RNA干扰血管紧张素转换酶对自发性高血压大鼠血压及心肌重构的影响

目的 用RNA干扰技术下调血管紧张素转换酶(ACE)表达,观察其对自发性高血压大鼠血压及心肌重构的影响.方法 自发性高血压大鼠随机分为3组,即空白对照组(尾静脉注射生理盐水),病毒对照组(尾静脉注射对照腺病毒),治疗组[尾静脉注射表达ACE基因特异性短发夹RNA(shRNA)的重组腺病毒载体],同时设WKY正常血压对照组.以上各组大鼠均于实验的第1、16天各注射1次.干预前后检测尾动脉压的变化.于首次注射后第3天,用RT-PCR及Western blot法检测心肌、主动脉组织中ACE mRNA及蛋白的表达,ELISA法检测血清中ACE的含量.实验结束时,检测左心重/体重及心肌胶原蛋白的含量,并用透射电镜观察心肌超微结构的变化.结果 治疗组于每次注射后,尾动脉压均明显下降22 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)左右,单次注射后降压作用至少可持续14 d,累积降压幅度达38 mm Hg左右,而空白对照和病毒对照组血压则持续升高.治疗组心肌、主动脉组织中ACE mRNA及蛋白表达明显低于空白对照组和病毒对照组(P＜0.05),而与WKY组比较差异无统计学意义.治疗组血清ACE含量(16.37±3.90)ng/ml也明显低于空白对照组(48.26±1.50)ng/ml和病毒对照组(46.67±2.82)ng/ml,P＜0.05,而与WKY组(14.88±3.15)ng/ml比较差异无统计学意义.治疗组左心重/体重与心肌胶原蛋白含量[2.24±0.19与(1.283±0.019)μg/mg]明显低于空白对照组[3.21±0.13与(1.686±0.013)μg/mg]和病毒对照组[3.13±0.12与(1.682±0.009)μg/mg],P均＜0.05,但还未降到WKY组水平[2.06±0.11与(1.257±0.019)μg/mg].电镜观察显示治疗组心肌超微结构得到了明显改善.结论 RNA干扰可有效下调ACE表达,降低自发性高血压大鼠血压,改善心肌重构.RNA干扰有望成为高血压病基因治疗的新方法.     

急性肺栓塞大鼠血清血管紧张素转换酶1的变化

目的探讨急性肺栓塞大鼠血清血管紧张素转换酶1的变化。方法雄性SD大鼠24只,随机分为对照组,栓塞后24 h组,栓塞后1周组,每组8只;以明胶海绵溶液经颈静脉注入制备大鼠肺栓塞模型,对照组注入同等体积生理盐水。3组大鼠分别于1周(对照组)、栓塞后24 h、栓塞后1周时处死。经右心导管测定肺动脉压、心率、呼吸频率,取动脉血行动脉血气分析及血清血管紧张素转换酶1活性测定;取肺组织制备病理切片,HE染色光镜下观察肺动脉栓塞情况。结果对照组,栓塞24 h组,栓塞1周组大鼠肺动脉平均压分别为(14.2±4.1)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)(、26.1±7.5)mm Hg(、26.1±6.8)mm Hg(P<0.05);动脉血氧分压分别为(94.1±8.8)mm Hg(、80.5±5.8)mm Hg(、80.4±13.8)mm Hg(P<0.05);3组大鼠血清血管紧张素转换酶1分别为(30.5±7.2)U/L(、53.5±15.9)U/L(、45.8±17.4)U/L(P<0.05)。光镜下观察,栓塞后24 h组肺组织切片均可见多个肺动脉管腔内海绵明胶栓塞,有继发红血栓形成,肺组织充血、水肿、炎性细胞浸润;栓塞后1周组大鼠部分肺动脉管腔内海绵明胶溶解。结论急性肺栓塞大鼠肺动脉压升高的同时,血清血管紧张素转换酶1明显升高,其程度可能与肺血管床阻塞的范围或程度有关。     

小干扰RNA对大鼠血管内皮细胞ICAM-1表达的抑制作用

目的:探讨小干扰RNA对大鼠血管内皮细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的抑制作用.方法:使用 ICAM-1siRNA及错配siRNA转染肿瘤坏死因子-α刺激过的大鼠血管内皮细胞,聚合酶链反应和蛋白印迹检测转染后48 h ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平.结果:与空白对照组比较,大鼠血管内皮细胞在转染48 h后ICAM-1 mRNA表达减少90.0％,蛋白表达减少83.0％.结论:使用小干扰RNA能有效抑制大鼠血管内皮细胞ICAM-1表达.     

血管紧张素转换酶基因插入/缺失多态性检测方法的研究

目的 采用三条引物法进行力紧张素转换酶（ACE）基因分型检测,并与Rigat法进行比较,以探讨Rigat造成DD型分型的错判率,并用此方法检测了中国汉族人群中ACE基因I／D基因型的分布频率以及插入（I）／缺失（D）多态性与高血压病（EH）间的相关性。方法 EH患（EH组）206例,用上述两种方法进行ACE基因分型;正常血压组（NT组）156例以及核心家系25个共118例,三条引物法进行ACE基因分型。结果 EH组Rigat法得出的DD型比例较三条引物法高。与三条引物法相比较,Rigat法对DD型的错判率为13．04％。用三条引物法进行基因分型的结果如下：（1）在NT组,ACE各基因型的分布频率为Ⅱ型0．51,ID型0．41,DD型0．08。等位基因频率为：I0．71,D0．29。（2）25个EH家系所有成员的基因分型结果,完全符合孟德尔遗传规律。（3）EH与NT两组间基因型和等位基因频率无显性差异。结论 三条引物法1次完成ACE基因分型,有良好的特异性、准确性和重复性。     

原发性高血压血管紧张素转换酶基因多态性与性别的关系

目的　研究血管紧张素转换酶 (ACE)基因插入 缺失 (I D)多态性与不同性别原发性高血压 (EH)的关系。方法　应用聚合酶链反应技术分析 138例原发性高血压患者及 6 0名正常对照组的ACE基因型。结果　原发性高血压组缺失纯合子 (DD)基因型及D等位基因频率显著高于对照组 (P<0 .0 5 )。且男女两性相比 ,原发性高血压组男性DD基因型频率显著高于女性 (P <0 .0 5 ) ,收缩压水平亦显著高于女性 (P <0 .0 5 )。结论　原发性高血压与ACE基因I D多态性之间存在一种特殊的伴性关系。     

血管紧张素转换酶基因多态性与扩张型心肌病的关联研究

目的研究血管紧张紊转换酶基因插入/缺失(I/D)多态性与扩张型心肌病的关系.方法应用聚合酶链反应技术检测83例扩张型心肌病患者与正常对照组155名健康受试者血管紧张素转换酶基因第16内含子I/D多态性.结果正常对照组血管紧张素转换酶基因DD、ID、Ⅱ型频率分别为16.1%、51.6%和32.3%,D、I等位基因频率分别为0.419和0.581;扩张型心肌病组血管紧张素转换酶基因DD、ID、Ⅱ型频率分别为37.4%、30.1%和32.5%,D、I等位基因频率分别为0.524和0.476.扩张型心肌病患者血管紧张素转换酶基因DD型(X2=13.528,P＜0.001)和D等位基因(X2=4.781,P＜0.05)频率均高于正常对照组.结论血管紧张素转换酶基因DD型和D等位基因可能是扩张型心肌病遗传易感性的基因标志之一.     

白大衣高血压血管紧张素转换酶基因多态性分析

目的：研究白大衣高血压与血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因I／D多态性的关系。方法：应用多聚酶链式反应（PCR）方法对白大衣高血压，高血压病Ⅰ级患者和正常血压者各30例进行ACE I／D基因型检测，并分析比较。结果：白大衣高血压和高血压病Ⅰ级组Ⅱ基因型低于正常组（P〈0．01），白大衣高血压和高血压病Ⅰ级组DD基因型高于正常组（P〈0．01），白大衣高血压ID基因型显著高于高血压病Ⅰ级组和正常组（P〈0．01）。高血压病Ⅰ级组ID基因型低于正常组（P〈0．01）。结论：白大衣高血压与ACE基因多态性有关，ID基因型者易患白大衣高血压。     

贝那普利对肝纤维化大鼠血管紧张素转化酶2表达的影响

肝脏存在独立的肾素-血管紧张素系统(RAS),其中血管紧张素(Ang)Ⅱ是其核心效应分子,促进肝纤维化形成[1].近来发现RAS系统存在新的代谢通路,Ang Ⅱ被血管紧张素转化酶2(ACE2)降解为Ang(1-7),其与AngⅡ生物学作用相拮抗.我们的目的是观察血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)贝那普利对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化模型的疗效及其对ACE2的影响.     

心房颤动患者心房组织的血管紧张素转换酶2表达及血管紧张素转换酶抑制剂干预的影响

目的 探讨心房颤动（房颤）患者心房肌组织中血管紧张素转换酶2（ACE2）的表达和血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）干预的影响及可能的信号传导途径。方法 选取接受开胸手术的风湿性心脏病患者47例,手术中取右心耳处心房肌标本。采用RT-PCR法检测心房肌ACE2和ACEmRNA水平,采用Western blot法检测ACE、ACE2、细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2）和磷酸化的细胞外信号调节激酶1／2（pERK1／2）蛋白表达水平,应用放射免疫法检测心房肌组织血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）水平。结果 与窦性心律组相比,持续性房颤组心房肌组织中ACE2表达显著减少（P〈0．05）,而ACE的表达和AngⅡ含量显著增加（P〈0．05）。ERK1／2的活化水平在持续性房颤组较窦性心律组明显增加（P〈0．05）。与持续性房颤组相比,ACEⅠ干预组ACE2表达水平显著增加（P〈0．01）,ERK1／2的活化水平显著降低（P〈0．05）,而ACE表达和AngⅡ含量差异无统计学意义。结论 房颤患者心房肌组织中ACE2表达下调,ACE／ACE2平衡失调;ACEⅠ对房颤的长期临床效应可能与其上调ACE2、抑制有丝分裂素激活蛋白激酶信号途径有关。     

云南纳西族人群血管紧张素转换酶基因多态性与脑血管病的相关性研究

目的 探讨血管紧张素转换酶(angiotension-convertion enzyme,ACE)基因插入/缺失(insertion/deletion,I/D)多态性与云南丽江纳西族脑血管病的相关性.方法 纳入58例纳西族脑梗死患者、32例纳西族脑出血患者以及50例性别和年龄相匹配的纳西族健康对照者,采用聚合酶链反应-...     

短发夹状双链RNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达

目的研究载体表达的短发夹状双链RNA（shRNA）对丙型肝炎病毒（HCV）IRES介导的基因表达的特异性抑制作用。方法构建HCV IRES调控的绿色荧光蛋白表达载体（pIRES—GFP）和虫荧光索酶表达载体（p5′ UTR—Luc），以及针对HCV IRES的shRNA表达载体（pshRNA-HCV）。共转染HepG2细胞，于转染后24、48、72h观察绿色荧光的强弱，用Western blot检测绿色荧光蛋白的表达，半定量逆转录聚合酶链反应法检测GFP的mRNA水平。双荧光索酶系统检测虫荧光索酶活性。结果pshRNA-HCV作用组绿色荧光强度明显弱于未干扰组，GFP蛋白表达量及虫荧光素酶活性降低60％～70％，半定量逆转录聚合酶链反应显示pshRNA-HCV导致了GFP基因mRNA水平的降低。结论针对HCV IRES的shRNA能够显著和特异地抑制该区域调控的蛋白表达水平及mRNA水平，该研究结果为利用RNA干扰技术治疗HCV感染进行了初步探索。     

不同靶区RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制与表达

目的 观察针对乙型肝炎病毒（HBV）不同靶区发夹样RNA（shRNA）抑制HBV复制与表达的效率。方法 根据shRNA表达载体设计原则，设计并构建了针对HBVP、C、S和X区7种特异性和2种序列突变的shRNA表达载体，将其与1．3倍HBV全基因表达载体共转染于HepG2细胞，通过Southernblot和酶联免疫吸附法分别检测HBV DNA复制中间体和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）水平，来观察shRNA抗HBV复制与表达的效率。结果 发现针对HBV不同靶区shRNA均有抗HBV复制和表达效果，以P1、S2、C2、S1和X抑制HBV DNA复制效率较高，P1的抑制率高达95％。HBsAg表达受抑制情况与HBV DNA复制受抑制的程度相似，其中C2、C1和S2对HBsAg的抑制作用较强。结论 针对HBV四个开放性读码框进行RNA干扰对HBV复制和抗原表达均有抑制作用，其中P1和C2分别对HBV复制和表达的抑制效率较高。     

小鼠主动脉内皮细胞MEF2A RNA干扰对PAI-1表达的影响

【】目的：观察MEF2A RNA干扰对小鼠主动脉内皮细胞MEF2A表达的影响及纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的影响。方法：构建MEF 2A RNA干扰慢病毒或者阴性对照慢病毒(NC),对小鼠主动脉内皮细胞转染NC慢病毒,应用ELISA和逆转录-聚合酶链反应检测MEF2A及PAI-1表达的变化。结果：1.MEF 2A RNA干扰可明显降低MEF2A活性及其mRNA表达,且其作用呈剂量依赖性。2.慢病毒介导的MEF2A RNA干扰可明显促进小鼠主动脉内皮细胞PAI-1的活性及其mRNA表达。结论：慢病毒介导的MEF2A RNA干扰可明显抑制小鼠主动脉内皮细胞MEF 2A的表达,并促进血管内PAI-1的高表达。     

RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的体外影响

目的:通过一种能够在细胞内表达短发卡RNA的逆转录病毒载体来研究RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的影响.方法:首先针对HBV基因组Pol基因RT区寻找RNAi的靶位,并设计相对应的寡核苷酸链.然后再将一对碱基配对寡核苷酸链退火后连接入载体形成重组的质粒,并进行鉴定.在Huh-7细胞中,将通过鉴定的干扰质粒与HBV复制型质粒pHBV3.8共转染,分别应用ELISA方法来检测HBV相关的抗原,应用Northern印迹检测HBV RNA,以及应用实时荧光定量PCR和Southern印迹检测HBV核心颗粒DNA.结果:研究通过计算机方法协助寻找了3条RNAi靶位,并且构建了相应的基于逆转录病毒载体的RNA干扰质粒154i、312i和734i.结果发现312i对pHBV3.8表达有明显的抑制,HBsAg和HBeAg分别为阴性对照组的39%和41%,差异均有显著性(P=0.001,P=0.000).定量荧光PCR结果显示312i组核心颗粒DNA水平显著低于阴性对照组(21.3%±1.1%vs 100.0%±10.6%,P=0.0046).Southern blot和Northern blot结果均显示,312i组病毒复制及mRNA转录水平最低(10.5%,12.0%).结论:在HBV基因组RT区找到了一个可用于RNAi的靶位,并且构建了相对应的干扰质粒,此质粒可成功地抑制HBV复制型质粒在细胞中的复制和表达.     

RNA干扰在动物体内抗乙型肝炎病毒的效果

目的以乙型肝炎病毒(HBV)C区为靶位,动物实验体内观察RNA干扰抗HBV的效果。方法以流体动力学法建立HBV感染的动物模型,将pcDNA 3．1-HBV和体外细胞实验证明有效的小干扰 RNA(siRNA)尾静脉共注射BALB／c小鼠;用时间分辨免疫荧光分析法检测小鼠血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平,用荧光定量聚合酶链反应法检测血清HBV DNA水平,用逆转录聚合酶链反应法检测 HBV C-mRNA,用免疫组织化学法检测肝组织HBsAg和乙型肝炎核心抗原。结果在小鼠体内,siRNA 能有效抑制HBV的复制和表达,干扰效果至少持续3 d。结论靶向HBV C区的siRNA在动物体内能有效抗HBV。     

Suppression of growth of pancreatic cancer cell and expression of vascular endothelial growth factor by gene silencing with RNA interference

OBJECTIVE: To explore the anti‐angiogenesis and tumor cell growth suppressive effects resulted from gene silencing by RNAi in BxPC‐3 human pancreatic cancer cells. METHODS: The designation and transfection of vascular endothelial growth factor (VEGF)‐siRNA lentivirus was carried out in vitro. Real‐time PCR and western blot were conducted to measure the expression levels of VEGF mRNA and protein. Flow cytometry was employed to evaluate cell apoptosis and cell death. A lactate dehydrogenase (LDH) assay was used to assess the cytotoxicity of VEGF‐siRNA. A 3‐(4, 5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐2, 5‐diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to picture the cellular growth. For the in vivo study, BxPC‐3 cells were injected subcutaneously into nude mice to form xenografts. The mice were divided into three groups according to the intervention used. The control group, the negative control group and the knockdown group of mice were injected with saline, an empty lentivirus vehicle and lentivirus carrying VEGF‐siRNA, respectively. None of the mice died during the study. When these mice were killed, the xenografts were collected and the tumor sizes of the different groups were compared. Finally, immunohistochemistry was used to assess the VEGF expression level and microvascular density. RESULTS: After the transfection of VEGF‐siRNA lentivirus, the cellular expression of VEGF mRNA decreased to 50% of the control and the VEGF protein in the BxPC‐3 cells decreased to 30% of the control. Apoptosis and cell death increased after transfection of the VEGF‐siRNA lentivirus. The LDH assay showed high cytotoxicity induced by VEGF‐siRNA lentivirus transfection. The MTT assay showed slower cellular growth in the knockdown cells. Tumor growth suppression was observed in nude mice that had received the VEGF‐siRNA lentivirus transfection, and the tumor sizes of the xenografts in this group were clearly smaller than those in other two groups. VEGF expression and microvascular density were significantly decreased. CONCLUSION: Vascular endothelial growth factor gene silencing via VEGF‐siRNA can effectively inhibit the production of VEGF and exert an anti‐angiogenesis and tumor cell growth suppressive effect both in vitro and in vivo.     

反义内皮素转换酶核酸对尘螨过敏哮喘患者外周血单个核细胞释放白细胞介素5的抑制作用

目的　探讨转导反义内皮素转换酶 (ECE)核酸的气道上皮细胞对尘螨过敏性患者外周血单个核细胞释放Th1/Th2相关细胞因子的影响。方法　尘螨过敏患者 2 1例 ,分离其外周血单个核细胞 (PBMC) ,根据实验要求分为 :未刺激组 (A组 )、反义ECE上皮细胞 +PBMCs组 (A1组 )、对照组上皮细胞 +PBMCs组 (A2 组 )及螨刺激组 (B组 )、反义ECE上皮细胞 +PBMCs+尘螨提取液组 (B1组 )、对照组上皮细胞 +PBMCs+尘螨提取液组 (B2 组 ) ,共培养 72h ,螨刺激组同时加入尘螨提取液 2 0 μg/ml。培养上清用酶联免疫吸附 (ELISA)法检测白细胞介素 5 (IL 5 )、γ干扰素 (IFN γ)。结果2 1例患者中有 12例患者经尘螨刺激后IL 5释放明显增加。将 12例患者进行统计学分析发现 ,未经尘螨刺激时 ,A1组IL 5和IFN γ水平分别为 [(6 0± 1 3)× 10 -9g/L]和 [(6 3± 2 6 )× 10 -9g/L],A2 组为 [(7 5± 1 1)× 10 -9g/L]、[(70± 5 2 )× 10 -9g/L],两组比较差异均无显著性 (P >0 0 5 ) ;尘螨刺激后 ,B1组的IL 5水平和IFN γ分别为 [(8 2± 1 6 )× 10 -9g/L]、[(10 0± 4 1)× 10 -9g/L],B2 组分别为[(12 0± 1 8)× 10 -9g/L]、[(15 3± 71)× 10 -9g/L],两组IL 5比较差异有显著性 (P =0 0 4 7) ,而IFN γ水平比较差异无显著性 (P >     

应用RNA干扰沉默血管内皮生长因子基因抑制HCT116细胞增殖的实验研究

目的:观察Pavu6 27-VEGFsiRNA重组体在细胞体内表达的血管内皮生长因子短发夹状RNA(shRNA)能否有效地抑制人大肠癌HCT116细胞株的增殖.方法:将自行构建的表达短发夹状RNA的重组质粒转染到大肠癌HCT116细胞株中,以空质粒Pavu6 27转染为对照,经G418筛选,流式细胞技术分析细胞周期分布,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果:Pavu6 27-VEGFsiRNA重组体能有效地抑制HCT116细胞株的生长增殖,24、48、72h移植率分别为15.32±2.02%、28.54±3.29%、40.32±3.56%,与对照组(5.64±1.42%、8.65±2.30%、15.32±3.52%)相比有显著差异(P<0.05).细胞周期中G0/G1比例升高,S期比例明显下降,而空质粒Pavu6 27转染对HCT116细胞株增殖无抑制作用,对细胞周期改变无影响.结论:Pavu6 27-VEGFsiRNA重组体在细胞内表达的短发夹状RNA能有效抑制人大肠癌细胞的增殖,为质粒介导的RNAi技术运用于大肠癌的基因治疗提供一定的实验依据.