可调控的肝癌特异性基因治疗载体的构建

目的　构建新型AFP顺式作用元件调控的基因表达载体 ,检测该调控元件的特异性和可调控性。方法　PCR扩增截短的AFP基因启动子、增强子 ,将上述片段与含有报告基因强化绿色荧光蛋白基因的载体pEGFP 1的多克隆位点连接 ,构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性EGFP表达载体 (pEGFP 1 EP)。用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的肿瘤细胞系 ,荧光显微镜观测重组AFP顺式作用元件的启动活性 ,并用流式细胞术检测全反式视黄酸对它的抑制作用。结果　成功地将AFP基因启动子、增强子克隆到报告基因载体pEGFP 1的多克隆位点 ,酶切鉴定和DNA序列分析无误 ,荧光显微镜观测证实EGFP能在AFP阳性肝癌细胞特异性表达 ,1× 10 -7M全反式视黄酸对其活性有明显的抑制。结论　AFP顺式作用元件修饰的基因治疗载体 ,在基因转录水平特异性调控目的基因的表达 ,为下一步将其作为肝癌基因治疗载体奠定了基础。     

肝癌特异性血管抑制疗法的真核表达载体的构建及其表达

目的构建受甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白(Alb)启动子调控的含有血管抑制素(angiostatin)K5序列的真核表达载体,通过基因转染,将angiostatinK5基因导入肝癌细胞,观察angiostatinK5的表达。方法用RT-PCR法从正常人真核细胞扩增出angiostatinK5基因,将AFP增强子和Alb启动子调控序列定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1,并将angiostatinK5cDNA置于上述调控序列之下,从而构建得到重组真核表达载体pcDNA3.1-AFAB-angiostatinK5-His。利用细胞培养、脂质体介导的细胞转染,将angiostatinK5基因导入肝癌细胞。利用SDS-PAGE和Westernblot法检测肝癌细胞中angiostatinK5的表达。结果通过酶切鉴定及DNA测序证实目的真核表达载体pcDNA3.1-AFAB-angiostatinK5-His与预期的结果相同。SDS-PAGE及Westernblot分析证明,angiostatinK5在肝癌细胞中得以表达。结论构建的肝癌特异性重组真核表达载体可增加对AFP阳性肝癌细胞的治疗的特异性,并用于实现对肝癌的特异性血管抑制作用。     

甲胎蛋白启动子驱动的yCDglyTK双自杀基因治疗裸鼠肝癌的机制研究

目的研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内靶向性治疗肝癌的效果和机制。方法构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因表达质粒,通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721肝癌细胞的裸鼠肝癌皮下种植瘤,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果成功构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因,其靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞种植瘤上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞种植瘤上无表达,氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及两者联合可有效抑制HepG2细胞种植瘤的生长,抑瘤效果GCV＋5-FC〉5-FC〉GCV,而SMMC7721细胞种植瘤的生长未受影响。HepG2细胞种植瘤治疗后有明显的细胞凋亡,而SMMC7721细胞种植瘤内极少凋亡细胞。结论携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

人肝癌特异性 HSV-TK/GCV重组腺病毒相关病毒质粒的构建与研究

目的 构建肝癌特异性HSV—TK／GCV重组腺病毒相关病毒质粒并了解其在细胞内的表达。方法 以腺病毒相关病毒的质粒WAV2作为载体，将TK基因插在甲胎蛋白(AFP)增强子／白蛋白启动子(AFP增强子／ALB启动子)的调控基因的下游，重组成pWAV2／AFP-ALB／HYTK质粒载体。同时构建质粒载体pEGFP-1／AFP—ALB。然后将上述两种不同载体分别转入AFP阳性表达的HepG2细胞株以及阴性表达的7721、SPC和7901细胞株。结果 绿色荧光蛋白只在AFP阳性表达的HepG2细胞株表达，采用PCR技术，以HSV—TK的引物扩增所抽提的总DNA中，只有AFP阳性表达的HepG2细胞株扩增出了710bp的DNA片段。结论 pWAV2／AFP—ALB／HYTK质粒载体在体外实验中具有很好的靶向性。     

装载超抗原SEA基因的由前列腺特异性抗原和端粒酶逆转录酶启动子双调控靶向前列腺癌的溶瘤腺病毒载体的构建

目的 构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素(SEA)基因的由前列腺特异性抗原(PSA)启动子及端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子双调控的特异性增殖溶瘤腺病毒SG504-SEA.方法 从前列腺癌组织基因组DNA中获得522 bp大小的PSA启动子序列,将PSA启动子克隆到由hTERT启动子调控的特异性增殖溶瘤腺病毒载体SG502中.得到靶向前列腺癌细胞的双调控溶瘤腺病毒载体SG504.将已构建好的含有771 bp大小SEA基因片段的病毒骨架质粒PPE3-cdb-SEA与SG504用Lipofectamine 2000共转染至293细胞.共转染后9～14 d出现病毒空斑,经过3次病毒空斑纯化,经鉴定正确的腺病毒命名为SG504.SEA,即携带SEA基因的双调控靶向前列腺癌的特异性溶瘤腺病毒.结果 经聚合酶链反应(PCR)及酶切鉴定,SEA基因成功克隆到病毒载体中,可以表达SEA基因,且病毒滴度为2.0×10~(10)pfu/ml.结论 成功构建表达超抗原SEA基因的双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG504-SEA.     

蜂毒素基因重组腺病毒转染对肝癌细胞周期及磷脂酶A2表达的影响

蜂毒素(Melittin,Mel)是一种动物毒素,具有显著的抗肿瘤作用,但其溶血副作用限制了临床应用。为达到减毒增效的目的,将编码蜂毒素的基因置于人甲胎蛋白(AFP)基因启动子后,以复制缺陷型腺病毒为载体构建重组腺病毒。在初步证实该重组腺病毒对AFP阳性肝癌细胞具有特异性杀伤作用的基础上,通过观察其对肝癌细胞周期及磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)表达的影响,探讨其作用机制。     

肝癌特异性p53基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建一种肝癌细胞靶向性的腺相关病毒载体以用于肝癌的促凋亡基因治疗的研究。方法 通过设计含有特定酶切位点的引物,选择地从人基因组中出入甲胎蛋白（α－fe-toprotein,AFP）启动子序列并克隆以真核表达载体pTR－UF5上;再通过平端连接的方法,构建成含甲胎蛋白启动子和人野生型p53基因的重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）质粒rAAV－AFP－53和绿色荧光蛋白基因GFP（green fluorescence protein）的质粒rAAV－AFP－GFP。结果 成功地构建了以腺相关病毒为载体、受人甲胎蛋白启动子调控表达人野生型p53基因的质粒系统。结论 从理论上说,我们构建的重组腺相关病毒质粒rAAV－AFP－p53,可以特异性地转染到肝癌细胞中从而为肝癌基因治疗提供一种有效手段。     

肝癌特异性启动子调控的双靶位慢病毒载体的构建、鉴定及其在肝癌基因治疗中的应用

目的探讨survivin-CMV特异性启动子调控的双靶点慢病毒对肝癌细胞生长的影响。方法 RT-PCR扩增anti-AFP-scFv,测序鉴定,双酶切连接,获得pMD2G-anti-AFP-scFv质粒。针对已经筛选确定的IGF1R基因干扰有效序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与质粒pPRIME连接得到pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R质粒。RT-PCR扩增survivin-CMV肝癌特异性启动子,测序鉴定,与双酶切的质粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R连接,得到质粒sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。用sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R, psPAX2, pMD2G-anti-AFP-scFv共转染293T细胞,经过病毒空斑纯化,包装成慢病毒,测定病毒滴度。RT-PCR、Westernblot检测IGF1R表达,竞争抑制实验检测抗人AFP单链抗体活性。CCK-8法检测细胞生长。结果成功构建survivin-CMV肝癌特异性启动子调控的慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R;滴度为4.58×109PFU/mL;AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R抑制了肝癌细胞IGF1R表达,竞争实验显示抗人AFP单链抗体的基因高效表达,该慢病毒抑制肝癌细胞的生长。结论本次实验构建的慢病毒载体具有良好的靶向性,为肝癌生物治疗奠定了理论基础,提供了新的思路。     

TK自杀基因对甲胎蛋白阳性肝癌的特异性杀伤作用

目的观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统在体内外对人肝癌细胞的杀伤效应.方法在体外按MOI值为100、10、1、0用重组腺病毒转染人肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721,48 h后用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率.在两种肝癌裸鼠模型上,瘤体内注射重组腺病毒(1×1012 pfu/L)0.1 ml,GCV作用后观察抑瘤效果.结果体外MOI为100时,可杀死99.8%的BEL-7402细胞和17.8%的SMMC-7721细胞,两者差异有显著性(P＜0.05).体内BEL-7402组肿瘤生长明显受到抑制.结论在体内外,腺病毒介导的含AFP调控序列的HSV-tk/GCV自杀基因系统对甲胎蛋白(AFP)阳性肝癌细胞具有特异性杀伤作用,该系统可望用于肝癌的特异性基因治疗.     

双靶向溶瘤腺病毒携带内皮抑素基因对肝癌的抑制作用

目的 构建双调控溶瘤腺病毒,携带小鼠内皮抑素基因(mE),研究其对裸鼠肝癌移植瘤的抗瘤活性.方法 以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)和缺氧调控元件序列(HRE)调控腺病毒E1a和E1b基因,基因组插入mE基因,构建双调控溶瘤腺病毒CNHK500-mE;在裸鼠模型中观察CNHK500-mE对肝癌移植瘤模型的疗效.结果 CNHK500能够在hTERT阳性的肝癌细胞中增殖[24 h:(16.67±4.04)％;48 h:(65.33 ±7.02)％;P＜0.01],并介导mE高效表达;与空白对照组( 1895.80±323.37) mm3比较,CNHK500-mE和Ad-mE的抑瘤率分别为50.95％[(929.80±211.10) mm3,P＜0.01]和29.99％[(1327.23 ±319.36) mm3,p＜0.05];CNHK500-mE对癌组织间质血管的抑制作用明显强于Ad -mE(P ＜0.05).结论 将mE与溶瘤腺病毒结合,发挥病毒增殖的溶瘤作用和基因产物的血管抑制作用,表现出明显的协同抗瘤作用.     

双自杀基因重组腺病毒对胰腺癌细胞特异性杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK融合基因系统(Ad-KDR-CDTK)对胰腺癌细胞Capan-2特异性的杀伤作用.方法 重组腺病毒体外感染表达KDR的Capaw2细胞株,用不表达KDR的肝癌细胞HepG2做对照.观察其感染效率并以RT-PCR方法 检测转基因细胞CDTK的表达,然后给予不同浓度的前药更昔洛韦(ganciclovir,GCV)和5-氟胞嘧啶(5-fluorocy-tosine,5-FC),MTT法观察该体系对Capan-2和HepG2细胞生长增殖的影响及其旁观者效应;电镜观察细胞的病变;流式细胞仪检测细胞周期的变化和DNA含量的变化.建立Capan-2裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad-KDR-CD/TK,腹腔注射前药GCV(50 mg·kg-1·d-1)和5-FC(500 mg·kg-1·d-1)14 d,观察肿瘤生长抑制效应.结果 腺病毒对两种细胞株的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR方法 检测发现转染Ad-KDR-CDTK的Capan-2细胞有目的 基因表达.MTT法检测显示前药呈剂量依赖性抑制Capan-2生长,而不表达KDR的肝癌细胞HepG2对前药不敏感,且观察到该体系对Capan-2明显的旁观者效应.电镜下可见Capan-2有凋亡改变.用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少.在Capan-2裸鼠移植瘤模型中,该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的生长.结论 KDR启动子可调控双自杀基因体系选择性杀伤胰腺癌细胞Capan-2,诱导胰腺癌细胞凋亡,并可显著抑制人胰腺癌裸鼠移植瘤的生长.     

人端粒酶反转录酶启动子调控NK4基因靶向治疗结肠癌的实验研究

目的 构建人端粒酶反转录酶（HTERT）启动子调控的NK4基因重组腺病毒表达系统,探讨NK4基因对结肠癌生长、侵袭转移的抑制作用.方法 以Ad HTERTp-NK4重组腺病毒载体感染结肠癌细胞HTC116,分别以RT-PCR方法和Western blot检测细胞内NK4基因mRNA及蛋白表达量：MTT和体外侵袭实验观察NK4对结肠癌细胞增殖及侵袭转移能力的抑制作用.建立结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察重组腺病毒Ad HTERTp-NK4对裸鼠结肠癌移植瘤生长的影响.结果 Ad HTERTp-NK4重组腺病毒载体感染HCT116细胞后,HCT116细胞内NK4 mRNA及蛋白表达水平明显增高：Ad HTERTp-NK4重组腺病毒感染后,HCT116细胞生长抑制率和侵袭抑制率分别为47.14%和40.63%,与Ad HTERTp-GFP（空载体）组（2.75%和2.31%）比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.局部注射Ad HTERTp-NK4重组腺病毒载体后,结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤生长受抑,抑瘤率为47.3%,与空载体组（4.6%）比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 HTERT启动子调控NK4基因靶向治疗系统可有效抑制结肠癌的增殖及侵袭转移,在结肠癌的基因治疗具有较好的应用前景.     

肝细胞肝癌靶向性r-Caspase-3重组腺病毒的构建与表达

目的 构建肝细胞肝癌特异性表达反向半胱氨酸蛋白酶3(r-Caspase-3)重组腺病毒,为肝细胞肝癌的基因治疗提供新策略.方法 构建甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白 (ALB) 启动子腺病毒载体(pAdTrack-EAFP-PALB),然后将目的 基因r-Caspase-3亚克隆到载体pAdTrack-EAFP-PALB上, 获得重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB /r-Caspase-3, 经PmeⅠ酶切线性化后与pAdEasy-1同源重组,获得重组腺病毒骨架pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3; 鉴定正确的pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3 经PacⅠ酶切线性化后脂质体转染AD293 细胞进行包装、扩增,获得病毒.绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率; RT-PCR和Western blot 法检测r-Caspase-3在HepG2细胞中的表达; SRB染色法评估重组腺病毒对HepG2细胞的抑制作用,初步观察HepG2细胞凋亡状况.结果 穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB/r-Caspase-3酶切、测序正确.穿梭载体、pAdEasy-1载体同源重组后PCR 及PacⅠ酶切鉴定结果表明pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 重组成功; 经PacⅠ酶切线性化后,pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 转染AD293 细胞即可观察到GFP 的表达; 回收病毒可重复感染AD293 细胞,RT-PCR和Western blot 均可检测到r-Caspase-3的表达,证实Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3病毒颗粒包装成功; SRB染色检测发现Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3具有凋亡诱导特异性.结论 靶向性Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3重组腺病毒构建成功,并具有凋亡诱导靶向性,为进一步研究靶向性r-Caspase-3基因治疗肝细胞肝癌及其生物学功能奠定了基础.     

AIBP在肝癌细胞中的表达及意义与含AIBP基因及AFP启动子驱动的双自杀基因表达载体构建

目的：探讨载脂蛋白A-I结合蛋白（AIBP）在肝癌细胞中的表达及意义。方法：用RT-PCR与Western blot法分别检测正常肝细胞株L02,AFP阳性人肝癌细胞株HepG2和Hep3B,及AFP阴性人肝癌细胞株SMMC7721中AIBP基因与蛋白的表达;构建AFP启动子驱动的双自杀基因（CD,TK）+AIBP基因过表达载体pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK,并转染Hep3B和SMMC7721细胞,用MTT法检测转染后细胞的增殖能力,用RT-PCR和Western blot法检测细胞AIBP,血管内皮生长因子（VEGF）,VEGF受体2（VEGFR-2）,基质金属蛋白酶9（MMP-9）基因和蛋白的表达。结果：AIBP mRNA和蛋白在正常肝细胞中高表达,而在各肝癌细胞系中均表达下调,且Hep3B和SMMC7721细胞中下调明显。成功构建pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK真核表达质粒并转染入Hep3B和SMMC7721细胞。转染后AFP阳性Hep3B细胞生长到明显抑制,但AFP阴性SMMC7721细胞增殖不受影响;两种细胞的AIBP基因与蛋白表达均明显上调,而VEGFR-2,VEGF和MMP-9基因与蛋白表达明显表达下调。定量指标间的差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：AIBP在肝癌细胞中表达下调,AIBP与肝癌细胞的侵袭转移能力有关,而与细胞增殖能力无关;成功构建了联合基因载体pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK。

     

端粒酶逆转录酶启动子联合CD自杀基因靶向杀伤人肝癌细胞研究

目的 利用肿瘤特异性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子介导自杀基因CD表达,检测其促进5-FC对肝癌细胞系的杀伤作用.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术获得hTERT基因的启动子片段,将其连至SV40增强子序列后,并克隆到表达荧光素酶基因的报告质粒上,检测hTERT基因启动子在肝癌细胞系Bel-7402和人成纤维细胞HDF中的转录活性,同时将CD自杀基因连至该调控序列后,转染肝癌细胞Bel-7402,通过逆转录(RT)-PCR、噻唑蓝(MTT)比色法检测其作为肝癌基因治疗中肿瘤特异性靶向杀伤载体的可行性.结果 成功构建pGL3-SV40-hTERT载体和SV40-hTERT-CD-GFP质粒载体,转染ST-CD载体后Bel-7402细胞表达CD基因,转染PGL3-SV40-hTERT质粒后Bel-7402细胞中hTERT启动子高表达,相对活性为354%.与未转染组比较,5-Fc对转染SV40-hTERT-CD-GFP质粒载体的肝癌细胞Bel-7402的杀伤效应明显增强(F=27.831,P<0.01).结论 hTERT启动子在肝癌细胞系中具有较强的转录活性,能有效地诱导CD自杀基因的表达.     

E2F-1启动子调控下肿瘤靶向性作用的研究

目的 研究携带组织特异性E2F-1启动子的重组腺病毒载体的肿瘤细胞靶向性作用。方法 利用AdEasy-1系统,构建含有E2F-1启动子的重组腺病毒并对重组病毒中E2F-1启动子基因进行PCR及测序鉴定。将分别携带E2F—1启动子和CMV启动子并且可以表达绿色荧光蛋白报告基因GFP基因的重组腺病毒分别转染LS174T和H292细胞,观察GFP基因表达情况;以携带肿瘤杀伤基因vpr基因的靶向性重组腺病毒rvAdE2F-1／vpr分别转染人二倍体细胞L-02、H292和肿瘤细胞SMMC-7721、LS174T,MTT法检测rvAdE2F-1／vpr对不同细胞的抑制增殖的作用;用蛋白免疫印迹的方法检测肿瘤细胞和二倍体细胞中靶蛋白E2F蛋白的表达。结果 在相同的培养条件下,E2F-1启动子可使下游的GFP基因在肿瘤细胞LS174T中大量表达而在二倍体细胞H292中微量表达,CMV启动子下游的GFP基因表达量则无明显差异;且在LS174T细胞中两种启动子转录活性相似（P〉0．05）;E2F-1启动子调控下vpr基因的表达可以选择性的抑制肿瘤细胞增殖而对二倍体细胞无抑制作用;E2F-1蛋白在肿瘤组织中高表达而在正常组织中的表达不能用Western Blot检测到。结论 以E2F-1为启动子的重组腺病毒载体具有肿瘤细胞靶向性,并且有足够的启动效率调控杀伤基因作用于肿瘤细胞,因此是一个具有应用价值的靶向治疗体系。     

siRNA抑制肝癌细胞甲硫氨酸腺苷转移酶2A基因表达

目的构建siRNA体内表达载体pSilence-2．1-U6-siRNA，筛选出抑制甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)2A表达的有效靶序列，为MAT2A的功能研究奠定了基础。方法以MAT2A为目的基因，以产生siRNA质粒载体pSilence-2．1-U6为表达模板，细胞内转录合成4条siRNA，并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucF-MAT2A。脂质体转染法将重组质粒载体plucF-MAT2A与产生siRNA的质粒pSilence-2．1-U6共转染293T细胞，定量测量荧光素酶活性，初步筛选出抑制荧光素酶表达的有效siRNA，然后将有效的siRNA转染Bel-7402肝癌细胞，半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MAT2A mRNA表达，并检测转染后肝癌细胞MAT的活性及细胞凋亡情况，进一步证实siRNA对MAT2A表达的抑制效果。结果所合成的4条小干扰RNA中有2条抑制荧光素酶表达，抑制效率分别为81％和89％，并特异性抑制肝癌细胞MAT2A mRNA表达，降低了肝癌细胞中MAT活性，诱导肝癌细胞凋亡。结论siRNA抑制肝癌细胞MAT2A基因表达。     

人甲胎蛋白增强子驱动自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷自杀基因系统体内外靶向杀伤肝癌细胞的效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒;利用脂质体将质粒转染入AFP阳性肝癌细胞株HcpG2和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721;采用RT-PCR和Western blot检测TK mRNA和蛋白表达;MTT检测细胞的存活率;观察丙氧鸟苷对肝癌细胞体外增殖、生长曲线和细胞凋亡的作用,以及丙氧鸟苷体内抑制肿瘤生长的效应.采用t检验分析相关数据.结果 成功构建pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒并转染入肝癌细胞;AFP阳性肝癌细胞株HepG2中能检测到TKmRNA和蛋白表达;丙氧鸟苷呈剂量和时间依赖性抑制转染后肝癌细胞株HepG2的生长并诱导其凋亡;AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721中没有TKmRNA和蛋白表达,细胞增殖、生长曲线和凋亡均不受影响,两者比较,差异有统计学意义(t=2.58,2.73,3.12,P＜0.05).丙氧鸟苷可以特异性地抑制转染后肝癌细胞株HepG2治疗组中肿瘤的生长,肿瘤抑制率为46%,而在转染后肝癌细胞株SMMC7721治疗组中,对肿瘤生长无明显抑制作用,两者比较,差异有统计学意义(t=3.36,P＜0.05).结论 人AFP增强子驱动的HSV-TK/丙氧鸟苷自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞,抑制肿瘤生长.     

基因-病毒治疗系统CNHK500-p53的构建和体外初步研究

目的构建一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将目的基因表达盒mCMV启动子 p53基因 SV40polyA插入腺病毒E1A基因受端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控、E1B基因受缺氧反应元件(HRE)启动子调控的增殖病毒载体质粒pSG500的E1A下游,得到腺病毒质粒pSG500-p53;通过pSG500-p53与5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-p53;利用Westernblot和ELISA法检测病毒E1A、E1B基因和p53抑癌基因的表达;TCID50方法测定病毒滴度;通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力;应用细胞病理效应(CPE)实验检测病毒抗肿瘤作用。结果CNHK500-p53的病毒滴度为2×1010pfu/ml,增殖实验证实CNHK500-p53可以选择性地在端粒酶阳性和缺氧微环境的肝癌细胞中增殖,CNHK500-p53所携带的p53基因在肝癌细胞株中的表达量388±34.6μg/L明显高于非增殖型腺病毒载体Ad-p53的76.3±13.17μg/L(P<0.005),并显示了较强的抗肿瘤效应。结论CNHK500-p53是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统。     

体外腺病毒介导的HSV-tk/GCV对产生AFP的人肝癌细胞的影响

目的 观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）/丙氧鸟苷（GCV）自杀基因系统在体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应。方法 采用含有甲胎蛋白基因启动子、增强子和HSV-tk基因的嵌合基因,插入腺病毒中形成重组腺病毒（AdrAFPTK）,将该重组腺病毒分别感染体外培养的甲胎蛋白阳性人肝癌细胞BEL-7402和甲胎蛋白阴性人肝癌细胞SMMC-7721,逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测HSV-tk基因的转录表达,观察GCV对人肝癌细胞的选择性杀伤作用。结果GCV在体外对重组腺病毒转染的甲胎蛋白阳性的人肝癌细胞BEL-7402有明显的杀伤作用和“旁观者效应”,而对重组腺病毒转染的甲胎蛋白阴性的人肝癌细胞SMMC-7721无明显作用。结论 在体外,表达HSV-tk基因的甲胎蛋白的人肝癌细胞可被受甲胎蛋白基因表达调控序列控制的自杀基因HSV-tk特异性杀伤,表现出极高的细胞专一性。重组腺病毒AdrAFPTK可望用于肝癌的特异性基因治疗。