Bmi-1基因RNAi对喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的:构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对喉癌细胞Hep-2增殖、侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL2GFP,构建Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1。实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测稳定转染vshRNA-Bmi-1后喉癌细胞中Bmi-1mRNA及蛋白的表达;克隆形成实验及小室侵袭实验检测喉癌细胞增殖和侵袭能力的变化。结果:稳定转染vshRNA-Bmi-1后Hep-2细胞Bmi-1mRNA表达均明显下降,Hep-2细胞中Bmi-1蛋白表达明显下降。抑制率分别为79%及88%。Bmi-1干扰后Hep-2细胞增殖减慢、侵袭能力减弱。结论:成功构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1mRNA和蛋白在喉癌细胞Hep-2中的表达。Bmi-1基因的RNAi能抑制喉癌细胞Hep-2的增殖和侵袭能力。     

RNA干扰介导的PIK3CA基因沉默抑制Hep-2细胞增殖和侵袭力

目的观察RNA干扰介导PIK3CA基因表达沉默对喉鳞状细胞癌（简称喉癌）细胞增殖和侵袭力的影响,探讨PIK3CA基因作为喉癌基因治疗靶标的可行性。方法构建PIK3CA-shRNA的慢病毒表达载体,在脂质体介导下转染人喉癌细胞Hep-2。采用real-time RT-PCR和Western-blot检测PIK3CA基因的表达,MTT法、细胞克隆形成实验、细胞生长曲线检测细胞生长增殖,Boyden小室模型检测细胞的体外侵袭力。结果表达PIK3CA-shRNA的慢病毒载体构建成功;与对照组相比,实验组细胞PIK3CA mRNA和蛋白表达明显下调,分别达75％和70％（P〈0．05）;细胞增殖和侵袭力均受到明显抑制,差异显著（P〈0．05）。结论靶向PIK3CA基因的RNA干扰可抑制喉癌细胞的增殖和侵袭力,PIK3CA有望成为喉癌基因治疗的新的候选基因。     

EGFL7基因RNAi重组慢病毒的构建及其对喉癌细胞侵袭的抑制

目的:构建类表皮生长因子域7(EGFL7)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒,观察其对喉癌体外侵袭的抑制作用。方法:筛选确定的EGFL7基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pLV载体连接产生LV-sh EGFL7慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用重组慢病毒体外转导喉癌细胞,Western blot法检测喉癌细胞EGFL7蛋白表达。Boyden侵袭小室法实验观察转导shRNA后的喉癌细胞侵袭能力的变化。利用克隆形成实验检测EGFL7基因沉默对Hep-2细胞集落形成能力的影响。结果:成功构建EGFL7的慢病毒载体LV-sh EGFL7,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×108 TU/L。转导siRNA的喉癌细胞EGFL7蛋白表达阴性。EGFL7siRNA转导后喉癌胞体外侵袭能力下降。EGFL7基因沉默组细胞克隆集落形成率与Hep-2组细胞及空载体组细胞比较,细胞克隆集落形成率显著减低。结论:成功构建人EGFL7基因RNAi慢病毒载体,EGFL7基因沉默对喉癌细胞体外侵袭有明显的抑制作用。沉默EGFL7后,Hep-2细胞集落形成能力显著减低,...     

siRNA下调β-catenin基因对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭的影响CSCD

目的应用siRNA干扰β-catenin基因在喉癌Hep-2细胞中的表达,探讨下调β-catenin基因后对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法 RNA干扰技术干扰喉癌Hep-2细胞β-catenin基因的表达,实时荧光定量PCR和Western-blot方法进行干扰效果鉴定;采用MTT法检测细胞增殖能力、流式细胞仪AnnexinPI法检测细胞凋亡率、transwell法观察细胞的迁移侵袭能力。结果实时荧光定量PCR检测表明β-catenin-siRNA干扰组mRNA相对表达量较空白对照组下降达70%,Western blot结果显示干扰组β-catenin蛋白相对表达量为(0.545±0.111),较空白对照组(1.507±0.139)和阴性对照组(1.429±0.089)明显下降(F=21.859,P<0.05)。细胞增殖实验证实靶向干扰β-catenin表达导致喉癌细胞增殖明显受抑制。流式细胞仪AnnexinPI法检测说明,β-catenin-siRNA干扰组凋亡率(18.80±0.81)%与空白对照组(8.6±0.68)%和阴性对照组(9.03±0.26)%相比明显增加(F=253.93,P<0.01)。Transwell侵袭实验表明β-catenin-siRNA干扰组穿过Matrigel到达下室的平均细胞数较空白对照组和阴性对照组均明显减少(F=136.20,P<0.01)。结论干扰β-catenin基因在喉癌Hep-2中的表达可抑制喉癌Hep-2细胞的增殖和侵袭能力,促进喉癌Hep-2细胞的凋亡。     

慢病毒介导的基质金属蛋白酶2基因沉默抑制喉癌侵袭生长的实验研究

目的 探讨siRNA(小干扰RNA)重组慢病毒介导的基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)基因沉默对喉鳞癌侵袭生长的抑制作用.方法 采用RNA干扰技术,将MMP-2基因siRNA的重组慢病毒(MMP-2-RNAi-Lentivirus)转染喉鳞癌Hep-2细胞,并运用蛋白印记法检测Hep-2细胞MMP-2基因的蛋白表达;通过博伊登(Boyden)侵袭小室观察MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后喉癌细胞侵袭能力的变化.构建喉癌移植瘤裸鼠模型,瘤内注射MMP-2-RNAi-Lentivirns,观察抑瘤效果;透射电镜观察肿瘤形态;运用免疫组化方法检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达,以评估细胞增殖的情况.结果 MMP-2-RNAi-Lentivirus能高效地转染靶细胞,转染效率在90%以上.蛋白印迹法检测显示,转染后的Hep-2细胞中MMP-2蛋白表达阴性.侵袭实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后的实验组Hep-2细胞中穿过人工基底膜的平均细胞数(x±s,以下同)为(12±4)个,明显少于空载体对照组的(35±6)个(t=14.492,P<0.01).体内实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus瘤内注射后,裸鼠移植瘤平均重量和平均体积均明显小于对照组,抑瘤率为44.2%.透射电镜观察到MMP-2-RNAi-Lentivims治疗组肿瘤细胞侵袭表型降低,治疗组肿瘤增殖细胞核抗原指数(49.588±6.995)也明显小于对照组(71.434±7.043,t=9.573,P<0.01).结论 siRNA重组慢病毒介导的MMP-2基因沉默能有效地抑制喉癌的侵袭、生长及增殖,为喉癌的基因治疗提供一定的实验依据.     

靶向c-Met的shRNA重组质粒的构建及生物活性鉴定

目的设计以人c-Met基因为靶向的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）,构建携带此shRNA的重组质粒,检测其抑制c-Met mRNA及蛋白表达的效应,筛选RNAi作用最强的shRNA片段。方法设计3对针对c-Met基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA的重组质粒pSilencer 2.0/c-Met-shRNA,通过脂质体介导的方法将其转染到喉癌Hep-2细胞株中。采用RT-PCR及Western-Blot法检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,比较转染前后其表达的变化,判断各shRNA的干扰效应。结果经测序,模板序列与设计序列完全正确,经过RT-PCR及Western-Blot法检测,转染干扰质粒后,c-Met基因的mRNA水平及蛋白表达水平均下调,以重组质粒pSilencer 2.0/c-Met-sh RNA2效应最显著。结论成功构建了针对c-Met基因的重组RNAi质粒,为下一步探讨c-Met基因对喉癌Hep-2细胞的生物学行为的作用奠定了基础。     

RNA干扰DJ-1基因抑制喉癌细胞的增殖

目的 探讨RNA干扰(RNAi)抑制喉癌Hep-2细胞DJ-1基因的表达及观察其细胞效应.方法 设计合成3对特异性针对人DJ-1基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染Hep-2细胞,实验分为4组:瞬时转染非特异性siRNA对照组及转染特异性siRNA 3组(siRNA1、siRNA2、siRNA3).采用RT-PCR检测DJ-1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测DJ-1蛋白,流式细胞仪检测细胞凋亡及四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测特异性siRNA1组对Hep-2细胞效应.结果 本实验设计合成的3对特异性siRNA均不同程度地抑制DJ-1基因表达,其中特异性siRNA1组抑制效果最佳.M1Tr比色法结果显示特异性siRNAl组(终浓度50 nmo~L、100 nmolZL)对Hep-2细胞增殖具有抑制作用.流式细胞仪检测结果最示特异性siRNA1组能诱导Hep-2细胞凋亡,转染特异性siRNA1组凋亡率为(15.7±4.8)%,非特异性siRNA对照组凋亡率为(4.5±0.4)%,非特异性siRNA对照组与特异性siRNA1组凋亡率比较差异有统计学意义(t=4.736,P<0.01).结论 转染特异性siRNA组能有效抑制Hep-2细胞增殖,诱导Hep-2细胞凋亡.     

RNA干扰沉默Aurora-A基因抑制喉癌Hep-2细胞生长的实验研究

目的 研究RNA干扰沉默Aurora-A基因后对喉癌Hep-2细胞体外体内生长的抑制作用.方法 构建靶向Aurora-A的小干扰RNA(siRNA)表达质粒并转染喉鳞癌Hep-2细胞株,采用CCK-8实验、Transwell实验、软琼脂克隆形成实验和裸鼠体内接种观察Aurora-A沉默后Hep-2细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力以及体内肿瘤生长情况,Western blot和免疫组化检测参与细胞黏附侵袭的重要因子黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达情况.结果 Hep-2细胞转染Aurora-A siRNA 后,siRNA-3实验组的Aurora-A蛋白的表达下降了52％,CCK-8实验中siRNA-3组细胞的平均(x±s)吸光度值为(3.268±0.106),低于Hep-2细胞组的(3.722 ±0.152),差异有统计学意义(F=17.634,P＜0.01);Transwell实验显示,siRNA-3组每个视野的平均侵袭细胞数目为(110.0±18.0)个,较Hep-2组的(236.0 ±26.0)个减少,两组差异有统计学意义(F=26.462,P＜0.01);克隆形成实验中,siRNA-3组平均集落数目(31.0±6.6)个,低于Hep-2组平均细胞集落数目(104.0±14.0)个(F=75.321,P＜0.001).接种后,体内移植瘤生长受到抑制,siRNA-3组的肿瘤平均体积为(127.77±174.83) mm3,低于Hep-2组的肿瘤平均体积(837.26±101.80) mm3(F=28.187,P＜0.001).在体外和体内黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达也下降.结论 抑制Aurora-A基因后,通过降低黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达,抑制Hep-2细胞的生长,减弱肿瘤细胞的恶性侵袭性,Aurora-A可以成为喉鳞癌治疗良好的干预靶点.     

RNAi沉默PDCD4基因对人喉癌Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响

目的 应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,探讨其对Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响。 方法 设计并合成针对PDCD4基因的shRNA质粒与阴性对照质粒,分别转染Hep-2细胞。实时定量RT-PCR和Western blotting检测转染前后阴性对照组与干扰组PDCD4、β-catenin基因mRNA和蛋白的表达。克隆形成实验观察Hep-2细胞增殖能力的变化。 结果 与对照组相比,PDCD4干扰组的Hep-2细胞克隆形成率显著升高(P=0.01),PDCD4干扰组PDCD4mRNA和蛋白均显著减低(P<0.01)、β-catenin mRNA和蛋白均较对照组显著增加(P<0.01)。 结论 成功应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,Hep-2细胞克隆形成能力增强,β-catenin mRNA和蛋白表达显著升高。     

EB病毒核抗原1对鼻咽癌细胞增殖及细胞周期的影响

目的 研究EB病毒核抗原1(Epstein-Barr virus nuclear antigen 1,EBNA1)对人鼻咽癌细胞增殖及细胞周期的影响.方法 构建特异性的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)EBNA1慢病毒干扰载体,包装慢病毒后感染过表达EBNA1的鼻咽癌细胞C666-EBNA1(简写为CE).应用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)和细胞计数法检测细胞增殖状态,流式细胞术、荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测细胞周期及相关调控因子变化.结果 成功构建含shRNA EBNA1的重组慢病毒,其感染可显著下调CE细胞中EBNA1表达.细胞计数和MTT均证明CE-shRNA细胞的增殖能力较CE-对照组显著下降(P值均＜0.05).细胞周期提示干扰EBNA1后CE细胞G0-G1期比例由(62.43±6.62)%升高到(89.66±0.64)%,两者比较差异有统计学意义(t=-7.091,P=0.002),S期比例由(34.93±7.36)%下降为(7.82±2.44)%,两者比较差异有统计学意义(t=6.095,P=0.004),G2-M期无明显变化(t=0.090,P=0.933).抑制EBNA1后,c-myc、CDK4、CDK6、pRb的mRNA水平分别下调65.60%、34.06%、41.05%、55.29%.蛋白免疫印迹法证实抑制EBNA1后4种蛋白的表达亦下调.结论 沉默EBNA1基因可抑制鼻咽癌细胞增殖,其机制之一可能是通过影响c-myc、CDK4、CDK6、pRb等基因的表达使鼻咽癌细胞阻滞于G0-G1期.     

表皮生长因子受体信号通路调控E-cadherin表达影响喉癌细胞增殖和侵袭的机制

目的　探讨表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）信号通路调控喉癌细胞E-cadherin表达并影响细胞增殖、侵袭等生物学行为的机制。方法　采用外源性的EGFR激动剂表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和EGFR酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼干预体外培养喉癌Hep-2细胞,检测细胞增殖、周期、凋亡、迁移力和侵袭力及相关蛋白表达改变。结果 EGF呈时间和浓度依赖性促进喉癌细胞增殖,并使喉癌细胞G1期比例减少而S期比例增加,细胞迁移距离及侵袭能力明显增加;厄洛替尼呈时间和浓度依赖性抑制喉癌细胞增殖,并导致喉癌细胞G1期比例增加而S期比例减少,同时增加细胞凋亡率,细胞迁移距离及侵袭能力均明显低于对照组。Western blot检测发现EGF干预使喉癌细胞E-cadherin表达下调而Vimentin表达上调,而厄洛替尼干预后喉癌细胞E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调。结论 小分子酪氨酸激酶抑制剂阻断EGFR信号通路导致喉癌Hep-2细胞E-cadherin表达上调,并抑制细胞增殖和侵袭转移能力。     

口咽鳞状细胞癌新鲜冰冻组织中人乳头状瘤病毒的检测及分型

人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）中有些型别与癌前病变相关,称为高危型HPV。国际癌症研究机构已认定HPV-16和HPV-18对人有致癌作用[1]。近年来有研究表明,高危型HPV感染与部分头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）关系密切,HPV感染与否对HNSCC患者的预后有着显著影响,无论是治疗效果还是生存率,HPV阳性患者都优于阴性患者[2,3]。口咽鳞状细胞癌（oropharyngeal squamous cell carcinoma,OSCC）,是HNSCC中常见恶性肿瘤,多发生于中老年男性,大量吸烟和/或饮酒是其公认的致癌因素,然而部分患者并无大量吸烟和/或饮酒的病史,针对这类患者的发病原因,研究者将目光转向了HPV感染。以往对口咽鳞癌与HPV感染情况的报道较少,包括HPV的感染率及常见型别均不明确。本课题拟收集30例OSCC（扁桃体癌）新鲜冰冻组织标本进行HPV DNA检测并分型,了解HPV的感染情况及常见型别。     

小鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法比较

在变应性鼻炎的基础研究中,探讨调节性T细胞（T regulatory cell,Treg细胞）中转录因子FoxP3对细胞因子受体Ebi3表达调控的分子机制,是以小鼠脾脏淋巴细胞为研究对象,可以通过CD荧光抗体标记,免疫磁珠分选法或流式细胞分选法获得Treg细胞。因此,建立有效的小鼠脾脏淋巴细胞分离技术是至关重要的前期工作,是进行这些研究的先决条件。本文采用了两种方法对小鼠脾脏Treg细胞进行分离,并对脾脏Treg细胞活性与获得率进行了比对分析。     

晚期喉咽癌围手术期放疗及喉功能保留

目的 评价局部晚期喉咽癌保留喉功能的手术选择及治疗效果.方法 回顾性分析了1976年1月～1999年12月我院初治的、经手术治疗的全部或部分保留了喉功能的47例T3级、T4级喉咽癌患者.其中咽后壁癌3例(均为T3级),梨状窝癌44例(36例T3级,8例T4级).术前放疗44例;手术加术后放疗3例.根据原发或放疗后的病变范围行手术治疗,其中:梨状窝切除术21例;梨状窝及部分喉切除术16例;喉咽部分切除,近全喉切除术10例.结果 Kaplan-Meier方法计算全组5年生存率为53.9%.Ⅲ、Ⅳ期5年生存率分别为59%和50.2%.3种术式局部复发率分别为14.3%、6.3%和21.4%.结论 对晚期喉咽癌的患者,可以选择病例进行喉咽根治手术,保留全部或部分喉功能.     

RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的实验研究

目的 应用RNA干扰技术构建一个载体同时编码四个基因,即血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶的短发夹重组质粒,并与单基因质粒做对比,通过体内外实验,研究其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶并含荧光素标记的短发夹RNA质粒命名为P-1,并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶的质粒,分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5,分别将其将转染人鼻咽癌CNE-2Z细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在CNE-2Z细胞及瘤体内的转染及表达情况.四甲基偶氮噻唑蓝法检测细胞增殖活性,实时PCR在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果,Trans well侵袭小室模型观察导入CNE-2Z细胞对其恶性生物学行为的改变,流式细胞仪观察各组凋亡率,体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果.结果 多基因干扰质粒转染鼻咽癌细胞后,CNE-2Z细胞增殖受到明显抑制,体外侵袭能力显著下降(P值均＜0.05).实时PCR证实多基因组4个不同基因mRNA表达均降低,免疫印迹技术验证目的基因蛋白同时表达下调.流式细胞仪结果证明多基因凋亡率明显高于单基因组(P值均＜0.05).体内抑瘤实验表明,与阴性组和空白组相比,P-1组移植瘤生长明显受到抑制(P＜0.05),并且多基因质粒抑制肿瘤细胞增长的作用要强于单基因干扰质粒(户值均＜0.05).结论 同时干扰多个基因能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌基因治疗奠定了良好的实验基础.     

细胞凋亡在喉鳞状细胞癌发生发展中的变化

目的探讨细胞凋亡在喉鳞状细胞癌(LSCC)发生发展中的变化。方法应用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测了40例LSCC组织,20例喉不典型增生组织(LAH)和20例声带息肉组织中细胞凋亡指数(AI),并用免疫组织化学SP法检测了这些组织中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果在声带息肉、不典型增生和LSCC标本中,AI分别为12.07±0.21,5.19±0.36和0.32±0.48;PCNA标记指数(P-LI)分别为23.66±1.78,38.19±1.95和67.50±1.33。结论细胞凋亡的抑制与LSCC的发生发展密切相关,AI与P-LI可作为判断LSCC生物学特性和预后的重要指标。     

老年突发性聋患者血液纤维蛋白原和黏附分子测定及其临床意义

目的　探讨老年突发性聋患者血液纤维蛋白原,可溶性细胞间黏附因子（soluable intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1）,可溶性血管内皮黏附因子-1（soluable vascular cell adhesion molecule-1,sVCAM-1）的变化以及不同分型突发性聋患者的差异。方法　40例老年突发性聋患者按照中华医学会最新的诊断治疗指南分型,并按有无合并症进行分组,40例健康的老年体检者作为对照组。测定血液纤维蛋白原水平,sICAM-1和sVCAM-1表达,结果进行统计学分析。结果　老年突发性聋血纤维蛋白原、sICAM-1和sVCAM-1表达均高于对照组,差别有显著性意义。不同突发性聋分型患者间以上指标的表达无显著性差别,但有合并症突发性聋以上指标的表达高于无合并症,差别有显著性意义。结论　老年突发性聋血液纤维蛋白原、sICAM-1和sVCAM-1表达增高,微循环障碍可能在老年突发性聋发病中占主导地位。     

雷帕霉素靶向阻断作用对鼻咽癌细胞生长的实验研究

目的 研究雷帕霉素对鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2的生长抑制作用及对细胞周期的影响.方法 采用活细胞计数试剂盒法(cellcounting kit-8,CCK-8法)观察不同浓度雷帕霉素在不同时间点对鼻咽癌细胞的生长抑制作用,光学显微镜下观察其形态学变化,流式细胞仪检测其细胞周期变化及细胞凋亡情况,反转录聚合酶链反应分析哺乳动物雷帕霉素靶蛋白基因的表达情况.结果 雷帕霉索在一定浓度范围内对鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2的生长抑制作用随药物浓度的升高而逐渐增强.光镜下可观察到细胞变圆、密度降低等形态学的改变.流式细胞仪显示,150 nmol/L雷帕霉素作用48 h,CNE-1和CNE-2细胞生长周期均出现G0/G1期阻滞,且变化亦随药物浓度升高而增强;但诱导细胞凋亡作用不明显.反转录聚合酶链反应显示雷帕霉素使CNE-2细胞株哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mRNA的表达下降(t=10.625,P＜0.01).结论 雷帕霉素对鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2具有生长抑制作用,可阻滞细胞周期进展,并可能通过下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的表达而抑制细胞生长和细胞周期.     

喉声门型癌Ⅲ期病变临床治疗

目的比较不同治疗方案对喉声门型癌T3N0M0病变预后的影响,优化临床治疗.方法分析1992年～1999年我院采用喉垂直部分切除术、喉全切除术和根治性放射治疗等方案治疗的65例喉声门型癌T3N0M0病变的临床资料,比较不同治疗的总体生存率、原发部位及颈部淋巴结复发率和喉功能保留率.结果Cox分析显示三种治疗方案的总体生存率、原发部位和颈部淋巴结复发率无显著性差异（P＞0.05）;喉垂直部分切除术和根治性放射治疗的喉功能保存率高,差异有显著性（P＜0.01）.结论三种方案治疗喉声门型癌T3N0M0病变,总体生存率和复发率无差异,喉垂直部分切除术和根治性放疗有利于保留喉功能.     

大鼠耳蜗大上皮嵴细胞体外培养的实验观察

目的建立大鼠耳蜗大上皮嵴（greater epithelial ridge，GER）细胞体外培养体系，探讨其在离体培养条件下的生物学特性、生长模式及超微结构。方法取生后1d大鼠耳蜗，利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出纯GER细胞，分别于无血清和含10％胎牛血清的DMEM培基中进行培养，观察细胞生长特性，并对培养物进行溴脱氧尿苷（BrdU）、鬼笔环肽（phalloidin）、Z01、钙视网膜蛋白（calretinin）及肌球蛋白VIIa（myosin VIIa）免疫组化鉴定及扫描电镜观察。结果GER体外培养细胞呈现典型的上皮样多角形外观，细胞间连接紧密，具有明显的增殖能力，在含血清培养基中易形成贴壁细胞岛，而在无血清培养条件下则易形成悬浮细胞球。GER细胞呈现BrdU、phalloidin以及Z01染色的阳性反应，而calretinin及myosinVIIa则表现为阴性。扫描电镜显示GER细胞表面可见微绒毛和中心体，但未见毛细胞特异性结构纤毛束。结论GER体外培养细胞具有增殖能力，在不同培养条件下可分别呈现贴壁细胞岛及悬浮细胞球生长特性，GER细胞表达上皮细胞来源标记物，但不表达毛细胞特异性标记物。