓基质干细胞与肝细胞共同培养，可被诱导分化为肝细胞。     

损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为肝细胞

目的探索损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为肝细胞的可行性及方法。方法培养注射CCl4所致的损伤小鼠肝脏组织块,收集条件培养液,进行MSCs诱导分化。通过形态学观察、RT-PCR、免疫荧光反应和过碘酸Schiff反应鉴定分化细胞。结果诱导组细胞呈肝细胞样变化。RT-PCR检测显示：AFP基因第5天开始表达,第10天表达增强,此后表达减弱；细胞角蛋白18和Alb基因第10天开始表达,持续到第20天；第20天检测到酪氨酸氨基转移酶基因表达。免疫荧光反应显示诱导20 d的细胞AFP、细胞角蛋白18、Alb表达阳性,诱导20 d细胞过碘酸Schiff反应呈阳性。结论MSCs在损伤肝脏条件培养液诱导下可分化为肝细胞。     

骨髓干细胞的可塑性及其转化为肝细胞的研究进展

干细胞(stemcell)是指一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,在特定的条件下可以分化为不同的功能细胞,形成多种组织和器官.骨髓起源的干细胞即骨髓干细胞主要有三种:造血干细胞、骨髓基质干细胞和多能前体细胞.骨髓干细胞具有可塑性(plasticity),即在一定的条件下能转化为不同于其组织来源的细胞.目前有四种机制来解释骨髓干细胞可塑性:(1)多能组织干细胞在出生后可以存在于体内多种组织和器官中,它们的增殖与分化与各自的局部环境有关;(2)成体许多组织内余存一种稀有数量的原始干细胞,其类似于胚胎干细胞,始终保持着胚胎干细胞的特性,在不同的条件刺激下能分化为内胚层、中胚层、外胚层多种组织细胞;(3)组织干细胞可以经历去分化或转分化的过程,经过基因重组,转化为不同组织来源的细胞;(4)细胞融合改变细胞特性.目前体内外试验均证实了骨髓干细胞向肝细胞的转化.骨髓干细胞在体内或体外转化为肝细胞,为临床应用开辟了新的道路.     

小鼠骨髓造血干细胞转化为肝细胞的实验研究

为进一步明确向肝细胞分化的细胞为骨髓中的那一亚群细胞,我们将纯化后的雄性小鼠造血干细胞移植到雌性受体小鼠的体内,然后在受体小鼠的肝脏内进行检测,以确定有无供体来源的肝细胞存在。一、材料与方法1.实验动物、主要器材和试剂:健康清洁级雌雄性纯系BALB/C鼠,8～12周龄,均由第一军医大学动物实验中心提供。主要试剂及材料:磁性活化细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)分离用MiniMACS缓冲液,     

骨髓间充质干细胞定向诱导为肝细胞的研究进展

肝细胞移植治疗、肝组织工程以及生物人工肝等新兴技术的发展,为肝病患者带来了新的治疗方案;不过,这些新技术应用时会遇到一个共同的瓶颈--细胞来源不足.虽然肝细胞可以有多种来源,但是以干细胞的发展最为迅猛,随着近年来干细胞分离、培养、鉴定及其增殖技术的发展和成熟,利用干细胞解决肝细胞的来源问题已经引起了广泛关注.此文总结了骨髓间充质干细胞诱导为肝细胞的研究现状、可能影响因素以及分化机制.     

骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化的形态学研究

骨髓基质干细胞(BMSCs)是骨髓内的一种多潜能的干细胞,具有多向分化及自我更新的能力,参与组织细胞的替代及修复。在一定条件下,BMSCs可分化为中胚层以外的组织。2004年5月～8月,我们通过研究体外人胚向神经细胞诱导分化过程的形态学变化规律,旨在为BMSCs的开发应用提供实验依据。     

Rat bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into hepatocytes in vitro

AIM: To investigate the mechanism and regulation of differentiation from bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into hepatocytes and to find a new source of cell types for therapies of hepatic diseases. METHODS: MSCs were isolated by combining gradient density centrifugation with plastic adherence. The cells were cultured in osteogenic or adipogenic differentiation medium and determined by histochemical staining. MSCs were plated in plastic culture flasks that were not coated with components of extracellular matrix (ECM). When MSCs reached 70% confluence, they were cultured in low glucose Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10 mL/L fetal bovine serum, 20 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) and 10 ng/mL fibroblast growth factor-4 (FGF-4). The medium was changed every 3 d and stored for albumin, alpha-fetoprotein (AFP) and urea assay. Glycogen store of hepatocytes was determined by periodic acid-Schiff staining. RESULTS: By combining gradient density centrifugation with plastic adherence, we isolated a homogeneous population of cells from rat bone marrow and differentiated them into osteocytes and adipocytes. When MSCs were cultured with FGF-4 and HGF, approximately 56.6% of cells became small round and epithelioid on d 24 by morphology. Compared with the control, levels of AFP increased significantly from d 12 to 15.5±1.4 μg/L (t = 2.31,P<0.05) in MSCs cultured with FGF-4 and HGF, and were higher (46.2±1.5 μg/L) on d 21 (t = 41.926, P<0.01), then decreased to 24.8±2.2 μg/L on d 24 (t = 10.345, P<0.01). Albumin increased significantly on d 21 (t = 3.325,P<0.01) to 1.4±0.2 μg/mL, and to 2.1±0.7 μg/mL on d 24 (t= 3.646, P<0.01). Urea (2.3±0.4 mmol/L) was first detected on d 21 (t= 6.739, P<0.01), and continued to increase to 2.6±0.9 mmol/L on d 24 (t = 4.753, P<0.01). Glycogen storage was first seen on d 21. CONCLUSION: The method combining gradient density centrifugation with plastic adherence can isolate MSCs. Rat MSCs may be differentiated into hepatocytes by FGF-4 and HGF. Cytokines may play a more important role in differentiation from rat MSCs into hepatocytes.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为肝细胞样细胞

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养及特异性诱导为肝细胞样细胞的能力。方法 骨髓标本来源于健康志愿者的胸骨,年龄2～35岁,采用淋巴细胞分离液(密度1.077)分离人MSCs,并分别采用HGF、FGF4、HGF FGF4以及无生长因子四种处理因素体外诱导第三代人MSC向肝细胞样细胞分化。通过流式细胞术分析鉴定.MSCs的纯度,于诱导培养的0、7、14、21、28天时留取细胞检测CK18、AFP和白蛋白的表达情况,同时进行糖原染色验证细胞功能。结果 用淋巴细胞分离液分离出的人MSCs纯度可达90％,采用HGF、FGF4及HGF FGF4三种处理因素均可在体外诱导人MSCs特异分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的细胞。结论 人MSCs能在体外扩增并定向诱导为肝细胞样细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外成内皮细胞能力的研究

目的　探讨骨髓间充质干细胞体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力。方法　无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,通过贴壁培养法获得MSC ,然后在内皮细胞生长环境中进行诱导分化 ,最后对扩增的细胞特征进行鉴定 ,同时初步研究其体外成血管特性。结果　MSC每扩增一代 ,细胞数量增加 5～ 8倍 ,7.6 5× 10 3 个原代MSCs体外扩增 3代即获得 1.2 6× 10 8个细胞。在 70 %～80 %融合时呈现“铺路石”样形态 ,细胞免疫组化证实扩增细胞表达CD31和vonWillebrandfactor(vWF) ,具有吞噬ac LDL的功能 ,且扩增细胞在体外参与网状血管样结构形成。结论　MSC扩增能力强 ,在体外能诱导其向内皮细胞方向分化。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的观察人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）体外扩增和定向诱导分化为神经元样细胞的变化,为其临床应用奠定基础。方法采用密度梯度离心法分离BM-MSCs细胞,用MesencultTM培养基和贴壁培养法培养、纯化和扩增细胞,流式细胞术检测细胞表面CD29和CD90分子表达率。采用20 ng/ml重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/ml新型人表皮生长因子（hEGF）和20 g/L二甲基亚砜（DMSO）、5 mmol/Lβ-巯基乙醇（BME）分别诱导BM-MSCs;采用免疫组化法检测细胞的神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白（VIM）表达情况。结果BM-MSCs细胞增殖迅速,3周可传代培养;BM-MSCs传十代扩增1－2×10^3倍。分离和扩增BM-MSCs CD29、CD90强表达率分别为95.02%、93.81%。药物诱导后的BM-MSCs发生轴突等神经元样细胞变化,阳性表达NSE、GFAP、VIM分子。结论人BM-MSCs能体外培养和扩增,并能定向诱导分化为神经元样细胞。     

In vitro directed differentiation of mouse embryonic stem cells into insulin-producing cells

Aims/hypothesis We recently demonstrated that insulin-producing cells derived from embryonic stem cells normalise hyperglycaemia in transplanted diabetic mice. The differentiation and selection procedure, however, was successful in less than 5% of the assays performed. Thus, to improve its effectiveness, new strategies have been developed, which increase the number of islet cells or islet progenitors. Methods Mouse embryonic stem cells transfected with a plasmid containing the Nkx6.1 promoter gene followed by a neomycin-resistance gene, were cultured with factors known to participate in endocrine pancreatic development and factors that modulate signalling pathways involved in these processes. Neomycin was used to select the Nkx6.1-positive cells, which also express insulin. The transfected cells were differentiated using several exogenous agents, followed by selection of Nkx6.1-positive cells. The resulting cells were analysed for pancreatic gene and protein expression by immunocytochemistry, RT-PCR and radioimmunoassay. Also, proliferation assays were performed, as well as transplantation to streptozotocin-induced diabetic mice.Results The protocols yielded cell cultures with approximately 20% of cells co-expressing insulin and Pdx-1. Cell trapping selection yielded an almost pure population of insulin-positive cells, which expressed the beta cell genes/proteins Pdx-1, Nkx6.1, insulin, glucokinase, GLUT-2 and Sur-1. Subsequent transplantation to streptozotocin-induced diabetic mice normalised their glycaemia during the time period of experimentation, proving the efficiency of the protocols.Conclusions/interpretation These methods were both highly efficient and very reproducible, resulting in a new strategy to obtain insulin-containing cells from stem cells with a near 100% success rate, while actively promoting the maturation of the exocytotic machinery.Abbreviations Anti-Shh antibody against sonic hedgehog - D3 undifferentiated D3 stem cell line - EB embryoid bodies - ES embryonic stem - FBS fetal bovine serum - LIF leukaemia inhibitory factor - mES mouse embryonic stem - Ngn3 neurogenin 3 - P gelatine-coated plates - Pdx-1 pancreatic duodenum homeobox 1     

犬骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的研究

目的 研究犬骨髓间充质干细胞(MSC)体外诱导分化为胰岛样细胞的可能性.方法 分离纯化犬骨髓MSC,予EGF、bFGF和β细胞调节素、尼克酰胺、B27添加剂诱导.双硫腙染色、 Western blot、免疫荧光染色、胰岛素分泌量测定和葡萄糖刺激胰岛素释放试验鉴定诱导前后的细胞功能.结果 未诱导细胞呈长梭形贴壁生长,诱导第2周细胞逐渐变圆,聚集成团,双硫腙染色呈棕红色;Western blot检测诱导后细胞表达PDX-1;免疫荧光染色显示诱导后细胞表达胰岛素、胰升血糖素、生长抑素; ELISA结果表明诱导后细胞可分泌胰岛素,体外葡萄糖刺激胰岛素释放试验阳性.结论 犬骨髓MSC在体外能被诱导分化为胰岛样细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞向类肝细胞体外诱导分化

目的:观察不同条件下骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导分化为类肝细胞的差异.方法:Wistar大鼠24只随机均分为3组,分别为正常对照组、肝纤维化模型组、自拟中药干预组.采用CCl4乳剂皮下注射建立肝纤维化模型.造模成功后中药干预组采用丹金舒肝胶囊药液灌胃治疗.治疗结束后剖杀大鼠,留取大鼠肝脏标本,HE染色观察各组病理改变.采用密度梯度离心法和贴壁法分离各组大鼠的MSCs,经培养传代获得纯化的MSCs.各组纯化的MSCs采用HGF、FGF-4进行诱导培养.留取15、21、27 d细胞培养液进行白蛋白(Alb)、甲胎蛋白(AFP)检测;于27 d收集细胞爬片,进行糖原染色和CK-18免疫细胞化学染色.结果:3组15、21和27 d各MSCs诱导组AFP水平均高于MSCs非诱导组(P<0.01),其中21 d AFP水平最高(肝纤维化模型组:48.94±0.08 vs 9.90±0.09;中药干预组:49.86±0.29vs 8.69±0.62;正常对照组:38.65±0.33 vs9.04±0.11,均P<0.01);3组15 d各MSCs诱导组与MSCs非诱导组白蛋白水平无统计学意义:21 d、27 d各MSCs诱导组白蛋白水平均高于MSCs非诱导组(1.11±0.08 vs 0.32±0.00,1.25±0.04 vs 0.32±0.00,1.06±0.03 vs 0.33±0.00;1.52±0.02 vs 0.33±0.00,1.79±0.01vs 0.31±0.03,1.63±0.04 vs 0.32±0.01,均P<0.01),27 d最高.27 d各MSCs诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18均阳性,而MSCs非诱导组糖原染色、CK-18均阴性.从AFP、Alb水平综合比较,3组诱导效果发现自拟中药干预组优于其他2组.结论:HGF、FGF-4可在体外诱导实验性大鼠的MsCs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞:自体MSCs可以作为治疗临床重症肝病的一种细胞来源,而临床联合中药复方治疗可能会使MSCs体外诱导的效果更为理想.     

丹酚酸B体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的探讨丹酚酸B体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为心肌细胞样的可行性。方法取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养BMSC,第2代BMSC经丹酚酸B诱导分化为诱导组,未诱导为对照组。相差显微镜观察细胞形态;免疫组织化学法检测结蛋白、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、连接蛋白43(Cx43)、p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)的表达;透射电镜观察分化细胞的超微结构。结果原代细胞接种4h后贴壁生长,48h后细胞呈纺锤形和长梭形,传代细胞经丹酚酸B诱导1周后细胞呈多角形、梭形等形状,部分细胞有分支,诱导4周后诱导组细胞形态明显改变,细胞核位于中央,呈柱状的细胞紧密平行排列,有明显方向性。诱导组细胞中均有结蛋白、cTnI、Cx43及p38MAPK表达,阳性率分别为40.0%、32.3%、53.5%和64.8%,对照组细胞呈弱阳性或阴性表达。免疫荧光检测显示,结蛋白与cTnI呈共表达。结论丹酚酸B体外可诱导大鼠BMSC分化为心肌样细胞。