机械应力刺激对成牙骨质细胞骨桥蛋白表达影响的研究

目的研究机械应力刺激对成牙骨质细胞矿化相关基因骨桥蛋白（osteopontin,OPN）mRNA表达的影响。方法本研究设3个实验组和1个对照组,利用四点弯曲细胞力学加载装置,对体外培养的成牙骨质样细胞OCCM-30施加2 000μstrain张应力2、000μstrain压应力和4 000μstrain压应力,对照组不加力。分析加力3 h、6 h、12 h、24 h时成牙骨质样细胞OCCM-30 OPN mRNA表达差异,对数据进行统计学分析。结果和对照组相比,2 000μstrain压应力组和4 000μstrain压应力组在加力初期（3 h）OPN的mRNA表达增加,加力后期（24 h）其mRNA表达受到抑制,差异有统计学意义（P〈0.05）;2 000μstrain张应力组在加力3 h、6 h和对照组相比,OPN mRNA的表达差异无统计学意义（P〉0.05）,加力12 h、24 h OPN mRNA的表达受到抑制,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论机械应力刺激可以调节成牙骨质细胞OPN mRNA的表达,可能由此影响牙根吸收和修复过程。     

骨髓间充质干细胞对机械张应力刺激的反应及转化生长因子-β和胰岛素样生长因子-Ⅱ的基因表达

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）对机械张应力刺激的反应及力学刺激下转化生长因子-β（TGF-β）和胰岛素样生长因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）基因表达的规律。方法分离培养大鼠骨髓MSCs,应用四点弯曲加力系统对细胞施加单一周期的机械张应力刺激（2 000 με,40 min）。检测MSCs细胞增殖及碱性磷酸酶（ALP）活性,并采用实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β和IGF-Ⅱ的基因表达。结果机械张应力刺激下,MSCs的增殖活力、ALP活性以及TGF-β和IGF-Ⅱ的基因表达均显著增高。TGF-β和IGF-II的mRNA水平在加力后瞬时达最高水平;与对照细胞比较,分别增加了51.44和8.92倍。除加力后6 h有少许增高外,TGF-β和IGF-Ⅱ的表达随时间逐步下降,并于加力后12 h恢复到对照组水平。结论机械张应力刺激可促进MSCs增殖,提高其ALP活性,使TGF-β和IGF-Ⅱ基因表达呈时间依赖性上调,并最终诱导MSCs向成骨细胞分化。机械力学刺激是MSCs骨向分化的关键驱动因子,对牵张成骨骨痂形成具有重要的作用。     

Wnt／β-catenin信号通路在大鼠骨髓间充质干细胞牵张中的表达

目的：了解经典Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞（BMSCs）加载牵张中的作用。方法：分离培养大鼠BMSCs,通过自行研制的细胞加载装置．对BMSCs施加机械张应力刺激。用实时荧光定量RT—PCR与Western印迹检测Wnt3A、B—catenin与Lef-1的表达,同时检测BMSCs细胞增殖及骨向分化转录因子Runx2与成骨因子碱性磷酸酶（ALP）的变化情况。所得数据应用SPSS19．0软件包进行配对￡检验。结果：在牵张力刺激下,经典Wnt信号通路的3个关键分子Wnt3A、β-atenin与IJef_因表达显著增强（P〈0．05）。BMSCs的增殖、Runx2表达以及ALP活性也在加力后增强（P〈0．05）。结论：张应力加载激活了经典Wnt信号通路．并刺激BMSCs增殖与骨向分化,提示Wnt／β-catenin参与了牵张成骨的分子调控过程。     

不同加载时间周期性张应力对大鼠颅底软骨细胞的影响

目的: 构建颅底软骨细胞体外培养力学刺激模型,研究周期性张应力对颅底软骨细胞主要细胞外基质（Ⅱ型胶原）和Sox9表达的影响。方法: 采用FX-5000T应力加载系统对体外培养的第2代大鼠颅底软骨细胞分别施加3、6、12、24 h的周期性张应力,加力值均为10%形变率,频率均为1 Hz。加力后即刻收集细胞,提取总RNA,实时荧光定量 PCR技术检测颅底软骨细胞Ⅱ型胶原（type-Ⅱcollagen,Col-Ⅱ）和Sox9 mRNA的表达。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 与对照组（加力0 h）相比,加力3 h组Col-Ⅱ和Sox9表达下降,且后者有显著差异（P<0.05）;加力6 h组Col-Ⅱ和Sox9表达显著下降（Col-Ⅱ,P<0.01;Sox9,P<0.05）;加力12 h组Col-Ⅱ和Sox9表达较6 h组有所上升,与对照组相比差异无统计学意义;加力24 h组中,两者表达与对照组相比显著升高（P<0.05）。结论: 周期性张应力可影响颅底软骨细胞增殖及细胞外基质合成,加力短时间基质合成抑制,增加加力时间则明显促进基质合成,且成软骨分化标志物Sox9 mRNA表达水平差异先于Col-Ⅱ出现。     

张应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞Runx2表达调控的体外研究

目的 研究张应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞Runx2表达的调控。方法 以成牙骨质细胞样细胞OCCM30为研究对象,应用FX4000T应力加载装置对其加载张应力,时间为0、3、6、12 h,然后分别使用不同质量浓度的Dikkopf-1（DKK1）处理48 h,采用Western blot法检测β-catenin蛋白的表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应法（RT-PCR）检测Runx2 mRNA的表达水平。选取最佳作用时间点（12 h）和最佳阻断剂质量浓度（150 ng•mL-1）,将样本分为A、B、C、D共4组,A组不加力不加阻断剂,B组加力加阻断剂,C组加力不加阻断剂,D组不加力加阻断剂,测量β-catenin蛋白和Runx2 mRNA的表达水平。结果 1）张应力加载3、6、12 h后,Runx2 mRNA表达水平和β-catenin蛋白水平与对照组相比均明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。2）不同质量浓度DKK1处理后,细胞内Runx2 mRNA的表达量呈下降趋势。3）未加载张应力的情况下,DKK1明显抑制了β-catenin蛋白的表达,Wnt/β-catenin通路被抑制;加载张应力情况下,DKK1处理组β-catenin蛋白表达低于未加DKK1处理组;不加阻断剂的情况下,张应力刺激增强了β-catenin蛋白的表达;阻断剂作用后,应力刺激组β-catenin蛋白表达相对较高。结论 机械应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路可正向调控成牙骨质细胞Runx2基因的表达。     

机械应力刺激对成牙骨质细胞骨涎蛋白mRNA表达影响的体外研究

目的研究机械应力刺激对成牙骨质细胞矿化相关基因骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）mRNA表达的影响。方法利用四点弯曲细胞力学加载装置,以体外培养的成牙骨质样细胞OCCM-30为研究对象,运用实时荧光定量技术,比较2 000、4 000μstrain张应力和压应力加载组和不加力组OCCM-30在3 h、6 h、12 h、24 hBSP mRNA表达差异。结果和对照组相比,2 000、4 000μstrain的张应力和压应力在4个时间点均抑制OCCM-30 BSP mRNA的表达,且差异有统计学意义（F=5.614,P〈0.05）。结论成牙骨质细胞是力学敏感性细胞,机械应力刺激通过影响其BSP mRNA的表达,进而可能影响成牙骨质细胞在牙根吸收和修复中的作用。     

体外张应力对人牙周膜细胞串珠素表达的影响

目的： 观察体外周期性张应力对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells, hPDLCs）串珠素的表达影响,探讨应力作用下牙周组织改建的分子机制。方法：采用酶消法分离培养hPDLC,通过应力加载仪对细胞施以12% elongation、1 Hz的单轴张应力。加力时长分别为0、12、24、48 h。然后通过实时定量PCR和ELISA方法分别检测张应力下不同时间点串珠素基因和蛋白的表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：张应力加载后,串珠素mRNA在加力的前12 h内表达水平出现短暂升高,但无显著差异。随着加力时间延长,mRNA表达持续下降,48 h后达到最低水平,至对照组的0.28±0.05 (P<0.05);而细胞基质内的串珠素蛋白表达则随着加力时间一直下降,48 h后从（14.03±0.71） pg/mL（对照组）降低到最低水平（11.06±0.15） pg/mL,差异显著（P<0.05）。结论：张应力刺激可下调人牙周膜细胞串珠素基因及蛋白表达,下降趋势与时间具有相关性,提示串珠素可能在牙周膜对机械力刺激的反应中发挥作用。     

张应力下成骨性转录因子在骨髓间充质干细胞中的表达

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对单一周期的机械力刺激的反应以及Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达.方法:密度梯度离心法体外分离培养大鼠骨髓MSCs;应用四点弯曲加力系统对细胞施加40 min、2 000μ8的机械牵张力,检测MSCs细胞增殖及ALP活性,并采用实时荧光定量RT-PCR检测Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达.结果:机械力刺激下,MSCs的增殖活力、ALP活性以及Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达均显著增高.Ets-1表达较早,加力后0.5 h达到最高峰;而Cbfa1表达较晚,加力后6 h达到最高峰;ALP的表达与Cbfa1相似.3个基因表达增高均在6～12 h后恢复到正常水平.结论:单一周期的张应力可诱导Ets-1、Cbfa1和ALP在MSCs中呈时间依赖性表达,并促使MSCs短暂性骨向分化.机械力刺激是MSCs骨向分化的关键驱动因子,对牵张成骨骨痂形成具有重要的作用.     

张应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及其差异基因表达分析

目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）在张应力作用下成骨向分化及其相关基因的差异表达。方法密度梯度离心法体外分离培养大鼠骨髓MSCs;应用四点弯曲加力系统对细胞施加2 000 με的机械牵张力,骨钙素免疫组化染色、碱性磷酸酶（ALP）活力测定MSCs骨向分化,cDNA芯片技术对加力前后MSCs进行mRNA检测,通过芯片杂交、生物信息处理,分析二者间基因差异表达。结果MSCs经应力加载后,其细胞生长曲线与对照组相比差别不大,但骨钙素表达水平和ALP活性显著增高,27 K Rat Genome Array芯片发现,加载前后MSCs表达差异基因共有416条（2.8%）,其中表达增强247条（61条显著增强）,表达降低169条（74条显著降低）。结论张应力可诱导MSCs骨向分化,而差异表达的基因可能在这一过程中起重要作用。     

骨保护素修饰的Beagle犬骨髓基质细胞表达体系的建立与鉴定

目的利用pSecTag2/B-OPG真核分泌表达穿梭载体,建立经骨保护素基因（OPG）修饰的Beagle犬骨髓基质细胞（BMSC）瞬时表达体系并检测其表达能力,为基因工程与组织工程联合治疗牙周病提供细胞基础。方法体外分离、培养Beagle犬BMSC,通过脂质体法将已鉴定的目的基因瞬时转染至BMSC,并用RT-PCR鉴定OPG是否有录,同时通过Western blot方法检测OPG在6周内的表达水平。结果重组质粒pSecTag2/B-OPG经HindⅢ单酶切及EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,电泳显示切下的片段均与预期大小相符,经测序证实此基因与GeneBank中[gi：33878056]提供的序列一致;鉴定正确的重组质粒在BMSC中有转录,并且在39 d内都明显有OPG表达。结论建立了骨保护素基因修饰的骨髓基质细胞瞬时表达体系。     

颊粘膜鳞癌中p27~(Kipl)基因的蛋白质表达及临床意义

目的　分析口腔颊癌癌变过程中 p2 7蛋白表达与临床病理资料及预后的关系 ,阐明 p2 7蛋白检测在颊癌诊断与治疗中的临床意义。方法　回顾性研究 40例颊癌、2 0例白斑及 7例正常颊粘膜 p2 7蛋白表达情况 ,采用 SP法根据染色指标计数 ,并利用 Cox比例风险模型进行生存多因素分析。结果　 p2 7多分布于上皮细胞核和胞浆 ,正常组织和不伴上皮异常增生的白斑表达最强 ,伴上皮异常增生的白斑及颊癌分化较好的强阳性表达较多 ,分化较差的颊癌 p2 7表达最弱 ,甚至不表达。单因素生存分析表明 ,p2 7表达、区域淋巴结和远处转移与生存期显著相关 ,多因素 Cox回归分析表明 p2 7蛋白表达可作为辅助性颊癌预后指标。结论　 p2 7蛋白表达与口腔肿瘤的发生发展有密切关系 ,它与肿瘤的侵袭性生长及预后密切相关 ,可作为一个新的辅助性预后指标     

The therapeutic role of bone marrow stem cell local injection in rat experimental periodontitis

Mesenchymal stem cell therapy brings hope for regenerating damaged periodontal tissues. The present study aimed to investigate the therapeutic role of local bone marrow stem cell (BMSC) injection in ligation-induced periodontitis and the underlying mechanisms. Alveolar bone lesion was induced by placing ligatures subgingivally around the bilateral maxillary second molars for 28 days. The alveolar bone lesion was confirmed by micro-CT analysis and bone histomorphometry. Allogeneic BMSC transplantation was carried out at 28 day after ligation. The survival state of the transplanted BMSC was observed by bioluminescent imaging. The implantation of the BMSC into the gingival tissues and periodontal ligament was confirmed by green fluorescent protein (GFP) immunohistochemical staining. The expression level of pro-inflammatory, tumour necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β), and receptor activator of nuclear factor-κ B ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) in periodontal tissues were evaluated by immunohistochemical staining and real-time PCR. Significant reverse of alveolar bone lesion was observed after BMSC transplantation. The expression of TNF-α and IL-1β was down-regulated by BMSC transplantation. The number of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)-positive osteoclasts in the periodontal ligament was reduced, and the increased RANKL expression and decreased OPG expression were also reversed after BMSC transplantation. It is concluded that allogeneic BMSC local injection could inhibit the inflammation of the periodontitis tissue and promote periodontal tissue regeneration.     

BCOR基因敲除促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

目的研究BCL6共抑制因子-BCOR对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法利用慢病毒载体的BCORshRNA基因敲除BCOR,进行丧失性功能研究。通过检测ALP活性、茜素红染色、钙离子定量分析、成骨分化相关基因的表达,观察骨髓间充质干细胞体外成骨分化能力。结果BCOR在牙源性间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的表达无明显差异。基因敲除BCOR促进了骨髓间充质干细胞ALP活性、体外矿化能力及成骨分化相关基因骨涎蛋白、骨钙素的表达。结论BCOR基因表达降低能促进骨髓间充质干细胞成骨分化,证实BCOR是骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制基因。     

不同加载频率拉应力对髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的:探讨不同加载频率的拉应力对髁突软骨细胞增殖、分化的影响。方法:体外分离2周龄新西兰兔髁突软骨细胞,对细胞施加2 h/d,为期3 d的不同频率(0 Hz、0.1 Hz、0.5 Hz、1 Hz)的拉应力。采用CCK8检测细胞增殖水平,实时荧光定量RT-PCR检测Sox9、Runx2、VEGF的表达。结果:细胞增殖水平在静止性(0 Hz)组显著高于周期性加力(0.1~1 Hz)组和对照组;Sox9、Runx2、VEGF表达在0.5 Hz组和1 Hz组显著高于静止性(0 Hz)组和对照组。结论:不同加载频率拉应力对髁突软骨细胞增殖分化有差异性影响。     

骨形态发生蛋白6对张应力下大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白-6(BMP-6)对张应力作用下大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成骨向分化的影响。方法:应用四点弯曲加力系统对体外分离培养大鼠BMMSCs施加不同大小的周期单一张应力60 min,2 h后检测检测内源性BMP-6的表达量,同时检测碱性磷酸酶、骨钙素表达量和进行成骨细胞转录因子-2mRNA定量分析。然后对体外分离培养转染人BMP-6复制缺陷型病毒的大鼠BMMSCs施加4000μstrain的周期单一张应力60 min,2 h后检测成骨标志表达。结果:随着张应力的增大,BMP-6的表达逐渐增强,同时成骨能力亦增强,但2000 μstrain以后BMP-6的表达与成骨能力均下降。4000 μstrain条件下2 h后转染人BMP-6基因的大鼠BMMSCs各项成骨标志因子的检测明显强于转染空白病毒。结论:适当的张应力可促进BMP-6表达上调和BMMSCs骨向分化,上调BMP-6的表达可以恢复过大张应力所致的成骨能力下降。     

内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞－种植体复合物成骨能力的影响

目的：研究内皮祖细胞（EPCs）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜片－种植体复合体成骨能力的影响。方法：分离培养大鼠 BMSCs 并采用细胞膜片技术培养细胞膜片;分离培养大鼠骨髓来源 EPCs;将 EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片上并检测相关基因;制作细胞膜片－种植体复合体并植入裸鼠皮下,8周取材,行 Micro-CT 检查及组织学检测。结果：体外实验显示EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片后成骨相关 Runx-2、ALP、BMP2和成血管相关 VEGF 的基因表达提高;裸鼠体内实验取材 Mi-cro-CT 检查显示加载 EPCs 组成骨量较高,HE 切片显示加载 EPCs 组成骨面积较多,免疫组化检测显示加载 EPCs 组 Runx2、BMP2表达较高。结论：加载 EPCs 能提高 BMSCs-种植体复合物的成骨能力。     

组蛋白甲基化促进AP2a基因表达及骨髓间充质干细胞成骨分化

目的研究转录因子AP2a的组蛋白甲基化状态对骨髓间充质干细胞成骨分化功能的影响。方法利用染色质免疫沉淀技术检测AP2a启动子甲基化状态。利用慢病毒载体的AP2ashRNA基因敲除AP2a进行丧失性功能研究。通过ALP活性、茜素红染色及钙离子定量分析研究骨髓间充质干细胞体外成骨分化能力。结果与牙源性间充质干细胞相比,AP2a在骨髓间充质干细胞中表达明显升高,AP2a启动子区域H3K4me3和H3K36me2明显增强。基因敲除AP2a能抑制骨髓间充质干细胞ALP活性及体外矿化能力。结论AP2a启动子区域H3K4me3和H3K36me2升高可以促进AP2a的表达和骨髓间充质干细胞成骨分化能力。