脂肪间质干细胞抑制肝星状细胞增殖活化及肝脏纤维化

目的 探讨脂肪间质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)对活化态肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)增殖、活化的影响及其对活体肝硬化模型的治疗作用.方法 分别分离纯化培养HSCs及ADSCs,通过半透膜(transwell insert)建立HSCs与ADSCs的双层培养体系,大鼠正常肝细胞系((buffalo rat liver cells,BRLs)培养作为对照.通过CCK-8比色法检测ADSCs对HSCs增殖的影响;Western blot检测HSCs的α-肌动蛋白(α-SMA)表达;建立鼠肝硬化模型,经门静脉输注ADSCs或BRLs,检测肝组织肝硬化;通过检测培养液中细胞因子的含量探讨可能的作用机制.结果 成功分离获得原代HSCs与ADSCs,活化的HSCs与ADSCs共培养72 h,与对照组相比,ADSCs明显抑制HSCs的活化(各组灰度值分别为1.4±0.2,152±14,258±18,F=283.348,P＜0.05)与增殖(各组吸光度A值分别为2.172±0.107,1.424±0.013,1.209±0.117,F=90.605,P ＜0.05),活体移植显示ADSCs对肝硬化具有明显抑制作用(分别F=77.234、65.164、58.309,均P ＜0.05).培养液细胞因子检测显示ADSCs比BRLs分泌更多的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)(F=0.005,P＜0.05),分泌较少的转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β1)(F=1.767,P＜0.01)及神经生长因子(nerve growth factor,NGF)(F=2.301,P＜0.05). 结论 ADSCs具有分泌细胞因子抑制HSCs活化增殖的潜能,对活体肝硬化进程具有一定的抑制作用.     

PPARγ特异配体抑制肝星状细胞的活化

目的 研究不同浓度的过氧化物酶体增殖物活化的受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)特异配体罗格列酮对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)生物学特性的影响,以探究其在肝旱状细胞活化中的作用.方法 设立对照组,3μM罗格列酮组,10μM罗格列酮组,20μM岁格列酮组.用MTT法检测细胞的增殖情况;采用RT-PCR方法检测其中PPARγ、TGF-β1及Ⅰ型前胶原mRNA表达;用Western blot法检测PPARy、Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达;用免疫细胞化学方法测定α-SMA表达的变化;ELISA法检测细胞培养上清中的Ⅰ型胶原表达的变化.结果 (1)RT-PCR:20μM罗格列嗣组或10μM罗格列酮组与3 μM罗格列酮组或对照组相比,PPARY mRNA表达显著增高(P＜0.01),Ⅰ型前胶原mRNA表达显著降低(P＜0.01);20 α-SMA罗格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之间,3 α-SMA罗格列酮组与对照组之间,PPARγ和Ⅰ型前胶原mRNA的表达差异无显著件(P＞0.05).而各组之间的TGF-β1 mRNA的差异无显著性意义(P＞0.05).(2)Western blot:PPARγ及TGF-β1蛋白表达所得结果与RT-PCR结果相一致.Ⅰ型胶原表达与RT-PCR Ⅰ型前胶原mRNA表达结果相一致.各组之间的Ⅲ型胶原表达差异无显著性意义(P＞0.05).(3)免疫细胞化学:20α-SMA罗格列酮组或10 α-SMA罗格列酮组与3 α-SMA罗格列酮组或对照组相比,α-SMA表达明显降低(P＜0.05).20 α-SMA岁格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之问,3 α-SMA罗格列酮组与对照组之间,差异无显著性(P＞0.05).(4)ELISA:20 α-SMA罗格列酮组或10 α-SMA罗格列酮组与3α-SMA罗格列倒组或对照组相比,细胞的培养上清中Ⅰ型胶原表达明显降低(P＜0.01).20 α-SMA罗格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之问,3 α-SMA罗格列酬组与对照组之间,差异无显著性(P＞0.05).结论 PPAR?配体罗格列酬能够在促进PPAR?的合成表达的同时,抑制细胞的增殖及胶原合成,抑制α-SMA的表达,减少细胞分泌Ⅰ型胶原,对肝星状细胞的活化有明显的抑制作用.     

血小板活化因子及受体拮抗剂对肝星状细胞增殖的影响

目的 观察血小板活化因子(PAF)及受体拮抗剂对体外培养的肝星状细胞(HSC)增殖的影响.方法 采用LX-2肝星状细胞系作为活化的HSC的研究模型.采用噻唑蓝比色法检测HSC的增殖.流式细胞PI染色及BrdU掺入法检测HSC的细胞周期.结果 PAF(1×10~(-8)～1×10~(-3)mol/L)各浓度组OD_(492)显著高于对照组(P<0.05);PAF(1×10~(-6))加PAF受体拮抗剂(1×10~(-7)～1×10~(-4)mol/L)组OD_(492)明显少于PAF(1×10~(-6)mol/L)组(P<0.05).PAF组HSC的S%和Prl明显增高.结论 PAF能够剂量依赖性地促进HSC增殖,而PAF受体拮抗剂能够抑制其作用.     

特异性siRNA抑制肝星状细胞Smad2表达

目的构建Smad2特异性siRNA表达克隆,探讨其在肝星状细胞(HSCs)中是否能够有效地抑制Smad2的表达。方法利用生物软件进行Smad2mRNA二级结构模拟,选择合适的靶位点,使用pBSKU6载体表达Smad2特异性siRNA,在体外转染HSC鄄T6细胞株,应用RT鄄PCR和Western鄄blot技术检测Smad2mRNA和蛋白的表达情况。结果成功构建siRNA表达克隆,转染后Smad2在基因和蛋白的表达水平均受到了明显抑制。在构建成功的4个克隆中,CR4抑制mRNA表达最为显著,达90%以上;抑制蛋白表达率也达到80%左右。同时CR1和CR4能有效地下调HSC分泌Ⅲ型胶原。结论在体外实验中,载体表达的特异性siRNA可有效地抑制HSCs中Smad2的表达,并可对激活的HSCs分泌细胞外基质产生有益的影响。     

胆红素浓度对肝星状细胞活化增殖和凋亡的影响

目的 探讨低浓度胆红素( bilirubin)对活化态肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)增殖、活化、凋亡的影响.方法 从肝脏分离纯化培养HSCs,DCFH-DA法检测不同浓度胆红素对HSCs中活性氧的影响.通过CCK-8比色法检测胆红素对HSCs增殖的影响.Western blot检测HSCsα-肌动蛋白(d-SMA)的表达.流式细胞仪检测胆红素对HSCs凋亡的影响.PCR检测胆红素对HSCs纤维化相关基因表达的影响.结果 分离并培养HSCs,低浓度胆红素浓度(0、1、10、20 mg/L)抑制HSCs中活性氧的产生,明显抑制HSCs的增殖(0.624±0.092,0.536±0.127,0.407±0.033,0.399±0.022,F=13.454,P＜0.05)及α-SMA的表达(339 ±2,336±10,246±7,242±5,3.7±0.3,F=191.107,P＜0.05),促进HSCs的凋亡(2.69±0.07％,2.95±0.10％,4.41±0.22％,4.91±0.86％,F=34.731,P＜0.05),改变HSCs纤维化相关基因的表达,TIMP-1 mRNA/MMP-2 mRNA的比值呈降低趋势(54±2,65±2,47 ±2,44±2,F=73.400,P＜0.05).结论 低浓度胆红素具有抑制HSCs活化增殖,促进凋亡的潜能.胆红素的作用可能与其抗氧化功能有关.     

Rho/ROCK信号通路调控肝星状细胞活化的研究进展

肝纤维化是大多数慢性肝病进展为肝硬化的共同病理改变,是肝脏的一种损伤修复反应。目前与纤维化有关的慢性肝病严重影响着人类身体健康。肝损伤修复反应导致肝星状细胞（hepatic stellatecells,HSCs）活化,从而引起细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积,是形成肝纤维化的主要驱动因素。Rho三磷酸鸟苷酶（Rho GTPases）是一类调控真核细胞内信号转导通路的重要分子开关,通过激活下游Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiled coil forming protein kinase,ROCK）参与调控细胞的收缩、黏附迁移、生长分裂、脂质代谢、转录调控、凋亡等多种生物学行为与功能。Rho/ROCK信号通路与HSCs的各种反应密切相关,其激活可以促进HSCs活化。本文就Rho/ROCK信号通路对HSCs活化的影响作一综述,揭示该信号通路在HSCs活化中的重要作用,为抗纤维化的治疗提供一些新思路。     

白藜芦醇调节肝星状细胞活性的实验研究

目的 探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）对活化态肝星状细胞（HSCs）增殖、活化的影响及其机制。方法 从肝脏分离纯化培养HSCs,DCFH-DA法检测不同浓度Res对HSCs中活性氧的影响,CCK-8比色法检测Res对HSCs增殖的影响,Western blotting检测HSCsα-肌动蛋白（α-SMA）的表达,PCR检测Res对HSCs活性相关基因表达的影响。结果 Res抑制HSCs中活性氧的产生,明显抑制HSCs的活化与增殖（P＜0.05）,改变了HSCs活性相关基因（大鼠生肌调节因子MyoD、胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白I）的表达（P＜0.05）。结论 Res能够抑制HSCs的活化增殖,Res对HSCs的作用可能与抗氧化及抑制MyoD的表达有关。     

重组人肝再生增强因子可抑制大鼠肝星状细胞c-fos基因的表达

目的 观察重组人肝再生增强因子(hALR)对大鼠肝星状细胞c-fos基因表达的影响.方法 在培养的肝星状细胞株中加入高(200μg/L)、中(20μg/L)、低(2μg/L)3种浓度的hALR,于8、24、48、72 h四个时间点收集细胞,提取总RNA;用逆转录定量聚合酶链反应(PCR)方法测定c-fos的基因表达.结果 高、中、低浓度的hALR 3组肝星状细胞c-fos基因的表达水平在8、24、48、72 h四个时间点均明显低于对照组;低剂量组为对照组的50%～53%,中剂量组为对照组的38%～43%,高剂量组为对照组的26%～30%.结论 重组人肝再生增强因子对大鼠肝星状细胞c-fos基因的表达有明显抑制作用.     

Hedgehog信号通路对肝星状细胞激活和增殖的影响

目的 观察Hedgehog信号通路在肝星状细胞(HSC)中的表达情况及Hedgehog信号通路对HSC激活和增殖的调控作用.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测大鼠HSC细胞株rHSC-99中Hedgehog信号通路各成分的表达.构建含Ihh、Smo、Gli2的干扰片段的质粒,分别转染HSC,用SYBR Green荧光定量PCR的方法检测转染后Ihh、Smo、Gli2的表达,Western blot方法检测HSC中α-SMA表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测转染后HSC细胞培养上清中I型胶原含量的变化,用噻唑蓝(MTT)比色法检测转染后HSC的增殖情况.结果 Hedgehog信号通路中Ihh、Smo、Ptc、Gli2、Gli3在HSC中表达;荧光定量PCR结果显示转染含Ihh、Smo、Gli2的siRNA质粒后的HSC中相应基因Ihh、Smo、Gli2的mRNA表达明显下降(0.254±0.130、0.221±0.150、0.235 4±0.110比1,P<0.01);Western blot结果显示HSC中α-SMA表达明显下降(0.191±0.014、0.357±0.021、0.086±0.016比1.143±0.017,P<0.01);EHSA结果显示转染后的HSC中I型胶原分泌明显减少(22.9 4±2.0、16.4±1.4、17.6±1.8比40.7±4.3,P<0.01);MTT结果显示细胞增殖受到抑制(0.204±0.019、0.226±0.014、0.228±0.015比0.412±0.016,P<0.05).结论 HSC表达Hedgehog信号通路中的Ihh、Smo、Ptc、Gli2、Gli3,下调Hedgehog信号通路可以抑制HSC激活和增殖.     

肝星状细胞中蛋白激酶C活性改变对其表达血小板源生长因子及增殖的影响

目的观察蛋白激酶C（PKC）活性改变对肝星状细胞（HSC）表达血小板源生长因子（PDGF）的影响及对HSC增殖和激活的作用。方法将肝星状细胞系rHSC-99随机分为3组：对照组（A组）；PKC激动剂PMA0．5μmol／L组（B组）；PKC抑制剂Calphostin C100nmol／L组（C组）。加药后0、3、6、12、24h分别检测各组细胞PKC活性的变化；作用24h后，采用Westernblot方法检测各组细胞PDGF和胞外信号调节激酶（ERK）的表达；采用免疫荧光化学方法检测各组细胞α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）的表达；采用MTT法检测细胞的增殖情况。结果PMA作用后PKC的活性显著增强，而Calphostin C则抑制PKC的活性。PKC活性增强后，与对照组比较HSC的PDGF表达升高了1．4倍（P〈0．01），ERK表达升高了1．2倍（P〈0．05）；n—SMA的表达升高了1．3倍（P〈0．01），并促进HSC的增殖；PKC活性抑制后则能抑制以上的作用。结论PKC活性的改变能调控HSC中PDGF的表达，在HSC的增殖和激活中发挥调节作用。     

过氧化物酶增殖物激活受体γ对大鼠肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨过氧化物酶增殖物激活受体γ（PPARγ）对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖与凋亡的影响。方法 常规培养大鼠HSC，经系列浓度的PPARγ天然配体（15-d-PGJ2）或合成配体（GW7845）作用后，通过噻唑蓝（MTT）比色法及流式细胞仪观察细胞的增殖和凋亡状态，应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot探讨PPARy配体诱导凋亡的分子机制，透射电镜观察HSC形态学变化。结果15-d-PGJ2和GW7845可通过抑制细胞增殖同时诱导凋亡而抑制HSC生长，且呈剂量依赖效应（各实验组与对照组比较，P＜0．01）；PPARy活化可显著抑制HSC中bcl-2基因表达（同时在转录和转录后水平），且此抑制作用可被PPARγ特异性拮抗剂GW9662部分或完全逆转，说明此种抑制效应确由PPARγ所介导；电镜观察亦显示明显的细胞凋亡发生。结论PPARγ活化可显著抑制HSC增殖，并通过下调bcl-2基因表达而诱导凋亡，提示PPARγ可作为逆转肝纤维化治疗的新的有效靶点。     

活化的肝星状细胞促进调节性T细胞的表达

目的 越来越多的研究证实,活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)具有免疫抑制功能.本研究观察了HSCs对T细胞介导的适应性免疫应答的影响及其与调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的关系.方法 分离培养小鼠HSCs,运用混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR),体外观察活化的HSCs对T细胞增殖和Treg细胞的影响.结果 活化的HSCs能导致树突状细胞(dendritic cells,DCs)介导的适应性免疫应答中T细胞的低反应性:抑制T细胞的增殖,同时诱导Treg细胞的表达.结论 活化的HSCs能通过促进Treg细胞表达而诱导适应性免疫应答中T细胞的活化无能,促进免疫耐受.     

前列腺素E1抑制血吸虫病家兔肝脏星状细胞活化研究

目的　探讨血吸虫病家兔肝纤维化形成过程中 ,静脉应用前列腺素 (PG)E1对肝脏星状细胞 (HSCs)活化和胶原含量的影响。方法　血吸虫尾蚴皮肤敷贴法感染家兔 ,构建肝脏纤维化模型 ,其中 7只家兔在感染后 60d开始给予PGE1(2 .5 μg/kg .d-1)。至 12 0d透射电镜比较HSCs超微结构变化 ,免疫组织化学检测肝窦周围平滑肌肌动蛋白 (α SMA)表达 ,苦味酸天狼星红染色测定Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量。结果　血吸虫病家兔肝脏纤维化形成过程中HSCs活化增加 ,收缩特性相关的α SMA表达增强 ,胶原纤维含量增高。外源性PGE1可以抑制HSCs活化 ;显著降低肝窦周围α SMA表达 (P <0 .0 1) ;肝窦周围胶原纤维含量显著降低 ,模型组和干预组Ⅰ、Ⅲ型胶原显色面积与单个偏振光显微镜视野面积比例 (% )分别为 3 7.2 5± 9.71和 13 .3 8± 4.2 4(P <0 .0 1) ;9.66±3 .5 2和 6.2 3± 1.81(P <0 .0 5 )。结论　HSCs活化是血吸虫病家兔肝纤维化形成的重要环节。PGE1可以有效地抑制血吸虫家兔肝纤维化形成 ,这种作用至少部分地是通过抑制HSCs活化实现的。     

肝星状细胞对同种异体胰岛移植物的保护作用

目的 研究小鼠肝星状细胞对同种异体胰岛移植物的保护作用.方法 将糖尿病小鼠随机分为三组,分别为糖尿病组、单纯胰岛移植组及与肝星状细胞共同移植组.单纯移植组于肾被膜下移植入同种异体胰岛300个;共同移植组移植入肝星状细胞(3×105个)与同种异体胰岛(300个)混合物.分别于移植术后监测受体小鼠血糖值及正常血糖维持时间;血糖正常一周后移植组及糖尿病组小鼠分别采血检测血清中TGF-β,TNF-α,IL-1β,IFN-γ的含量,同时取出移植物进行免疫组织化学检测.结果 术后共同移植组受体正常血糖维持时间为(23.75±8.96)d,单纯胰岛移植组受体正常血糖维持时间为(11.9±6.92)d,差异有统计学意义(P<0.05);三组受体血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量差异无统计学意义(P>0.05),共同移植组受体血清中TGF-β含量为(2292.31±5.87)pg/ml,单纯移植组为(1246.55±38.91)pg/ml,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);病理学结果显示共同移植组胰岛素表达量大,并且在移植物周围有生物包膜形成.结论 在同种异体移植模型中,肝星状细胞可能通过高分泌TGF-β、局部形成包囊等方式保护胰岛移植物并延长其存活时间.     

活化的肝星状细胞在肿瘤微环境中的免疫调节作用

目的 研究活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)在小鼠肝细胞癌发生发展中的免疫调节作用及肿瘤微环境的免疫功能变化.方法 于体外,用Brdu细胞增殖实验检测HSCs上清对肿瘤增殖的影响,用混合淋巴实验检测HSCs的免疫调节作用.体内实验采用皮下移植瘤模型,分为H22单纯注射组与H22+HSCs联合注射组.20 d后对荷瘤小鼠行瘤组织解剖测量移植瘤大小;用免疫组化法观察两组肿瘤中T细胞亚群浸润变化情况和接种肿瘤PD-L1的表达变化;用流式细胞术分析脾脏中T细胞亚群变化.然后,通过Tunel检测肿瘤组织单核细胞凋亡情况.结果 在体外实验,Brdu检测显示HSC:条件培养基(HSCs-CM)能明显诱导H22细胞的增殖,而混合淋巴实验则显示HSCs对T细胞增殖有明显的抑制作用.在体内实验,HSCs+H22组小鼠皮下移植瘤的形成时间与生长速度明显快于单纯接种H22组;肿瘤组织免疫组化检测显示HSCs+H22组浸润的T细胞及其亚型较单纯H22组有不同程度降低;HSCs+H22组脾脏亦显示T细胞及其亚型出现不同程度降低.TUNEL试剂盒检测显示HSCs+H22组肿瘤组织中单核细胞的凋亡数量增加,免疫组化分析显示HSCs+H22组肿瘤组织中PD-L1表达增加.结论 HSCs可通过免疫抑制作用在肿瘤微环境中促进肿瘤的发生、发展,这一发现可能为肝癌的治疗提供新的思路.

Abstract：

Objective To determine immune modulatory activity of activated hepatic stellate cells( HSCs) in hepatocellular carcinoma and immune response in tumor microenvironment. Methods Cell proliferation was measured by BrdU incorporation with a microtiter plate reader at 450 nm. The effect of HSCs on T cell proliferation was measured by MLR. Mouse hepatic cancer cell line H22 were implanted on the backs of BALB/c mice to establish the subcutaneous transplanted tumor model. Then the mice were sacrificed after 20 days for anatomical and size determination. Furthermore, Paraffin-embedded tissue was removed by serial tissue sectioning and immunohistochemically examined for expression of T lymphocyte subsets. T lymphocyte subsets in splenocytes were detected by FCM. Apoptotic mononuclear cells were evaluated by FITC-labeled Tunel assay. Results We determined that HSCsCM promoted hepatocellular carcinoma(HCC) cell line proliferation and HSCs inhibit T cell proliferation by MLR in vitro. We also examined normal immune mice to assess the immunosuppression of HSCs in the development of HCC. In the co-transplantation with HSCs group, T cells and their subtypes decreased obviously in the tumors and the spleen. The results showed that co-transplanted HSCs can induce more PD-L1 expression and more mononuclear cell apoptosis in tumor tissue. Conclusion Our results demonstrated that HSCs promote HCC progression partially because of their immune regulatory activity. Our data supply new information to support an integral role for HSCs in promoting HCC progression and suggest that HSCs may serve as a therapeutic target for HCC.     

白藜芦醇抗肝星状细胞活性和抗肝纤维化的实验研究

目的 探讨白藜芦醇调节肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活性及其抗肝纤维化作用.方法 从大鼠肝脏分离纯化培养HSCs;DCFH-DA法检测不同浓度白藜芦醇对HSCs中活性氧的影响;通过CCK-8比色法检测白藜芦醇对HSCs增殖的影响.Western blot检测HSCs的α-肌动蛋白(α-SMA)表达.通过PCR检测白藜芦醇对HSCs活性相关基因表达的影响.给大鼠肝纤维化模型经腹输注白藜芦醇,检测肝组织病理切片,肝纤维化指标.结果 从大鼠活体分离培养HSCs.白藜芦醇可抑制HSCs中活性氧的产生;明显抑制HSCs的α-SMA表达(103 ±7,90 ±7,63 ±4,53 ±3,F=62.179,P ＜0.05)与增殖(0.536±0.052,0.411±0.047,0.327±0.063,0.312±0.032,F=12.776,P＜0.05);抑制HSCs活性相关基因(大鼠生肌调节因子、胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白Ⅰ)的表达(122 ±.5,96±3,68 ±3,60 ±3,F=180.600,P ＜0.05) (100 ±8,82±3,53±3,51 ±2,F =77.451,P＜0.05) (170±3,147±4,92 ±3,90 ±2,F=462.878,P＜0.05).大鼠活体实验显示白藜芦醇可降低肝羟脯氨酸含量及血清胶原蛋白Ⅲ和透明质酸水平(358.3 ±20.2,320.5±15.3,290.3±24.5,F=23.929,P ＜0.05) (32.8±3.1,28.9±1.3,25.3±1.8,F=20.050,P＜0.05)(276.3±17.8,225.3±28.3,195.4±11.2,F=18.585,P＜0.05).结论 白藜芦醇能够抑制大鼠HSCs的活化增殖,对活体肝纤维化具有一定的抑制作用,这可能与白藜芦醇的抗氧化及抑制MyoD的表达作用有关.