人源抗-HBs Fab优化表达条件的初步探讨

目的：利用含重组质粒pBAD/HBs Fab的Top10大肠杆菌，优化表达人源抗－HBs Fab。方法：选取含pBAD/HBs Fab载体的Top10大肠杆菌单个克隆分级培养，将制备的二级种子液接种于摇瓶和KLF2000发酵罐中，摇瓶培养表达采用不同的菌体诱导起始密度、诱导剂浓度、诱导表达温度和诱导表达时间。发酵罐培养表达采用不同的培养基和菌体诱导起始密度。诱导表达完毕后，纯化蛋白，比较表达量，并鉴定所获蛋白的抗原性和生物学活性。结果：用摇瓶优化表达后，Fab蛋白占菌体总蛋白的6％，为0.8%mg/g菌体，利用发酵培养可进一步增加菌量，使蛋白表达量达80mg/L。所获蛋白经鉴定显示有较好的生物学活性。结论：用重组质粒pBAD/HBsFab,Top10表达系统，可得到80mg/L的具有较好生物学活性的人源抗－HBs Fab蛋白，为批量生产作了准备。     

基因工程技术制备人源抗HBsAg抗体Fab片段

将从抗体文库中筛选出的抗HBsAg Fab阳性克隆转化大肠肝杆菌 ,IPTG诱导表达 ,经Western blot鉴定 ,证实上清中含有可溶性抗HBsAg Fab片段 ,应用自制的羊抗人免疫球蛋白片段抗体 (anti Fab )与Gama bind交联制备的亲和层析柱纯化表达产物 ,所得纯化产物在SDS PAGE中形成单一条带 ,经Western blot证实具备良好抗原特异性 ,Dot blot证实具备良好抗原结合活性。     

工程化人源性抗-HBs Fab抗体的制备、纯化和鉴定

用获得的表达人源性抗 ＨＢｓＦａｂ片段的大肠杆菌,发酵表达该抗体的可溶Ｆａｂ片段。以羊抗人Ｆａｂ抗体偶联ＨｉＴｒａｐ柱,用Ａｃｔｉｓｅｐｅｌｕｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ作为洗脱液,在ＦＰＬＣ上纯化。用ＳＤＳ ＰＡＧＥ及蛋白印迹法分析、鉴定,用固相放兔法检测其活性单位。蛋白印迹及ＥＬＩＳＡ显示转化菌株有抗 ＨＢｓＦａｂ片段的表达。经ＦＰＬＣ纯化的抗体Ｆａｂ片段呈单一峰,与抗 ＨＢｓ阳性血清相似。纯化后的抗体Ｆａｂ片段达到电泳纯,具有较高的活性。     

人源化抗 Siglec-9 抗体 Fab 片段的制备及鉴定

目的:构建人源化抗Siglec-9 抗体Fab 段原核表达质粒,表达、纯化此抗体以及特性分析,并初步探讨此抗体 的生物学功能。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)分别获得抗体轻链和重链的可变区及恒定区,经重叠延伸PCR 连接,酶切 后与原核表达载体pETDUET-1 重组,转入表达感受态Escherichia coli BL21 中,通过蛋白纯化系统AKTA 和His-trap Lambda Fab 纯化。使用SDS-PAGE、ELISA 以及Western blot 鉴定和分析。采用实时荧光定量PCR 初步检测抗Siglec-9 抗体Fab 段对 炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 的mRNA 表达量的影响。结果:成功获得抗体轻链和重链,构建人源化抗Siglec-9 抗体 Fab 段原核表达系统,经SDS-PAGE、Western blot、ELISA 检测证实抗Siglec-9 抗体Fab 段与Siglec-9 抗原特异性结合。抗 Siglec-9 抗体Fab 段可抑制炎性细胞因子TNF鄄琢、IL-1、IL-6、IL-8 的mRNA 表达量。结论:人源化抗Siglec-9 抗体Fab 段进行了 原核系统表达、纯化和鉴定,并初步验证可抑制炎性细胞因子的mRNA 表达量,为进一步研究该抗体的生物学特性及应用奠 定基础。     

亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体

目的：纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体，建立稳定、适于生产应用的纯化工艺。方法：以原核表达的重组人源性抗HBs scFv免疫BALB／c小鼠，经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株14F7。将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水，经辛酸沉淀纯化后，制备亲和层析柱。纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体。结果：用抗scFv mAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAg Fab的纯度可达95％以上，回收率可达70％～85％。结论：人源性抗HBs scFv制备mAb作为亲和层析的介质，可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAg Fab，适用于大规模生产重组人源性抗HBsAg Fab。     

人源性抗HBsAg单克隆抗体Fab片段的表达与纯化

对已筛选到的人源性抗ＨＢｓＡｇ特异性噬菌体抗体基因文库进行表达研究，将特异性噬粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，反复冻溶法制备可溶性Ｆａｂ片段。免疫印迹实验表明大肠杆菌质周腔内有可溶性Ｆａｂ片段的表达。制备羊抗人ＩｇＧ Ｆａｂ抗血清，建立抗人ＩｇＧ Ｆａｂ抗体－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和层析柱，纯化Ｆａｂ片段。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示纯化的Ｆａｂ达免疫纯，点印迹法表达纯化后的Ｆａｂ片段具有中和ＨＢｓＡ     

抗人层粘连蛋白Fab‘的制备

用ＤＥＡＥ纤维素ＤＥ－５２反相吸附纯化抗人层粘连蛋白（ＬＮ）ＩｇＧ，ＩｇＧ回收率达１１．６ｍｇ／ｍｌ血清。胃蛋白酶消化ＩｇＧ成Ｆ（ａｂ＇）２，再用１０ｍｍｏｌ／Ｌ２－巯基乙醇３７℃反应９０ｍｉｎ还原成Ｆａｂ＇，回收率约８１％，放免效价为１：３５００。测得纯化的ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ＇）２及Ｆａｂ＇分子量分别为１５００００、９００００、４５０００，与理论植相近。放免检测中用Ｆａｂ＇取代抗血清可纠正对血清Ｌ     

人源抗NH-LBP Fab抗体的制备和初步鉴定

目的：构建人源抗脂多糖结合蛋白氨基端片段（NH-LBP）Fab抗体的原核表达载体, 并制备高稳定性Fab抗体.方法：用PCR方法, 从可溶性表达抗NH-LBP抗体的重组质粒pComb3H-Fab中扩增出VH链和VL链基因序列, 分别构建表达质粒pET-28a（＋）-VH和pET-28a（＋）-VL, 并于工程菌BL21（DE3）star中分别表达及TALON柱芯亲和纯化, 将抗体片段VH和VL共同复性, 通过二硫键形成Fab抗体, 再采用ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力.结果：扩增出VL链和VH基因片段长约为650 bp和700 bp, 经BL21star表达出相对分子质量（Mr）约为28　000和30　000的目的蛋白, 共同折叠后所获得Fab抗体与NH-LBP具有较高的结合力.结论：成功地制备抗NH-LBP Fab抗体, 为临床抗炎研究提供了条件.     

小鼠单克隆IgM抗体Fabμ片段的制备及其初步应用

在37℃和4℃下用胰蛋白酶消化小鼠单克隆IgM 4h和24h。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实,37℃下制备的小片段分子量(Mr)近50000(Fab),但免疫活性较低;4℃下制备的小片段Mr为80000～110000(Fabμ),免疫活性与原IgM基本一致。选用在4℃下经胰酶消化IgM 24h制备的Fabμ与辣根过氧化物酶连接,其结合物用于双抗体夹心酶联免疫吸附试验,取得了满意的结果。     

抗人层粘连蛋白Fab＇的制备

用ＤＥＡＥ纤维素ＤＥ－５２反相吸附纯化抗人层粘连蛋白（ＬＮ）ＩｇＧ，ＩｇＧ回收率达１１．６ｍｇ／ｍｌ血清。胃蛋白酶消化ＩｇＧ成Ｆ（ａｂ＇）２，再用１０ｍｍｏｌ／Ｌ２－巯基乙醇３７℃反应９０ｍｉｎ还原成Ｆａｂ＇，回收率约８１％，放免效价为１：３５００．测得纯化的ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ＇）２及Ｆａｂ＇分子量分别为１５００００、９００００、４５０００，与理论值相近。放免检测中用Ｆａｂ＇取代抗血清可纠正对血清ＬＮ测定的误差，从而建立检测ＬＮ的准确、灵敏方法。     

金属螯合亲和层析法对抗HBs Fab段的纯化

为了对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行简便有效的纯化，在Ｆａｂ段表达载体上插入了一段编码６个组氨酸的ＤＮＡ片段，使所表达的Ｆａｂ段在Ｆｄ段的羧基端带有６个连续的组氨酸，通过锌离子金属螯合亲和层析法对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行纯化，利用不同ｐＨ梯度缓冲液洗脱，一步即可达到９５％以上纯度的纯化，为基因工程抗体的制备开发提供了有效手段。     

Isolation of Fab and Fc fragments from mouse immunoglobulin Gl

Two methods of obtaining Fab and Fc fragments from mouse immunoglobulin Gl are described. In the first case the papain protein digest is fractionated on a column with DEAE-or DE-32-cellulose, equilibrated with 0.005 M potassium phosphate buffer, pH 8.0. The Fab fragment is eluted from the column in the starting buffer; the fragment is eluted when the ionic strength of the buffer is increased to 0.4 M. In the second case the protein is fractionated on an ion-exchange resin equilibrated with 0.004 M Tris-H₃PO₄ buffer, pH 8.5. The whole of the protein applied under these circumstances is bound by the column. The Fab fragment is eluted with 0.04 M Tris buffer containing 0.004 M of a mixture of K-phosphate salts at pH 8.5; the Fc fragment is eluted by increasing the ionic strength by means of phosphate to 0.4 M. Since neither method can yield absolutely pure Fab or Fc fragments, in order to obtain monospecific antisera against these fragments it is necessary to cross-exhaust the antisera with appropriate immunosorbents.Laboratory of Antibody Chemistry and Biosynthesis, N. F. Gamaleya Institute of Epidemiology and Microbiology, Academy of Medical Sciences of the USSR, Moscow. (Presented by Academician of the Academy of Sciences of the USSR P. A. Vershilov.) Translated from Byulleten' Éksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 88, No. 7, pp. 116–119, July, 1979.     

纤维蛋白单抗SZ—58嵌合Fab片段在大肠杆菌中的表达

为减少鼠源单抗的免疫原性，降低其分子量，应用基因重组技术将纤维蛋白单抗ＳＺ－５８可变区基因与人ＩｇＧ１恒定区基因Ｃ_Ｈ１、Ｃｋ进行拼接、扩增。将扩增后的ＳＺ－５８嵌合Ｆａｂ基因克隆至噬菌体质粒，并导入大肠杆菌中进行表达。表达的嵌合Ｆａｂ片段为可溶性。放免检测其在表达上清中的含量约为２００μｇ／Ｌ，免疫印迹电泳证实ＳＺ－５８嵌合Ｆａｂ片段能特异地与纤维蛋白Ｄ－Ｄｉｍｅｒ结合。     

抗甲型肝炎病毒抗体Fab在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中高效表达人源抗HAV抗体Fab，为进一步研究该抗体的功能奠定基础。方法 依次将抗HAV抗体的Fd及轻链基因克隆到表达载体pASK84的不同信号序列下，构建成Fab表达质粒，在大肠杆菌JM83中进行表达，并对表达产物进行复性。用SDS－PAGE、western blot和ELISA法检测Fab的表达及其与甲肝病毒抗原的结合活性。结果 构建了抗HAV Fab的重组表达质粒p84Fab，在大肠杆菌JM83中获得表达，表达的Fab占全菌的25％，主要以包涵体形式存在，复性后具有抗原结合活性；培养基、菌体可溶性蛋白部分也能检测到有抗原结合活性的Fab。结论 抗HAV抗体Fab在大肠杆菌中得到了表达，并具有良好的抗原结合活性。     

人源抗HBs基因工程抗体在E. coli中的高效表达与折叠研究

目的 高效表达是基因工程抗体走向临床的关键问题之一.本试验旨在研究人源抗HBs基因工程抗体在E. coli中的高效表达与折叠.方法 本实验将抗HBsAg抗体的轻链(L)和重链Fd段基因,分别克隆于pET20b质粒中并分别转化到大肠肝菌BL21(DE3),IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在Mr27 000(L)和Mr25 000(Fd)处有外源蛋白表达,表达蛋白含量分别为53%和48%.L链和Fd 包涵体蛋白经盐酸胍变性后,等量混合于折叠液中.结果 L和Fd可复性形成了Mr约50 000的蛋白,ELISA结果表明,复性蛋白具有与HBsAg结合的能力.结论 抗HBsAg抗体Fab段在大肠杆菌中的表达与复性的成功,表明包涵体表达基因工程抗体在技术是可行的.     

人-鼠嵌合抗血小板单抗SZ-2 Fab片段基因的构建和表达研究

目的：降低鼠源性抗血小板单克隆抗体SZ-2的免疫原性。为其进一步研究，应用奠定基础。方法：用Trizol试剂从SZ-2杂交瘤细胞抽提RNA，应用RT-PCR技术，扩增出SZ-2重链，轻链可变区基因，克隆入载体pUCm-T，测序分析，应用基因重组技术，将SZ-2轻，重链可变区基因与人免疫球蛋白γ1重链CH1和к轻链恒区基因进行拼接，构建人-鼠嵌合Fab片段基因表达质粒pSW1-2Fab/Hu，并导入大肠杆菌XL1-blue诱导表达，以ELISA，Western blot和瑞斯托霉素诱导血小板聚集抑制试验。对表达产物进行检测，验证。结果：克隆的基因序列符合小鼠轻，重链可变区基因的特征；表达质粒pSW1-2Fab/Hu拼接正确；在大肠杆菌中的表达量约为180μg/L；表达产物具有与血小板GPIb结合的特性并可抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集。结论：成功地克隆了SZ-2可变区基因；并表达了可溶性人-鼠嵌合Fab基因工程抗体。