中药对犬骨髓干细胞成骨分化增殖的影响

目的 探讨活血化淤补肾壮骨中药对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)向成骨细胞分化增殖的影响.方法 比格犬6只,雄性,体重10～15 kg.实验分为含药血清组(A组)、无药血清组(B组)和胎牛血清组(C组).A组的血清来自活血化淤补肾壮骨中药经煎制后,按犬体表面积折算等效剂量,2只比格犬连续喂服7 d后经股动脉采血制备而成;B组的血清采用等剂量生理盐水,2只比格犬喂服7 d后经股动脉采血制备而成;C组的血清直接购买.另外2只比格犬由胫骨获取骨髓,经Ficoll分离液进行梯度离心,MSC经含胎牛血清的DMEM培养,传代后在培养液加入矿化诱导液(β-甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松)促使其向成骨细胞分化,I型胶原蛋白免疫组化鉴定成骨细胞,银染色和茜素红染色鉴定钙结节.分别将诱导后的细胞在A组、B组和C组DMEM中培养.通过甲基噻唑基四唑法(MTT)和碱性磷酸酶(ALP)活性的检测分别观察MSC分化生长的情况.结果 原代培养MSC细胞形态以梭形为主,诱导培养后细胞呈多边形,细胞有突起,I型胶原蛋白表达呈阳性,继续培养至10～14 d,细胞量达到高峰,出现钙化结节,银染色和茜素红染色呈强阳性.MTT法检测的生长曲线显示,3组细胞数量逐渐增加,培养6 d后吸光度值A组(0.696±0.188)、B组(0.374±0.093)及C组(0.296±0.106)比较,差异均有统计学意义(P<0.05).ALP活性随着培养时间延长而增加,A组的增加更为显著.培养5 d后ALP活性A组(36.72±2.02)、B组(26.90±2.46)及C组(24.50±1.56)比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 补肾壮骨中药能明显促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化增殖,促进骨形成.     

补肾中药合剂促进成骨细胞功能的机制研究

目的:探讨补肾中药合剂对体外培养的人成骨细胞(hFOB 1.19)功能影响的分子机制。方法:分别对低剂量、高剂量补肾中药血清和5%空白对照组血清培养的成骨细胞进行碱性磷酸酶(ALP)测试,并通过酶联免疫吸附实验分别检测其成骨细胞骨钙素(OC)的分泌量。采用蛋白质印迹法分析补肾中药合剂含药血清对骨保护素(OPG)、骨桥蛋白(OPN)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)蛋白表达水平的影响。结果:补肾中药合剂含药血清能提高hFOB 1.19细胞中的ALP活性;作用96 h后,能促进hFOB 1.19细胞分泌OC,均具有剂量依赖关系;在蛋白表达水平上,补肾中药合剂含药血清能明显上调人成骨细胞的OPG、OPN,并抑制其RANKL的表达。结论:补肾中药合剂含药血清可增张成骨细胞的成骨功能,其机制可能与影响OPG/RANK/RANKL骨代谢信号调节系统有关。     

犬自体血清培养骨髓基质细胞的实验研究

目的:探讨犬自体血清培养骨髓基质细胞的可行性方法:获取犬自体血清,配制成含10%和20%自体血清的培养液,与含10%胎牛血清的培养液在相同条件下培养犬骨髓基质细胞(BMSCs)。通过倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数以及MTT法对细胞增殖情况进行检测。并且对第2代细胞用3种不同血清成分培养液(均加入β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松)进行成骨诱导分化,采用免疫组化检测碱性磷酸酶及钙结节形成。对检测到的量化数据做统计学分析,比较各组间的差异,以评价不同血清成分培养液对细胞增殖分化的影响。结果:3组细胞的生长及形态无明显差别,经过诱导培养均能形成钙结节。对3组间量化检测做统计学分析,各组间差异无统计学意义。结论:制备的犬自体血清能完全替代胎牛血清对骨髓基质细胞进行诱导培养。     

人健康和炎性牙槽骨成骨细胞COX-2、PGE2、OPG,RANKL的表达

目的：初步探讨COX-2、PGE2、OPG和RANKL在牙周炎发病机制中所起的作用及其相互关系。方法：采用组织块法对人健康和牙周炎性牙槽骨进行体外培养和传代,加入含100μg/LrhOPG的不含胎牛血清的DMEM2mL。严格按照ELISA试剂盒说明进行操作,获得各指标的检测数值。结果：牙周炎组RANKL、PGE2、COX-2的表达较健康组明显增高,OPG的表达较健康组明显降低。加入rhOPG后,牙周炎组RANKL、PGE2、COX-2的表达明显降低;OPG表达明显增加。健康组RANKL、PGE2、COX-2表达明显降低;OPG表达增加。结论：RANKL、PGE2、COX-2可促进牙周炎的发生、发展,而OPG对牙周炎的发生、发展可起抑制作用,同时表明人工重组OPG可能协同其内源性OPG来共同抑制RANKL、PGE2、COX-2的活性。     

RANKL和OPG在不同骨移植材料拔牙位点保存区的表达

目的 通过观察破骨细胞核因子kB受体活化因子配体(receptor activator nuclear factor kappa B ligand,RANKL)和骨保护因子(osteoprotegerin,OPG)在不同骨移植材料拔牙位点保存时骨构建过程中表达变化,探讨破骨细胞对不同骨移植材料植入拔牙窝内在引导骨再生中的作用.方法 选取6只12月龄雄性beagle犬,微创拔除上下颌双侧第一侧切牙,将4个位点随机做不同处理,A组填人富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF),B组填入骨诱导活性材料(osteoinduction active material,OAM),C组填入羟基磷灰石生物陶瓷(coralline hydroxyapatite,CHA),D组空置(对照).6只犬随机分别于术后4周和12周各处死3只,制作牙槽骨标本.免疫组化检测24个拔牙位点保存制作的犬牙槽骨标本中RANKL与OPG的表达变化.结果 术后4周骨组织中OPG的表达A组高于B组、C组和D组(P＜0.05),RANKL的表达D组高于C组、B组和A组(P＜0.05).术后12周骨组织中OPG的表达D组高于C组、B组和A组(P＜0.05),RANKL的表达C组高于B组、A组和D组(P＜0.05).结论 骨移植材料在骨改建过程中通过促进成骨细胞分化成熟而刺激OPG表达升高,抑制破骨细胞.提示骨移植材料通过调控RANKL和OPG在拔牙窝新骨形成过程中发挥作用.     

RANKL/OPG比值变化在根尖肉芽肿骨质破坏中的意义

目的 检测核因子kappa B受体活化因子配体（RANKL）和骨保护素（OPG）的蛋白表达,探讨RANKL/OPG比值在根尖肉芽肿骨质破坏中的意义.方法 采用免疫组织化学技术检测30例慢性根尖肉芽肿和10例健康牙周膜组织中RANKL和OPG的表达.分析RANKL/OPG比值与炎症浸润、骨质破坏及临床症状之间的关系.结果 与正常对照组相比,根尖肉芽肿病损组织中的RANKL蛋白表达和RANKL/OPG比值显著升高（P＜0.05）.RANKL和OPG的蛋白表达无相关性（P＞0.05）.与小病损相比,RANKL/OPG比值在大病损中显著升高（P＜0.05）.RANKL/OPG比值与病损炎症浸润程度和有无临床症状均无关（P＞0.05）.结论 RANKL/OPG比值与根尖肉芽肿的病损大小密切相关,提示RANKL和OPG在根尖肉芽肿骨质破坏进程中发挥重要作用.     

重组腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP转染的Beagle犬牙周膜细胞成骨能力研究

目的    观察重组腺病毒载体 Ad5-hOPG-EGFP 转染 的Beagle 犬牙周膜细胞（ PDLCs）体内和体外的骨化能力。方法    将体外构建的携带人骨保护素（human osteoprotegerin,hOPG）基因的腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP转染Beagle犬PDLCs,通过体外Von Kossa染色实验、实时荧光定量PCR检测成骨指标的表达情况、酶联免疫检测RANKL/OPG的值及裸鼠体内胶原膜成骨实验比较转染组和对照组的成骨能力。结果    组织学和形态学结果显示,转染了重组腺病毒Ad5-hOPG-EGFP的Beagle犬PDLCs形成的矿化结节数目多且体积大、深染。转染组中犬碱性磷酸酶（alkaline phosphates,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OC）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）基因相对表达水平均高于空载体组和空白对照组（P＜0.05）。转染组中犬RANKL/OPG的值下降趋势最为明显。裸鼠体内实验中转染组胶原膜也体现出较好的成骨能力。结论    重组腺病毒介导的hOPG基因可以促进PDLCs成骨。     

破骨细胞核因子κB受体活化因子配基和骨保护因子在种植体周围软组织及骨组织的表达

目的研究破骨细胞核因子κB受体活化因子配基（RANKL）及其伪受体骨保护因子（OPG）在非负荷期种植体周围软组织和骨组织中的表达变化及时间分布特点。方法选用6只1～2岁龄的雄性Beagle犬建立种植义齿动物模型,分别观测种植体植入后3、7、15、30、60、90 d种植体周围的骨改建情况。取种植体周围软组织进行实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）;取犬下颌骨进行大体标本观察拍摄X线片;取种植体周围骨组织进行免疫组化染色,检测RANKL和OPG随时间的表达变化及分布特点。结果骨改建的最活跃期为种植体植入后的第7天,种植体周围软组织中的RANKL和OPG mRNA及骨组织中的RANKL和OPG均随种植体植入时间的增加而增加,第7天达高峰,而后均逐渐降低。RANKL和OPG在种植体周围软组织及骨组织中的表达变化规律一致。结论OPG和RANKL能在种植体周围软组织中表达,且变化规律与种植体周围骨组织改建过程一致。种植体周围组织可以通过OPG/RANKL系统参与破骨细胞的形成,调节骨质吸收,影响骨组织代谢微环境。     

rhIL一1α与1，25一（OH）2D3联合作用对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG的影响

目的：研究rhIL-1α与1,25-（OH）2D3联合作用对HPDLFs表达RANKL和OPG的影响,探讨牙槽骨改建的调节机制。方法：10μg/L rhIL-1α与1×10-8 mol/L1,25-（OH）2D3联合作用于体外培养的HPDLFs,于48h后收集细胞,利用荧光定量RT-PCR技术检测RANKL mRNA和OPG mRNA的表达,探讨RANKL/OPG比值的变化。结果：rhIL-1α和1,25-（OH）2D3都调节HPDLFs表达RANKL和OPG。rhIL-1α单独作用上调HPDLFs表达RANKL和OPG,增加RANKL/OPG比值（P〈0.05）;1,25-（OH）2D3单独作用则上调表达RANKL,下调表达OPG,增加RANKL/OPG比值（P〈0.05）。这2种调节因子联合作用对HPDLFs RANKL表达有协同作用,但对RANKL/OPG比值的影响无协同效应。结论：rhIL-1α和1,25-（OH）2D3都通过RANKL-OPG途径调节HPDLFs参与牙槽骨改建,2种调节因子联合作用对RANKL表达的影响明显优于单因素诱导效果,但对RANKL/OPG比值的影响并没有产生协同效应或累加效应。     

非负荷期种植体周围破骨细胞核因子κB受体活化因子配基、骨保护因子mRNA的表达变化

目的研究破骨细胞核因子κB受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL）及其伪受体骨保护因子（osteoprotegerin,OPG）的mRNA在非负荷期种植体周围骨改建中的表达变化及时间分布特点。方法选用6只1~2岁龄的雄性Beagle犬建立种植义齿动物模型,观测种植体植入后3、7、15、30、60、90 d,种植体周围的骨改建情况。拍摄X线片,取种植体周围骨组织进行实时荧光定量PCR,检测RANKL和OPG mRNA随时间的表达变化及分布特点,取犬下颌骨进行大体标本观察。结果各时间段种植体与骨组织间均无明显间隙,种植体周骨密度随时间延长而增加,种植体周骨质无明显吸收。动物处死后,取下颌骨标本检查种植体动度,发现种植体无明显动度,金属杆叩击音清脆。骨改建的最活跃期为种植体植入后的第7天,种植体周围RANKL和OPG mRNA均随种植体植入时间的延长而增加,第7天达高峰,而后均逐渐降低。结论种植体周RANKL和OPG mRNA表达的变化规律与骨改建过程一致,RANKL和OPG可能与骨改建过程中破骨细胞的分化、形成和功能有关。     

RANKL和OPG在种植体周围软组织及骨组织的表达变化

目的：研究破骨细胞核因子κB受体活化因子配基（receptor activator nuclear factor kappa B ligand,RANKL）及其伪受体骨保护因子（osteoprotegerin,OPG）在非负荷期种植体周围软组织和骨组织中的表达变化及时间分布特点。方法：选用6只1-2岁龄左右的雄性Beagle犬建立种植义齿动物模型,分别观测种植体植入后3d、7d、15d、30d、60d和90d,种植体周围的骨改建情况。取种植体周围软组织进行实时荧光定量PCR,取犬下颌骨进行大体标本观察拍摄X线片,取种植体周围骨组织进行免疫组化染色,检测RANKL和OPG随时间的表达变化及分布特点。结果：骨改建的最活跃期为种植体植入后的第7d,种植体周围软组织中的RANKL和OPG mRNA及骨组织中的RANKL和OPG均随种植体植入时间的增加而增加,第7d达高峰,而后均逐渐降低。RANKL和OPG在种植体周围软组织及骨组织中的表达变化规律一致。结论：OPG和RANKL能在种植体周围软组织中表达,且变化规律与种植体周围骨组织改建过程一致。种植体周围组织可以通过OPG/RANKL系统参与破骨细胞的形成,调节骨质吸收,影响骨组织代谢微环境。     

牙槽裂两侧正畸牙移动后RANKL和OPG表达的研究

目的：研究牙移动后牙槽裂隙两侧破骨细胞核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和骨保护素（OPG）的表达和作用.方法：选用4只4月龄雄性Beagle犬建立牙槽裂模型,正畸牵引裂隙两侧牙齿向裂隙区移动,实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）检测裂隙两侧牙槽骨中RANKL和OPG mRNA的表达水平.结果：正畸牵引16～20周后,牙槽裂间隙缩小以至关闭,原裂隙处有新骨生成.裂隙两侧牙槽骨中RANKL和OPG mRNA表达增加.结论：牙槽裂两侧牙齿受正畸牵引后,RANKL与OPG参与骨重建,裂隙处骨改建活跃.此方法为修复牙槽裂提供新的思路.     

LPS刺激单核巨噬细胞培养上清对成骨细胞OPG/RANKL的影响

目的观察经牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清对小鼠成骨细胞MC3T3-E1 OPG/RANKL表达的影响。方法收集经100 ng/mL Pg-LPS刺激的单核巨噬细胞RAW264.7培养24 h后的上清,以不同稀释浓度（10%、20%、30%、40%和50%）的培养上清作用于MC3T3-E1 24h,分别通过RT-PCR、免疫印迹法(Western blotting)检测细胞OPG/RANKL基因和蛋白水平表达的变化,采用SPSS17.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果MC3T3-E1经不同稀释浓度的培养上清刺激后,其OPGmRNA及蛋白表达随浓度的增加而显著减少(P<0.05),而RANKLmRNA及蛋白表达随浓度的增加显著增加(P<0.05)。结论Pg-LPS刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清可通过抑制成骨细胞OPGmRNA及蛋白的表达,增加RANKLmRNA及蛋白的表达而抑制其成骨能力,且与浓度呈一定的正相关。     

牙龈卟啉单胞菌对纯钛表面成骨细胞表达OPG和RANKL mRNA的影响

目的:在转录水平上观察牙龈卟啉单胞菌对成骨细胞表达OPG及RANKL mRNA的影响.方法:用浓度分别为106、18CFU/mL的牙龈卟啉单胞菌刺激接种于纯钛表面的成骨细胞,24 h后提取各组成骨细胞总RNA并应用逆转录-聚合酶链式反应和mRNA比色定量的方法检测OPG及RANKL 基因表达.结果:MG-63成骨细胞基础表达较强的OPG mRNA及少量的RANKL mRNA,牙龈卟啉单胞菌以浓度依赖的方式增强RANKL mRNA的表达,减弱OPG mRNA的表达.结论:牙龈卟啉单胞菌通过上调RANKL/OPG的比率可间接的调节破骨细胞的活性从而影响支抗种植体周的骨代谢.     

壳寡糖对牙周炎大鼠牙槽骨吸收及Th17/Treg平衡和OPG/RANKL/RANK通路的影响

目的: 探讨壳寡糖对牙周炎大鼠牙槽骨吸收及Th17/Treg平衡和OPG/RANKL/RANK通路的影响。方法: 建立牙周炎大鼠模型,随机分为模型组、壳寡糖低剂量组、壳寡糖中剂量组、壳寡糖高剂量组和甲硝唑组,每组12只,另取12只作为对照组。分组处理后,评估牙龈指数、牙槽骨吸收值;H-E染色观察牙周组织病理形态学变化;流式细胞术检测外周血中Th17/Treg细胞比值;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组大鼠血清中IL-17、TGF-β、RANKL、OPG水平,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组大鼠牙周组织OPG、RANKL mRNA表达水平。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 与对照组相比,模型组大鼠牙周组织呈现牙周膜纤维束断裂、排列紊乱,毛细血管扩张、增生,炎症细胞浸润等病理损伤;牙龈指数、牙槽骨吸收值、Th17/Treg比值、血清RANKL及IL-17水平、牙周组织RANKL mRNA水平显著升高（P<0.05）,血清OPG及TGF-β水平、牙周组织OPG mRNA水平显著降低（P<0.05）。与模型组相比,壳寡糖低、中、高剂量组和甲硝唑组大鼠牙周组织病理损伤减轻;牙龈指数、牙槽骨吸收值、Th17/Treg比值、血清RANKL及IL-17水平、牙周组织RANKL mRNA水平显著降低（P<0.05）,血清OPG及TGF-β水平、牙周组织OPG mRNA水平显著升高（P<0.05）,且壳寡糖各组呈剂量依赖性,壳寡糖高剂量组与甲硝唑组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。结论: 壳寡糖可促使Th17/Treg平衡恢复正常,上调OPG表达,下调RANKL表达,抑制牙周炎大鼠牙槽骨吸收,改善其临床症状。     

氯磷酸二钠修饰羟基磷灰石对颌骨缺损修复的影响

目的研究氯磷酸二钠修饰羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)在体内外促进骨形成对骨缺损修复效果的影响。方法制备氯磷酸二钠-HA复合材料,以HA为对照;分离培养成骨细胞,接种于氯磷酸二钠-HA和HA支架,四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞增殖活性,测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,实时荧光定量PCR检测成骨细胞骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)、核因子-κβ受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa beta ligand,RANKL)mRNA表达的变化;进而将氯磷酸二钠-HA和HA植入兔下颌骨缺损区域,改良Masson染色及生物力学检测观察氯磷酸二钠对HA修复颌骨缺损的影响。结果 MTT和ALP活性检测表明成骨细胞在氯磷酸二钠-HA和HA支架上生长的增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,两组细胞RANKL mRNA表达无明显变化,而氯磷酸二钠-HA组OPGmRNA显著上调(P<0.05)。改良Masson染色表明,与HA相比,氯磷酸二钠-HA更有利于材料周围新骨形成。生物力学检测结果表明氯磷酸二钠-HA组的压缩强度、拉伸强度、剪切强度均大于HA组(P<0.05)。结论复合在HA表面的氯磷酸二钠可能通过上调成骨细胞OPG表达,促进新骨形成,提高骨缺损修复的生物力学性能。