siRNA介导的间皮素基因沉默对卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生长的影响

目的:研究间皮素(mesothelin, MSLN)基因被沉默后的卵巢癌细胞SKOV3-MSLN-shRNA增殖能力的变化,以及MSLN基因沉默对裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤生长的影响.方法:利用针对MSLN基因的siRNA慢病毒液和对照组慢病毒液分别感染SKOV3细胞,建立SKOV3-MSLN-shRNA细胞和SKOV3-MSLN-neg细胞的稳定转染株;以SKOV3细胞作空白对照,用平板克隆形成法和细胞计数法检测3组细胞的增殖能力.应用3组细胞分别建立裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型,2周后处死裸鼠,观察每组动物的成瘤率及每只裸鼠的肿瘤质量、肿瘤数目和肿瘤种植部位等.结果:SKOV3-MSLN-shRNA细胞的体外增殖能力明显低于SKOV3-MSLN-neg细胞和SKOV3细胞,差异有统计学意义(P<0.05).SKOV3-MSLN-shRNA组裸鼠成瘤率为60%,而2个对照组SKOV3-MSLN-neg和SKOV3细胞的裸鼠成瘤率均为100%,差异无统计学意义(P＞0.05).SKOV3-MSLN-shRNA组动物的肿瘤数目、肿瘤质量及肿瘤种植部位明显低于2个对照组 (P<0.05).结论:MSLN基因沉默可以降低卵巢癌SKOV3细胞的体外增殖能力,同时可以抑制卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的生长和种植.     

慢病毒介导的RNAi对卵巢癌细胞增殖及间皮素表达的影响

目的: 构建间皮素（mesothelin，MSLN）RNAi重组慢病毒质粒，探讨其对卵巢癌OVCAR3细胞 MSLN的表达及细胞增殖的影响。方法：根据MSLN基因信息,设计了4个小干扰序列和1个阴性对照序列，利用慢病毒质粒载体pRNATU62/Lenti构建了5个重组质粒并进行了慢病毒包装，分别为LVMSLNnegative、LVMSLNshRNA2、LVMSLNshRNA3、LVMSLNshRNA4；感染OVCAR3细胞后，Western blotting和荧光免疫组化检测干扰效率，选择干扰效率高的质粒载体进行慢病毒大量包装；感染卵巢癌细胞OVCAR3后，用细胞增殖实验和平板克隆形成实验检测细胞增殖的变化。结果：测序结果证明5种质粒载体的插入序列完全正确，鉴定证明慢病毒包装成功。慢病毒感染OVCAR3细胞后，Western blotting证实重组慢病毒LVMSLNshRNA4的干扰效率最高,对MSLN蛋白表达的抑制达90%。荧光免疫组化的共聚焦照片显示干扰组（OVCshRNA）定位于细胞膜的MSLN蛋白表达明显弱于阴性对照组（OVCneg）和空白对照组（OVC）。OVCshRNA组细胞增殖\[（11.2±1.3）×105\]显著慢于OVCneg组\[（20.5±2.5）×105\]和OVC组\[（21.9±2.3）×105\] (P＜0.05）。OVCshRNA组克隆形成率为(15.2±2.1)%，明显低于OVCneg组\[（27.9±2.5）%\]和OVC组\[（28.8±3.1）%\]（P＜0.05）。结论：成功构建MSLN RNAi重组慢病毒质粒LVMSLNshRNA4，它能有效抑制卵巢癌OVCAR3细胞的MSLN表达及细胞增殖，为进一步研究MSLN应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

慢病毒介导的USP9X基因RNA干扰对人胰腺癌细胞株裸鼠移植瘤生长的影响

目的研究慢病毒介导的连锁的泛素特异肽酶9(USP9X)基因RNA干扰对人胰腺癌细胞系裸鼠皮下移植瘤的影响。方法将靶向USP9X基因的干扰小RNA(siRNA)慢病毒(LV-siRNA-USP9X)和阴性对照慢病毒(LV-siRNA-NC)转染至SW1990细胞,并分别作为siUSP9X组和siNC组,未转染细胞作为对照组,分别将3组细胞系接种至裸鼠皮下,比较3组裸鼠接种第30天的移植瘤生长情况和瘤体重量。蛋白质印记(Western blot)法和免疫组织化染色检测3组裸鼠皮下移植瘤中survivin蛋白的表达情况,TUNEL法检测细胞凋亡指数(AI)。结果siUSP9X组USP9X蛋白的相对表达量均明显低于siNC组和对照组,差异均有统计学意义(P<0.01),干扰效率约为90%。siUSP9X组裸鼠的肿瘤体积明显小于siNC组和对照组裸鼠,且随着接种时间的延长,差异越来越明显。在接种第30天时,siUSP9X组裸鼠瘤体重量均小于siNC组和对照组裸鼠,抑瘤率为52%。siUSP9X组survivin蛋白的相对表达量和阳性表达率均低于siNC组和对照组,AI均高于siNC组和对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的USP9X基因沉默可明显抑制人胰腺癌细胞系裸鼠皮下移植瘤的生长,该现象可能与其下调survivin蛋白的表达并促进细胞凋亡有关,USP9X有可能成为胰腺癌基因治疗的一个新靶点。     

间皮素mRNA及蛋白在卵巢癌中的表达及分析

目的 研究间皮素(MESO)在卵巢癌中的表达及意义.方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和免疫组化方法分别检测卵巢肿瘤和正常卵巢组织中MESO mRNA及其蛋白水平.结果MESO mRNA和蛋白在上皮性卵巢癌(1.4005 ±0.4646,2.7857±2.2712)和交界性卵巢肿瘤(1.0650 ±0.3100,2.9167 ±2.391)中的表达水平高于良性卵巢肿瘤(0.6463±0.2419,1.2500 ±1.6125)和正常卵巢组织(0.6439 ±0.2729,0.9167 ±1.2401),差异有统计学意义(P＜0.05);MESOmRNA和蛋白在浆液性卵巢癌(1.5255 ±0.4151,3.3036 ±2.6141)和子宫内膜样癌(1.5250 ±0.5419,3.0000 ±2.3094)中的表达水平高于黏液样癌(1.0675±0.3149,1.0556 ±1.9242),差异有统计学意义(P＜0.05);临床Ⅲ、Ⅳ期MESO表达水平(1.5100 ±0.4142,3.6087 ±3.3959)高于Ⅰ、Ⅱ期(1.1190 ±0.4909,1.7895 ±2.6320),差异有统计学意义(P＜0.05).MESO表达水平与病理分级有关(P＜0.05),而与患者年龄和血清CA125水平无关(P＞0.05).结论 MESO mRNA及蛋白在卵巢癌和交界性肿瘤组表达增高,MESO可能参与卵巢癌的黏附转移.     

CXCR4基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人CXCR4基因RNAi(RNA interference,RNAi)慢病毒载体.方法:针对筛选确定的人CXCR4 基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA 慢病毒载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的含CXCR4 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确.结论:成功构建人CXCR4基因RNAi慢病毒载体.     

慢病毒载体系统的发展及在肿瘤基因治疗中的应用

慢病毒载体(lentivirus vector,LV)是作为目前研究最多的外源性转基因载体之一,在基因转染方面有着许多独特的优势,例如,对细胞是否处于有丝分裂期没有特别的要求,基因转染效率高,可容纳较大基因片段等.本文就慢病毒载体系统的概述、肿瘤的基因治疗、转基因动物模型构建等方面进行综述.     

慢病毒介导的RNAi沉默TLR4基因对人乙肝病毒相关肝细胞癌裸鼠移植瘤生长的影响北大核心CSCD

目的探讨TLR4基因RNA干扰(RNAi)的重组慢病毒载体对人乙肝病毒相关肝细胞癌裸鼠移植瘤TLR4基因表达和移植瘤生长的影响。方法构建4个miR-TLR4质粒和一个阴性对照质粒,选择干扰效果最明显的质粒进行慢病毒包装。建立人乙肝病毒相关肝细胞癌裸鼠移植瘤模型,随机分成实验组、阴性对照组和空白对照组。隔天1次向各组动物肿瘤内分别注射TLR4 miRNA慢病毒颗粒、携带无关序列的慢病毒颗粒或0.2 ml 0.9%氯化钠溶液,共5次,测量各组肿瘤体积的大小,绘制肿瘤生长曲线;11天后处死裸鼠,应用半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测移植瘤中TLR4基因的表达。结果与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的移植瘤生长速度明显减慢(P<0.05),并且实验组移植瘤细胞TLR4 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论 TLR4 miRNA慢病毒载体瘤内注射可抑制人乙肝病毒相关肝细胞癌裸鼠移植瘤的生长。     

慢病毒载体及其研究进展

慢病毒载体（lentivirus vector, LV）是目前分子及细胞生物实验中非常有效的工具,在基因转染方面有着许多独特的优势,例如,对细胞是否处于有丝分裂期没有特别的要求,基因转染效率高,可容纳较大基因片段等。本文将就慢病毒载体的来源、分子特征及研究进展等进行综述。     

慢病毒导入的PLCγ1 siRNA对人大肠癌细胞增殖和黏附的影响

目的:制备在人大肠癌细胞系LoVo中稳定抑制PLCγ1(phospholiase C-gamma 1)的重组病毒,建立PLCγ1表达降低的细胞系,以便客观研究该基因的作用。方法:制备产生PLγ1 siRNA分子的重组慢病毒,在慢病毒感染LoVo细胞后以杀稻瘟菌素筛选稳定表达细胞系。应用Western-blot和RT-PCR对细胞中PLCγ1的蛋白和mRNA表达水平进行分析,XTT法和黏附能力测定分别检测其对细胞增殖和黏附的影响。结果:PLCγ1 siRNA显著下调了LoVo细胞中PLCγ1的表达,所构建的重组慢病毒导入的siRNA有较高的沉默效率,LoVo细胞的黏附能力显著降低,细胞增殖无明显改变。结论:研究证实了 PLCγ1基因可显著地影响大肠癌LoVo细胞的黏附能力,为利用PLCγ1介导的信号通路进行肿瘤基因治疗提供了实验依据。     

携带沉默IGFIR shRNA和表达Wtp53的重组慢病毒的构建和鉴定

胰岛素样生长因子Ⅰ类受体（insulin．1ikegrowthfactorIreceptor，IGFIR）的胞内信号转导涉及众多信号通路，与多种肿瘤的发生、发展关系密切。p53基因与IGFIR家族关系密切，能够抑制IGFIR启动子活性及mRNA水平。本研究构建IGFIR基因shRNA和同时表达Wtp53慢病毒载体（pPRIME-WtP53-shlGFIR），感染肝癌HEP3B细胞，观察能否下调IGFIR和上调P53蛋白水平，为研究肝癌的基因治疗奠定基础。     

慢病毒载体介导端粒酶逆转录酶小干扰RNA治疗肝癌的实验研究

目的 探讨慢病毒介导的端粒酶逆转录酶(hTERT)小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞生长的影响.方法 构建携带hTERT siRNA的慢病毒表达载体,在体外转染人肝癌HepG2细胞系,以MTT法测定细胞生长变化,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA的表达.将转染hTERT siRNA的HepG2细胞,接种于裸鼠腋窝皮下,观察移植瘤生长情况.取移植瘤组织,常规HE染色,行组织学观察,应用原位末端标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡情况.结果 hTERT siRNA转染HepG2细胞后,随着时间的延长,对细胞增殖的抑制作用逐渐增强,到第8天,干扰组细胞抑制率为57.5%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).RT-PCR产物凝胶电泳图显示,hTERT siRNA转染后,肿瘤细胞的端粒酶活性明显下降.转染后72 h,干扰组hTERT mRNA的表达水平为0.035±0.007,明显低于空载体对照组(0.151±0.016)和空白对照组(0.155±0.014,均P<0.01).转染细胞皮下接种后,干扰组的肿瘤生长速度明显慢于两个对照组,随着时间的延长,差异越来越明显.移植瘤组织常规HE染色显示,组织坏死增多,周围炎性细胞浸润.TUNEL检测结果显示,细胞凋亡增多,增殖减慢.结论 慢病毒介导的hTERT siRNA转染能明显抑制肝癌细胞的生长.     

慢病毒携带的双自杀基因对淋巴瘤细胞杀伤作用的实验研究

背景与目的:慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫原性低等优点,适于体内基因治疗。本研究探讨慢病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞Raji的杀伤作用。方法:将表达慢病毒的3种质粒,即包装结构基因质粒pCMVΔ8.2、包膜基因质粒pCMV.VSVG、目的基因质粒pHR'CS.GFP或pHR'CS.CDglytk分两组(pHR'CS.Cdglytk为实验组、pHR'CS.GFP为对照组),经脂质体导入病毒包装细胞293T,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩后转染Raji细胞,用荧光显微镜及RT-PCR检测基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV),用MTT法测定Raji细胞的生长抑制率,检测CD和HSV-tk双自杀基因对Raji细胞的作用。结果:表达慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞。荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光,透射电镜下观察可见富集的病毒颗粒。慢病毒介导的双自杀基因在Raji细胞中高效、稳定表达。单独使用GCV或5-FC对细胞的生长抑制率分别为51%、50%,与未转染组Raji细胞比较,差异有显著性(P<0.01);联合使用5-FC和GCV对细胞的生长抑制率为73%,明显高于单独使用5-FC或GCV(P<0.01)。结论:慢病毒介导的双自杀基因可高效稳定转染淋巴瘤细胞;双自杀基因系统较单一自杀基因系统(CD/5-FC或HSVtk/GCV)对淋巴瘤细     

腺病毒介导Her2／neu siRNA对卵巢癌细胞的生长抑制作用

目的观察腺病毒介导的针对Her2／neu基因RNAi表达载体对Her2／neu的抑制及抑制后对卵巢癌SKOV-3细胞的生长的影响。方法通过构建的针对Her2neu的siRNA重组腺病毒（滴度为1．6×10^8PFU／mL）感染卵巢癌细胞SKOV-3后，采用Western—blot法观察Her2／neu基因的沉默效果，流式细胞仪分析细胞周期变化，cell Proliferation法检查细胞体外增殖能力。结果构建的重组腺病毒Adeno—Her2siRNA感染卵巢癌细胞SKOV-3后Her2／neu的蛋白表达降低；S期细胞较对照组未感染细胞比例增加；肿瘤细胞胞增殖速度缓慢（P〈0．05）。结论成功构建的重组腺病毒Adeno-Her2siRNA感染后可有效降低Her2／neu蛋白水平表达，阻滞细胞感染于S期，造成感染细胞生长速度减慢，有望为卵巢癌的基因治疗提供一种选择手段。     

双自杀基因CD和TK对K562细胞体内外杀伤作用的实验研究

目的:探讨双自杀基因CD和TK对K562细胞的体内外抑制作用及前体药物对肿瘤的杀伤作用。方法:将目的基因转染入K562细胞,MTT法观察细胞在体内外的增殖状况及5-FC/GCV对转染细胞的杀伤作用,电子显微镜观察其超微结构变化。将K562/CDgly TK和K562细胞接种于裸鼠皮下,观察各种肿瘤细胞在体内的成瘤情况及对前体药物治疗的敏感性。结果:单独使用GCV或5-FC对K562及K562/CDgly TK细胞产生明显的杀伤作用,联合应用该2种药物对肿瘤细胞的杀伤作用更强。将K562细胞和K562/CDgly TK细胞接种于小鼠皮下后小鼠成瘤率为100%,GCV或5-FC可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成,联合应用GCV和5-FC治疗K562/CDglyTK细胞在小鼠体内形成的肿瘤,较单独应用GCV和5-FC及对照组小鼠形成的肿瘤体积明显缩小,生存期也明显延长。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有明显的抑制作用,可增加前体药物GCV和5-FC对瘤细胞的杀伤率。     

血清间皮素在卵巢上皮性癌诊断中的价值

 肿瘤标志物是肿瘤早期诊断的重要辅助手段,其对于肿瘤的早期发现、病情监测以及治疗方案的疗效判断都有着重要意义。临床上对于卵巢癌早期诊断方法主要为血清糖类抗原125（CA125）的检测,但该早期诊断方法精确度、特异度不高。研究发现在进展期的卵巢癌患者中发现可溶性间皮素相关多肽（SMRP）和CA125两者具有共表达的现象。现就血清间皮素在上皮性卵巢癌诊断中的价值进行综述,旨在为临床中上皮性卵巢癌患者的早期诊断、早期治疗提供参考。     

沙利度胺联合放射治疗对结肠癌小鼠移植瘤生长及放射敏感性的影响

背景与目的：沙利度胺能有效增强肿瘤对放射的敏感性,但作用机制尚不清楚。本研究探讨沙利度胺对人结肠癌小鼠移植瘤放射敏感性的影响,并探讨其协同抑制效应的机制。方法：建立colon26结肠癌移植瘤模型,将32只小鼠随机分为对照组;单纯沙利度胺组(T组);单纯放疗组(R组);沙利度胺+放疗组(T+R组);从治疗当天开始,隔日测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,治疗结束时测量肿瘤体积,计算抑瘤率,处死小鼠后剥离瘤体,采用免疫组化法测定各组肿瘤组织微血管密度(microvesseldensity,MVD)。结果：治疗第22天,对照组、T组、R组和T+R组移植瘤平均体积分别为(4.97±1.20)cm3、(2.90±0.92)cm3、(2.66±0.88)cm3和(1.89±0.76)cm3;肿瘤生长抑制率分别为41.7%、46.5%和61.9%,T+R组移植肿瘤抑瘤率明显高于其他各组(P＜0.05);与R组比较,T+R组的放射增敏率为2.27;沙利度胺联合放射治疗能显著抑制肿瘤组织MVD生成：T+R组的平均MVD较对照组下降了46.8%,下降程度明显高于T组(40.7%)和R组(37.7%,P＜0.05);且T+R组肿瘤组织中出现较多的坏死,坏死细胞数明显高于对照组(P＜0.05)。结论：沙利度胺可以增强结肠癌小鼠移植瘤的放射敏感性,其机制可能与抑制移植瘤血管的生成有关。     

慢病毒转染造血干细胞介导的肿瘤基因治疗的研究进展

肿瘤基因治疗是继手术、放化疗等传统治疗方法之后出现的一种全新的肿瘤治疗方法,并在科研和临床方面取得可喜的进展。如何将肿瘤治疗基因安全高效的转移到人体内,使治疗基因在人体内长期、稳定、高效的表达是当前基因治疗实践中所遇到的重大困难。造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSCs)因具有自我更新和定向分化能力,治疗基因转染到造血干细胞内可长期、持续、有效的杀伤肿瘤达到治疗目的。这使的造血干细胞成为基因治疗研究中最令人兴奋的靶细胞。慢病毒载体(lentivirusvector,LV)能感染大部分处于静止期的造血干细胞,因此成为一种有效的感染HSCs和进行基因治疗的工具。本文就慢病毒携带肿瘤治疗基因转染HSCs治疗肿瘤方面做一综述。