5-氮胞苷对HSG细胞增殖抑制作用的体外研究

目的体外研究5-氮胞苷(5-azacytidine,5-azaC)对起源于人颌下腺闰管的HSG(HumanSalivaryGland,HSG,)细胞的增殖抑制作用,为5azaC治疗涎腺肿瘤奠定理论和实验基础。方法通过形态学研究、生长曲线的测定、细胞分裂指数测定、银染核仁组织者区分析、流式细胞仪、克隆形成率检测5azaC对HSG细胞的作用。结果光镜下培养的细胞为多边形,细胞可连接成片,胞膜清楚,核大,位于中间,核仁清楚,核仁1～2个。加入5azaC后,部分细胞脱落到培养液中。5μmol/L和10μmol/L5azaC对HSG细胞增殖抑制率分别为85%和95%,细胞分裂减慢,细胞软琼脂克隆形成率降低,流式细胞仪结果表明HSG细胞主要被抑制在G1期。结论5azaC在体外能抑制HSG细胞的增殖。     

5-azaC对HSG细胞增殖抑制的实验研究

目的:研究5-azaC对HSG细胞的作用,为5-azaC治疗涎腺肿瘤提供理论和实验基础。方法:通过体外生长曲线测定和体内移植实验检测5-azaC对HSG细胞的增殖抑制作用。结果:体外实验表明5-azaC可以抑制HSG细胞的增殖,5×10-6mol/L和10×10-6mol/L5-azaC对HSG细胞的增殖抑制率分别为85%和92%。与对照组相比,用5-azaC处理HSG细胞后再移植到裸鼠皮下,其致瘤性降低。结论:体内、体外实验表明5-azaC能抑制HSG细胞的增殖。     

白藜芦醇对人舌癌细胞Tca增殖及凋亡影响的研究

目的探讨白藜芦醇对人舌癌细胞Tca的增殖及凋亡影响。方法应用MTT比色法检测白藜芦醇对Tca细胞体外生长的抑制作用;平板克隆检测白藜芦醇处理前后Tca细胞的克隆形成能力;流式细胞仪测定细胞的周期和凋亡;Hoechst33258荧光染料染色,显示凋亡细胞形态。结果MTT实验观察,白藜芦醇对Tca细胞生长有抑制作用,随浓度升高和时间延长,作用增强,呈剂量-时间效应关系;白藜芦醇作用Tca细胞48 h和72 h后,半数细胞抑制作用所需浓度约为(IC50)100μmol/L和75μmol/L。白藜芦醇(75μmol/L)处理后,细胞的克隆形成能力明显下降。白藜芦醇(100μmol/L)作用48 h后使G1期细胞的比例增加;Hoechst33258染色,可见细胞呈明显的凋亡特征。结论白藜芦醇可抑制人舌癌细胞Tca增殖,使细胞周期呈G1阻滞并可诱导细胞发生凋亡。     

TNF-α对根尖乳头干细胞体外增殖及成牙成骨向分化能力的影响

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对根尖乳头干细胞(SCAP)外增殖及成牙成骨向分化能力的影响。方法:采用酶消化法结合组织块法获得根尖乳头干细胞,免疫荧光免疫组化法鉴定细胞来源,通过不同浓度的TNF-α进行干预后检测对SCAP增殖,矿化成牙成骨能力的影响。结果:MTT检测显示各浓度组TNF-α均能刺激SCAP的体外增殖,10、50 mg/L的TNF-α实验组可明显促进SCAP增殖(P<0.05),差异具有统计学意义;茜素红染色显示与对照组(0 mg/L TNF-α)相比,实验组(5、10、50 mg/L TNF-α)染色明显变浅,矿化结节形成的较小,对照组形成红色结节范围大且呈深橘色;免疫组化染色显示SCAP胞浆中DSP、BSP均有表达,实验组部分细胞胞浆染色且染色较浅,呈褐色为阳性表达,对照组(0 mg/L TNF-α)细胞胞浆完全着色呈深褐色,为强阳性表达。结论:不同浓度TNF-α对SCAP的生长增殖均有促进作用,TNF-α在不同程度上对SCAP矿化及成牙成骨向分化有抑制作用。     

TNF-α对人根尖乳头干细胞增殖及分化能力的影响

目的：研究肿瘤坏死因子α（TNF-α）对人根尖乳头干细胞增殖及分化能力的影响。方法：采用组织块法获得人根尖乳头干细胞,免疫荧光法鉴定干细胞表面标志物;经TNF-α刺激后检测对干细胞增殖、克隆形成率及分化能力的影响。结果：免疫荧光显示人波形丝蛋白、STRO-1阳性,角蛋白阴性;10μg/L TNF-α在4天时促进根尖乳头干细胞的增殖,提高克隆形成率;抑制碱性磷酸酶活性及矿化结节形成。结论：炎性因子TNF-α对人根尖乳头干细胞的生物学特性具有一定的影响。     

PTEN基因转染对粘液表皮样癌细胞系M_3SP_2增殖的抑制作用

目的:观察外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑癌基因对高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2体外生长的影响。方法:应用脂质体介导方法将野生型PTEN基因导入M3SP2细胞,通过活细胞观察、细胞生长曲线、分裂指数和克隆形成率了解细胞生长状态。结果:与亲本细胞比较,PTEN基因转染细胞数量减少、排列松散,部分细胞发生变性或崩解;细胞生长缓慢,分裂指数显著减至1612j(P<0101),细胞群体倍增时间明显延长(31174 h),细胞生长抑制率达57105%~71146%(P<01001);细胞克隆形成率为10140%~14193%,克隆形成抑制率高达65%~72% (P<0101)。结论:外源野生型PTEN抑癌基因能显著抑制高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2体外增殖。     

汉黄芩素诱导人舌鳞状细胞癌HN-6细胞凋亡的研究

目的本实验旨在体外探讨汉黄芩素对人舌鳞状细胞癌(简称鳞癌)HN-6细胞的增殖、细胞凋亡及细胞周期的影响。方法采用不同浓度的汉黄芩素对HN-6细胞进行干预,应用CCK-8法检测汉黄芩素对HN-6细胞增殖的影响;通过DAPI染色,荧光显微镜下观察细胞核变化及细胞凋亡情况;Annexin V-FITC/PI双标染色,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;PI染色,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果随着汉黄芩素浓度和作用时间的增加,HN-6细胞生长明显受到抑制,呈现时间和剂量依赖性。与对照组比较,当不同浓度汉黄芩素作用48 h时,各实验组细胞生长抑制率分别是23.18%、45.80%、54.61%、68.98%、76.82%,P均<0.05,差别有统计学意义。加药组细胞可见明显的核固缩、核碎裂、核溶解及染色质凝聚等典型的凋亡特性。流式细胞仪检测结果显示汉黄芩素可诱导细胞凋亡,实验组细胞总凋亡率分别为7.00%、12.03%、32.19%,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),并使细胞阻滞于G0/G1期(实验组的G0/G1期细胞百分比分别是61.21%,63.65%,70.78%,与对照组相比,差异有统计学意义,P均<0.05)。结论汉黄芩素能够体外抑制人舌鳞癌HN-6细胞的增殖,促进细胞凋亡。     

骨桥蛋白对鼠皮肤表皮干细胞的生物学影响

目的:分离、培养并鉴定SD大鼠表皮干细胞;观察骨桥蛋白重组因子(recombinant rat osteopontin,rrOPN)对表皮干细胞体外增殖作用及促IL-6和IL-1β炎性因子分泌作用的影响。方法:体外分离培养大鼠表皮干细胞,用倒置显微镜及电镜观察其形态,采用β1-整合素、CK15、CK19、CK5及CK10染色鉴定,并进行细胞生长曲线测定,流式细胞仪分析及细胞克隆形成率测定,以角质形成细胞作为对照。实验对不同浓度rrOPN处理的表皮干细胞采用MTT法测定细胞生长率,ELISA法测定IL-6、IL-1炎性因子分泌的变化。结果:倒置显微镜观察所得鼠表皮干细胞呈上皮样生长,电镜观察细胞胞核大,较多处于分裂象。免疫组织化学检测表皮干细胞β1-整合素、CK15、CK19、CK5及CK10染色均呈阳性。细胞周期分析表皮干细胞中48.9%的细胞处于DNA合成期,细胞克隆形成率为34.7%。5～50 ng/mL的rrOPN促进角质形成细胞生长,浓度为15 ng/mL的rrOPN促进细胞生长作用最显著(P<0.05)。rrOPN引起IL-6明显升高(P<0.05),IL-1β未见明显上调。结论:成功建立大鼠表皮干细胞分离、培养方法,rrOPN促进表皮干细胞增殖,并促其炎性因子分泌,影响创口愈合。     

Notch配体Delta-1对人牙髓干细胞体外增殖的影响

目的:探讨Notch配体Delta-1对人牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)体外增殖活性的影响。方法:用Delta-1-EGFP重组逆转录病毒感染培养的人牙髓干细胞,获得稳定高表达人Delta-1蛋白的人牙髓干细胞系;利用CFU-F计数、四唑盐(MTT)比色法及流式细胞仪等方法检测Delta-1基因转导人牙髓干细胞的克隆形成率、细胞生长曲线和细胞周期变化。结果:与正常牙髓干细胞相比,Delta-1转导人牙髓干细胞的CFU-F计数为62～89clones/103cell,约为前者的10倍;接种1～7d,转导细胞的活细胞数量增加显著;S期细胞比例及增殖指数,分别从转导前的20.6%和35.8%提高到63.8%和75.7%。结论:Notch配体Delta-1可显著促进人牙髓干细胞的体外增殖,Notch-Delta-1信号转导途径在人牙髓干细胞的自我更新中起重要作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养方法及其生物学特性。方法:体外分离、培养大鼠BMSCs,进行细胞形态学观察、生长曲线测定、细胞表面标记物检测;并采用体外诱导分化方法对BMSCs多向分化潜能进行鉴定。结果:大鼠BMSCs传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;流式细胞仪鉴定CD90阳性率为88.2%,CD29阳性率为98%,CD34阴性率为2.8%,CD45阴性率为2.7%。成骨诱导21 d后,茜素红染色后可在显微镜下观察到矿化结节形成。成脂诱导14 d,油红O染色后显微镜下可见红色脂滴形成。结论:BMSCs在体外培养中贴壁生长,增殖较快;表达骨髓组织来源干细胞的表面标记物CD29、CD90;诱导后能向成骨细胞、脂肪细胞分化。     

肿瘤坏死因子-α诱导人牙囊细胞的凋亡作用

目的：研究不同浓度肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对体外培养人牙囊细胞凋亡的影响。方法：第五代HDFCs分别与浓度为0（对照组）、50、100、200 ng/mL的TNF-α共孵育24 h,流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双染技术检测牙囊细胞凋亡细胞比率。结果：HDFCs的凋亡率随TNF-α浓度升高而上升,由对照组的2.3%增加到7.1%。结论：TNF-可诱导HDFCs的凋亡,这种作用可能在牙齿发育、萌出过程中起重要作用。     

EGCG对舌鳞癌Tca8113细胞增殖与凋亡的实验研究

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用。方法:采用CCK-8法检测不同浓度的EGCG(0、10、20、40、80mg/L)对Tca8113细胞的体外增殖抑制作用;采用流式细胞术及DAPI荧光染色法检测EGCG对Tca8113细胞凋亡的影响。结果:CCK-8法检测显示EGCG对Tca8113细胞有明显增殖抑制作用并呈现时间及浓度依赖性(P<0.01);流式细胞仪结果显示,经10mg/L EGCG处理的Tca8113细胞凋亡率还不能认为与对照组有区别,其余EGCG处理组细胞凋亡率均高于对照组并呈现时间及浓度依赖性(P<0.01);DAPI染色在免疫荧光显微镜下可见典型的细胞核皱缩及凋亡小体等。结论:EGCG对Tca8113细胞具有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用,且呈现时间及浓度依赖性。     

水飞蓟宾对人舌癌细胞Tca的抑制作用

目的:研究水飞蓟宾在体外对舌癌细胞的作用,并进一步探讨其可能的作用机制.方法:MTT实验测定水飞蓟宾对舌癌细胞系(Tca)的半数抑制浓度(IC50);平板克隆形成实验检测加药前后细胞的克隆形成能力;流式细胞仪检测加药前后细胞周期的变化.结果:水飞蓟宾对舌癌细胞系有较强的抑制作用, 作用48 h时,IC50约为100 μmol/L;水飞蓟宾作用后,舌癌细胞的平板克隆形成能力降低;流式细胞仪检测结果显示细胞出现G1期阻滞.结论:水飞蓟宾在体外对舌癌细胞具有明显的抑制作用, 其作用机制可能是细胞出现G1期阻滞.     

兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定

目的:探讨兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)体外分离、培养并对下颌骨来源的BMMSCs进行鉴定.为骨组织工程提供种子细胞.方法:取兔下颌骨中的骨松质,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁培养,取P2或P3代BMMSCs进行检测.倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法测定细胞增殖并绘制细胞生长曲线;克隆形成实验计算克隆形成率;向成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞多向诱导分化;流式细胞仪检测细胞表面抗原标记.采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析.结果:细胞经传代后形态一致,呈梭形或三角形;细胞生长曲线显示,下颌骨BMMSCs经历潜伏期、对数生长期和平台期;克隆形成率为37％;成骨及成脂诱导形成钙结节及脂滴,茜素红及油红O染色呈阳性;成骨骼肌诱导desmin抗原标记阳性;流式细胞仪检测结果显示,所获得的下颌骨BMMSCs纯度较高.CD90和CD146表面标记阳性率分别为98.7％、98.1％.结论:从兔下颌骨分离的BMMSCs纯度较高,有强大的自我复制、增殖特性和体外多向诱导分化潜能,有望成为骨组织工程的种子细胞.     

TNF-α和槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达的影响及姜黄素对其影响的作用

目的:探讨TNF-α和槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达的影响及姜黄素对其影响的作用。方法:体外培养口腔黏膜成纤维细胞,分别用100～10 000 U/mL TNF-α和10～40μg/mL槟榔碱作用于细胞24～72 h, CCK-8实验检测细胞增殖,ELISA测定细胞中羟脯氨酸的表达。用5～40μmol/L的姜黄素作用于2种处理的细胞,检测细胞增殖和羟脯氨酸蛋白的表达。结果:TNF-α促进细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达(P<0.05),槟榔碱抑制细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达(P<0.05)。40μmol/L的姜黄素作用于TNF-α和槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞,在24 h和48 h时抑制细胞增殖(P<0.05)。不同浓度的姜黄素作用于TNF-α和槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞,均能抑制羟脯氨酸合成(P<0.05)。结论:TNF-α可促进口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达,槟榔碱能抑制口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达,较高浓度姜黄素能减弱TNF-α的刺激作用,增强槟榔碱的抑制作用。     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞增殖及相关基因HSG、cyclinD1表达的影响

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)增殖能力以及增殖相关基因HSG、cyclinD1的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞;成骨、成脂诱导牙周膜细胞,对其进行干细胞鉴定;将培养出的牙周膜干细胞与不同浓度的AGEs 共培养,MTT检测不同浓度下牙周膜干细胞增殖的改变;实时定量聚合酶链反应(real time PCR)检测AGEs刺激后HSG、cyclin D1表达的改变。结果:牙周膜细胞成骨诱导21 d后茜素红染色出现钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色出现脂滴;MTT显示不同浓度的AGEs对HPDLSCs增殖能力的影响有所差别,高浓度(100 mg/L,200 mg/L)明显抑制HPDLSCs的增殖,差异有统计学意义(P<0.05),低浓度(1 mg/L,10 mg/L)对HPDLSCs的增殖能力影响不大,差异无统计学意义;Real time PCR结果显示:AGEs(100 mg/L)刺激3 d后HSG mRNA表达水平较对照组升高、cyclinD1 mRNA的表达水平较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:高浓度的AGEs能抑制人牙周膜干细胞的增殖并能改变HSG、cyclinD1 mRNA的表达。     

维甲酸对口腔黏膜上皮细胞增殖的影响

目的探讨不同浓度维甲酸对体外培养的口腔黏膜上皮增殖的影响。方法将第二代人口腔黏膜上皮细胞以4×104个/cm2接种于玻片上,在含钙1.2 mmol/L的无血清角朊细胞培养基中培养,将其按培养基中的维甲酸浓度分为0、10-8、10-7、10-6、2×10-6mmol/L共5组。对各组细胞进行硝酸银染色,观察核仁区相关嗜银蛋白(AgNOR s)的着色情况,并对细胞核AgNOR s面积进行图像分析,以评价维甲酸对口腔上皮细胞增殖能力的影响。结果高钙培养基中维甲酸浓度为10-7~10-6mmol/L时,体外培养的上皮细胞内AgNOR s面积与维甲酸浓度0、10-8mmol/L 2个实验组有显著差异(P<0.01)。结论维甲酸可有效地拮抗因钙离子诱导上皮细胞分化所致增殖抑制。     

MS-275促进口腔鳞状细胞癌凋亡的实验研究

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对口腔鳞状细胞癌（Tca-8113）生长抑制情况以及促进凋亡的作用。方法采用0、0.5、1、2、4、8μmol/L MS-275对口腔鳞状细胞癌进行干预,倒置相差显微镜观察细胞形态改变;MTT法检测细胞增殖活性;Annexin-V-FITC/PI双染流式细胞仪定量检测细胞凋亡,流式细胞仪分析细胞周期。结果①倒置相差显微镜下观察到对照组细胞呈多边形,贴壁,生长活跃;实验组细胞形态改变明显,大部分细胞核固缩,细胞变小、变圆、脱壁。②细胞生长曲线显示,随MS-275浓度增加、时间延长,Tca-8113细胞生长明显受到抑制,各实验组细胞生长抑制率与对照组相比,P〈0.05,差别有统计学意义。③2、4μmol/L MS-275作用48h,细胞总凋亡率分别为41.28%和53.71%,细胞周期阻滞于G0/G1期,与对照组相比,差别有统计学意义。结论 MS-275体外抑制口腔鳞状细胞癌生长,呈时间-剂量依赖性,并促进细胞凋亡,阻滞细胞周期。     

17-β雌二醇对人粘液表皮样癌Mc3细胞增殖的影响

目的 :研究 17-β雌二醇 (E2 )对体外培养的人粘液表皮样癌Mc3细胞增殖的调节作用。方法 :不同浓度、时间的E2 处理Mc3细胞 ,采用细胞计数、克隆形成测定、流式细胞术、免疫组织化学染色等方法 ,检测E2 对人粘液表皮样癌Mc3细胞系细胞群体倍增时间、克隆形成率、细胞周期分布以及对PCNA、Bcl -2阳性表达的影响。结果 :对照组E2 浓度为 10 -9、10 -8、10 -7mol/L时 ,其细胞群体倍增时间分别为 :3 6.0h、2 7.9h、2 8.8h、2 5 .7h ;细胞克隆形成率分别为 :13 .7%、18.1%、17.6%、2 0 .8% ;PCNA的阳性表达率分别为 :62 %、78%、74%、98% ;Bcl-2的阳性表达率分别为 :48%、82 %、77%、93 %。流式细胞术检查结果显示 10 -7mol/L的E2 处理 12、18、2 4h后 ,细胞周期中S期细胞所占比例分别为 :11.3 %、7.0 %、46.7%。结论 :一定浓度的雌激素具有促进细胞G1/S期转换 ,增加S期细胞数量 ,加速DNA合成 ,从而促进细胞增殖。     

依那西普对牙龈卟啉菌内毒素作用下原代培养牙周膜细胞影响的实验研究

目的　观察依那西普（Etanercept）对牙龈卟啉菌内毒素（lipopolysaccharide,LPS)作用下体外培养的人牙周膜细胞(HPDLCs)的增殖能力的影响。方法　体外原代培养人牙周膜细胞,经免疫细胞化学鉴定,加入LPS和1 μg/ml Etanercept+LPS,LPS浓度分别为10、50、100、200、300 μg/ml检测（吸光度）A值。采用MTT法测定细胞增殖能力。结果　 人牙周膜细胞原代细胞生长状态良好。第3代细胞进行鉴定,Vimentin染色呈阳性,Ck(pan)染色呈阴性。MTT法检测加入梯度浓度的LPS 24 h后,HPDLCs增殖率随着LPS浓度的增加,对HPDLCs的增殖抑制逐渐增强,200 μg/ml LPS能最大程度抑制HPDLCS的增殖,抑制率为46.21%(P<0.01)。Etanercept + LPS组对HPDLCs细胞作用相对增殖率与LPS组比较（P＜0.01）,能明显抑制LPS对HPDLCs的抑制作用。结论　TNF-α抑制剂Etanercept能明显抑制牙周膜细胞在内毒素刺激下的死亡。