RNA干扰对胆囊癌细胞上皮细胞黏附因子表达的影响

目的:观察RNA干扰(RNAi)对胆囊癌GBC-SD细胞株中上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EP-CAM)表达的抑制作用。方法:针对EP-CAM基因的不同位点构建4个miRNA重组质粒。经DNA测序后,用LipofectamineTM2000介导转染人胆囊癌GBC-SD细胞株,48 h后用RT-PCR和Western blot检测EP-CAM的mRNA和蛋白的表达变化情况。结果:经测序分析证实,靶向EP-CAM的4个miRNA重组质粒均构建成功。RT-PCR及Western Blot技术显示,4个重组质粒均不同程度地抑制靶基因EP-CAM的表达。结论:针对人EP-CAM基因的miRNA表达载体能有效地下调GBC-SD细胞中EP-CAMmRNA及蛋白的表达。     

肝素酶特异性RNAi对人食管癌移植瘤组织中Hpa基因表达的影响

目的:应用RNAi技术沉默肝素酶(heparanase,Hpa)基因,探讨其对人食管癌裸鼠移植瘤组织中Hpa基因表达的影响.方法:①先转染后成瘤:采用浓度为15 μmol/L体外合成的Hpa小分子干扰RNA(siRNA)转染EC9706细胞72 h,另设无关序列组及空白对照组.然后将转染后的EC9706细胞种植于裸鼠皮下构建裸鼠食管癌移植瘤,待瘤体长至足够大时,取瘤组织;②先成瘤后转染:构建裸鼠食管癌移植瘤模型,待肿瘤长出1周后,依每次3 μg/只腹腔注射siRNA及无关序列,连续3 d,另1组仅注射PBS作空白对照,然后取瘤组织.采用免疫组化及原位杂交技术观察各组瘤组织中肝素酶蛋白及mRNA的表达.结果:无论是先转染后成瘤组还是先成瘤后转染组siRNA均可下调裸鼠食管癌移植瘤组织中Hpa蛋白及mRNA的表达,与无关序列组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:应用RNAi技术沉默Hpa基因可以有效下调裸鼠食管癌移植瘤组织中Hpa蛋白及mRNA的表达,为临床防治食管癌浸润转移奠定了一定的理论基础.     

PTTG反义cDNA对胆囊癌细胞5-FU敏感性的影响

目的:探讨垂体肿瘤转化基因(PTTG)反义cDNA对胆囊癌GBC-SD细胞系5-FU化疗敏感性的影响.方法:脂质体法将PTTG反义cDNA转染胆囊癌细胞GBS-SD;G418筛选阳性克隆;Western blot检测PTTG蛋白;MTT检测细胞增殖情况及不同浓度5-FU作用下各组细胞相对存活率差别,计算IC50值;流式细胞术检测各组细胞凋亡率.结果:转染组细胞较未转染组PTTG表达明显减少;转染组细胞增殖与凋亡明显增强;转染组IC50值(0.605 mmol/L)明显低于未转染组(1.17 mmol/L)和空载体转染组(0.914 mmol/L);转染组细胞的5-FU凋亡诱导作用(26.24%)明显高于未转染组(2.67%)和空载体转染组(7.62%).结论:转染PTTG反义cDNA可增强胆囊癌细胞对5-FU化疗敏感性,二者联合应用可能是一种治疗胆囊癌的有效方法.     

缺氧诱导因子-1α在胆囊癌侵袭转移中的作用研究

目的 :研究缺氧诱导因子-1α在胆囊癌侵袭转移中的作用,并探讨HIF-1α在判断胆囊癌治疗效果及预测胆囊癌复发转移方面的价值。方法 :采用慢病毒对胆囊癌细胞系(GBC-SD)进行转染,干扰该细胞系中HIF-1α的表达,得到HIF-1α表达不受干扰的胆囊癌细胞系(GBC-SD-NC)和HIF-1α表达受干扰的胆囊癌细胞系GBC-SD-HIF。通过将两组细胞系裸鼠鼠尾静脉注射建立胆囊癌血行转移模型,检测两组细胞在小鼠肺部形成转移瘤的能力。结果 :GBC-SD-NC组裸鼠肺部转移瘤数量、大小都比GBC-SD-HIF组高,GBC-SD-NC组转移瘤的平均数量显著多于GBC-SD-HIF组。结论 :干扰胆囊癌细胞中HIF-1α的表达,可以显著减低胆囊癌细胞系GBC-SD的血行肺转移能力。说明缺氧诱导因子-1α在胆囊癌侵袭转移中存在独立影响。     

RNA干扰Heparanase基因表达对胆囊癌侵袭性影响的体外研究

目的:利用RNA干扰技术沉默人胆囊癌GBC-SD细胞中乙酰肝素酶(heparanase,HPA)基因的表达,探讨抑制HPA基因后对GBC-SD细胞侵袭性的影响.方法:构建靶向人HPA基因miRNA重组质粒,采用脂质体转染法将质粒转染入人胆囊癌GBC-SD细胞,RT-PCR检测转染前后HPA mRNA表达情况,选出对HP...     

肝素酶特异性RNAi对人食管癌EC9706细胞肝素酶基因表达的影响

目的:探讨RNAi技术对人食管癌EC9706细胞肝素酶(heparanase,Hpa)基因表达的影响.方法:针对Hpa不同基因位点设计合成寡核苷酸,然后转录为小分子干扰RNA(siRNA),分别用浓度为10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L的siRNA经LipofectamineTM 2000脂质体介导转染EC9706细胞72 h,同时设无关序列组及不转染组.采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中Hpa基因的表达.结果:siRNA可有效抑制人食管癌EC9706细胞Hpa基因的表达,以15 μmol/L的siRNA作用效应最强,但不同浓度siRNA两两相比,差异均无统计学意义(P＞0.05),不同浓度siRNA对Hpa基因表达的抑制效应均显著强于无关序列组及不转染组(P＜0.05).结论:RNAi技术可有效抑制人食管癌EC9706细胞Hpa基因的表达.     

上皮细胞黏附分子、乙酰肝素酶在胆囊癌中的表达及其意义

目的：观察上皮细胞黏附分子（Ep-CAM）和乙酰肝素酶（Hpa）在原发性胆囊癌的表达,并探讨它们在原发性胆囊癌发生、发展中的作用。方法：应用免疫组织化学EliVisionTM plus染色法检测50例原发性胆囊癌组织、20例胆囊腺瘤组织和20例慢性胆囊炎组织标本中Ep-CAM和Hpa的表达情况。结果：Ep-CAM胆囊癌组阳性率高于胆囊炎组（P〈0.05）;Hpa胆囊癌组与胆囊腺瘤及慢性胆囊炎组阳性率差异均有统计学意义（P〈0.05）。Ep-CAM、Hpa阳性率与Nevin分期均有一定关系（P〈0.05和P〈0.01）。Ep-CAM过表达与非过表达患者的中位生存时间分别为13个月、24个月。结论：Ep-CAM和Hpa表达可能在胆囊癌的发生及疾病进展过程中起重要作用,并可能作为判断胆囊癌转移的有用指标。Ep-CAM可能是胆囊癌重要的预后指标之一。     

miR-181靶向TIMP3调控胆囊癌细胞迁移及侵袭的实验研究

目的研究miR-181靶向金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)调控胆囊癌细胞迁移及侵袭的作用。方法培养胆囊癌GBC-SD细胞,转染miR-181 mimic、阴性对照(NC)mimic、TIMP3 siRNA、NC siRNA、表达TIMP3的重组质粒、空白质粒,荧光定量PCR检测miR-181的表达量,Western blot检测TIMP3的表达量,Transwell检测细胞迁移和侵袭活力,生物信息学分析及荧光素酶报告基因实验验证miR-181靶向TIMP3;皮下注射转染miR-181 mimic或NC mimic的GBC-SD细胞后建立荷瘤鼠模型,检测移植瘤质量及miR-181、TIMP3表达量。结果细胞实验显示:转染miR-181 mimic促进细胞迁移及侵袭、抑制细胞中TIMP3的表达及双荧光素酶报告基因的荧光素酶活力;转染TIMP3 siRNA促进细胞迁移及侵袭;转染表达TIMP3的重组质粒后,miR-181 mimic促进细胞迁移、侵袭的作用减弱。动物实验显示:转染miR-181 mimic使移植瘤的质量减轻、移植瘤中TIMP3的表达增加。结论 miR-181具有促进胆囊...     

VEGF反义寡核苷酸抑制胆囊癌生长增殖和凋亡的体外实验研究

目的:探讨VEGF反义寡核苷酸转染对人胆囊癌GBC-SD细胞生长、增殖和凋亡的影响。方法:运用Oligofectamine介导VEGF反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)和错义寡核苷酸(Scrambled Oligodeoxynucleotide,SODN)转染人胆囊癌(GBC-SD)细胞。采用MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率,流式细胞术检测转染后不同时间各组细胞凋亡情况。结果:SODN组、SODN十Oligofectamine组对GBC-SD细胞生长无显著影响(P>0.05),ASODN组及ASODN十Oligofectamine组则能显著抑制GBC-SD细胞生长(P<0.05),且ASODN十Oligofectamine组对GBC-SD细胞生长增殖抑制作用较ASODN组更为强(P<0.05)。流式细胞术检测结果发现ASODN十Oligofectamine组能促进GBC-SD细胞凋亡(P<0.05)。结论:VEGFASODN转染能抑制胆囊癌GBC-SD细胞生长和增殖,Oligofectamine介导能明显增强VEGF ASODN的抑制作用;Oligofectamine介导VEGF反义寡核苷酸转染能促进胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡。     

重组小鼠血管抑素基因转染抗血管生成治疗胆囊癌的实验研究

目的:研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白,以及对裸鼠种植性胆囊癌生长的抑制作用. 方法:应用脂质体lipofectamine2000将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒pcDNA3.1( )-angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC-SD,G418抗性筛选;以Western blot检测血管抑素的表达,以血管内皮细胞增殖分析检测其生物学活性,接种裸鼠并比较肿瘤体积和肿瘤微血管密度(MVD). 结果:得到表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖(P＜0.01);血管抑素组裸鼠肿瘤体积小于野生细胞对照组(P＜0.01),免疫组化检测显示血管抑素组裸鼠肿瘤微血管密度(MVD)低于野生细胞对照组(P＜0.05). 结论:血管抑素基因转染对裸鼠种植性胆囊癌的生长有抑制作用,这是血管抑素组肿瘤组织内新生血管形成受到抑制而减少所致.     

野生型p53基因抑制胆囊癌细胞裸鼠体内生长的实验研究

目的：研究转染野生型p53（wtp53）基因对胆囊癌细胞裸鼠体内生长的影响。方法：在脂质体介导下将含有wtp53的真核表达质粒pCMV—p53，导入GBC—SD细胞中。用G418筛选，建立转染克隆细胞系。以PCR、RT—PCR和蛋白质印迹法证实外源p53基因的整合与表达。用裸鼠移植瘤试验检测体内致瘤性的影响。结果：野生型p53基因成功的导入胆囊癌细胞系，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。表达外源wtp53的GBC—SD—wtp53细胞，裸鼠体内致瘤性受到显著抑制。结论：野生型p53基因可有效抑制胆囊癌细胞在裸鼠体内的生长。     

siRNA沉默膀胱癌肝素酶基因对T24细胞增殖及MMP-2表达的影响

目的研究siRNA干扰沉默膀胱癌肝素酶基因对T24细胞增殖及MMP-2表达的影响 方法体外化学合成肝素酶特异性小干扰RNA（siRNA），用脂质体2000转染至T24膀胱移行细胞癌细胞内，常规分为正常对照组、空白对照组、阴性对照组和转染实验组进行实验，用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况，反转录聚合酶链法（RT-PCR）检测肝素酶基因的表达，免疫细胞化学方法检测MMP 2的表达。结果RNA干扰沉默T24膀胱移行细胞癌细胞肝素酶基因后，T24细胞增殖活力下降，三个不同干扰组细胞活力分别下降了(28.55±3.66)%、(27.20±3.25)%和(37.29±4.82)%。肝素酶mRNA表达下降，膀胱移行细胞癌细胞中MMP-2（明胶酶A）的表达亦明显下降（P均＜0.05）。结论RNA干扰肝素酶基因后，细胞活力及肝素酶mRNA表达水平下降并且明显抑制膀胱癌细胞中MMP-2的表达。     

槲皮素对人鼻咽癌细胞生长和AKT/mTOR通路表达的影响

目的：探究槲皮素对人鼻咽癌5-8F细胞生长和AKT/mTOR通路表达的影响。方法：采用不同浓度槲皮素（20、40和60 μmol/L）处理人鼻咽癌5-8F细胞24 h、48 h和72 h后,MTT法检测细胞生长情况;荧光定量PCR和Western blot检测经不同浓度槲皮素处理后的5-8F细胞中AKT和mTOR的表达水平。裸鼠皮下接种5-8F细胞建立裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,随机分为对照组和槲皮素处理组,每7天测量肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线;Western blot检测肿瘤组织中AKT和mTOR蛋白表达水平;免疫组织化学法检测肿瘤组织内AKT和mTOR的表达。结果：槲皮素处理组与对照组相比,5-8F细胞生长明显受抑制（P＜0.05）。槲皮素可降低5-8F细胞中AKT和mTOR的表达水平（P＜0.05）。体内实验中,槲皮素处理组的裸鼠肿瘤体积显著受抑制（P＜0.05）,且肿瘤组织中AKT和mTOR的表达水平降低（P＜0.05）。结论：槲皮素可抑制鼻咽癌细胞5-8F细胞生长,抑制AKT/mTOR通路表达。     

SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤的建立和鉴定

目的:建立多药耐药人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型并探讨移植瘤的耐药特性。方法:将人胃癌细胞株SGC-7901和耐药细胞株SGC-7901/HCPT分别接种于裸小鼠左侧背部皮下和右侧背部皮下,在SPF级动物合格环境下饲养,观察肿瘤细胞成瘤情况,用MTT法比较移植瘤细胞对羟基喜树碱的敏感性及免疫组化测定其耐药基因TOPO-Ⅰ表达的变化。结果:SGC-7901和SGC-7901/HCPT裸小鼠移植成瘤率为100%,无自行消退现象。MTT法测定SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分别为4.686μg/mL和4.381μg/mL,与移植前细胞比较,差异无统计学意义。耐药基因TOPO-Ⅰ表达分别为2.964±0.162和2.953±0.172,差异无著性意义。结论:以SGC-7901/HCPT细胞建立的裸鼠皮下耐药移植瘤模型,仍保持体外的耐药活性和基因表型,为耐药机制和逆转的研究提供了良好的动物模型。     

小干扰RNA沉默MAT1基因治疗胰腺癌的实验研究

目的了解体外转录法合成的小干扰RNA（siRNA）沉默MAT1基因对胰腺癌的体内体外抗癌效应。方法用siPORT-脂质体（1ipid）中性阳离子脂质体转染由体外转录法合成、Cy3荧光标记的双链siRNA人胰腺癌BxPC3细胞,观察对胰腺癌细胞生长和细胞周期曲线的影响,检测MAT1基因被siRNA沉默后mRNA和蛋白质的表达水平。在裸鼠胰腺癌皮下移植瘤瘤体内直接注射siRNA观察抑瘤效应。结果合成的4条MAT1-siRNA序列中有一半可显著抑制BxPC3细胞的生长。体外转染MAT1-siRNA72h后,BxPC3细胞生长抑制率达34．9％（P〈0．01）;83．9％的BxPC3细胞滞留于G。／G,期,而空白对照组仅59．86％（P〈0．01）。体外转染MAT1-siRNA48h后MAT1-mRNA水平下调了80．12％,72h后MAT1蛋白质水平下调了50．12％,与各对照组相比差异均有统计学意义（均P〈0．01）。MAT1-siRNA注射组裸鼠移植瘤重量和体积均明显低于对照组（均P〈0．05）,抑瘤率达42．53％。结论siRNA介导的MAT1基因沉默在体外实验中显著抑制了胰腺癌细胞的生长,在体内实验中对裸鼠胰腺癌皮下移植瘤产生明显的抑瘤效应。     

Role of silencing phosphatase of regenerationg liver-3 expression by microRNA interference in the growth of gastric cancer

Background Accumulated evidences demonstrate that phosphatase of regeneration liver-3 （PRL-3） is associated with metastasis of multiple tumor types, and has been validated as a potential therapeutic target for metastasis. High expression of PRL-3 was implicated in lymph node metastasis of gastric cancer. In the present study, we investigated the role of silencing PRL-3 expression by microRNA （miRNA） interference in gastric cancer growth. Methods RNA interference, mediated by recombinant lentivirus expressing artificial PRL-3 miRNA, was employed to knockdown PRL-3 expression in human SGC7901 gastric cancer cells. MTT assay and tumor implantation experiment were conducted to determine the role of PRL-3 in the proliferation of SGC7901 cells and tumor growth. Results Transfection of recombinant lentivirus expressing artificial PRL-3 miRNA significantly suppressed the proliferation of SGC7901 cells in vitro. The implanted tumor size of the PRL-3 transfection group was （1.92±0.18） cm^3, significantly smaller compared with controls （P 〈0.001）. Conclusions Knockdown of PRL-3 significantly suppressed the proliferation of SGC7901 cells in vitro and tumor growth in vivo. PRL-3 plays a key role in the growth of gastric cancer. PRL-3 should be considered as a potential therapeutic target.     

金属蛋白酶MMP-9表达与人黑色素瘤细胞系转移表型的相关性

目的 :探讨金属蛋白酶MMP 9与肿瘤转移的相关性。方法 :利用基因重组技术构建反义MMP 9cDNA真核表达载体 ,用脂质体法转染MMP 9高表达的转移性人黑色素瘤细胞株WM 45 1,检测转染后细胞MMP 9表达水平的改变以及体外生长、侵袭、裸鼠体内成瘤及自发转移能力的变化。结果 :转染细胞MMP 9的表达及活性明显下降 ,同时MMP 2的表达也受到一定抑制 ,细胞生长速度、体外侵袭能力及裸鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制。结论 :通过反义RNA技术下调MMP 9的表达 ,可使人黑色素细胞转移能力受到一定程度的抑制 ,说明MMP 9在人黑色素瘤细胞转移过程中起重要作用     

黄荆子乙酸乙酯提取物抑制人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生长

目的:观察黄荆子乙酸乙酯提取物(EVn-50)对人乳腺癌(MCF-7)裸鼠移植瘤生长的影响。方法:MTT法检测6种黄荆子提取物对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响;获得目标抗肿瘤有效组分即EVn-50,人乳腺癌(MCF-7)裸鼠移植瘤模型治疗实验,评价EVn-50治疗人乳腺癌的有效性。结果:不同提取方式获得的6种黄荆子提取物对人乳腺癌(MCF-7)细胞的增殖活性具有不同程度的抑制作用,以EVn-50作用最强,其IC50值为0.89μg/mL。EVn-50对人乳腺癌(MCF-7)裸鼠移植瘤生长具有抑制作用,呈剂量依赖性。结论:EVn-50具有抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖和人乳腺癌(MCF-7)裸鼠移植瘤生长作用。