睾丸生精细胞完全体外成熟培养的研究

目的在动物实验研究的基础上对人类睾丸生精细胞在体外培养分化、成熟进行初步探索,为临床治疗无精子症奠定基础.方法将14例患者的睾丸组织分离成生精细胞混悬液,采用生精细胞与支持细胞共培养或分选出初级精母细胞和精子细胞培养,观察培养前后各级生精细胞的分化或成熟情况.结果14例患者睾丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化和成熟.初级精母细胞能分化为精子细胞,分化率平均为4.54%～6.51%;Sa期精子细胞能变形、成熟为Sc期精子细胞,成熟率为3.13%～5.74%.结论人类生精细胞经体外培养能进一步分化、成熟.初级精母细胞能分化为早期精子细胞,Sa期精子细胞可变形为更成熟形式的Sc期精子细胞.甚至可以通过使用被拉长的精细胞或圆形细胞进行显微受精,以达到妊娠的目的.     

人类睾丸生精细胞体外培养的初步研究

目的对人类生精细胞体外培养分化、成熟进行初步研究。方法将4例患者的睾丸组织制备成生精细胞，观察生精细胞体外培养后生精细胞的分化、成熟情况。结果4例患者睾丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化、成熟。初级精母细胞能分化为精子细胞，分化率平均为0．47％～1．50％；Sa期精子细胞能变形、成熟为Sc期精子细胞，成熟率为0．93％～5．72％。结论在该研究条件下，人类睾丸生精细胞体外培养能进一步分化、成熟。     

Sertoli细胞的培养及其对生精细胞支持作用的研究

本文培养幼龄大鼠Sertoli细胞,培养1周细胞纯度达95％以上,3周细胞仍保持止常形态。生精细胞和Sertoli细胞混合培养及Sertoli细胞条件培养液培养生精细胞,结果表明Sertoli细胞可通过和生精细胞在接接触及分泌调节物质对生精细胞的体外存活、增殖、分化等起着支持作用。     

BrdU标记在大鼠生精细胞体外培养中的应用

目的探讨应用5-溴-2-脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxy-uridine，Brdu）标记检测大鼠生精细胞体外的分化、发育情况。方法采用BtdU体内标记生精细胞的DNA，免疫细胞化学法跟踪观察大鼠生精细胞在体外培养中的分化、发育情况。结果培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞。经培养后在BrdU标记的细胞中出现早期精子细胞。结论大鼠生精细胞体外培养过程中，应用BrdU标记能检测生精细胞的分化、发育情况。     

哺乳动物睾丸生精细胞的体外培养

哺乳动物精子发生是一个十分复杂的过程,影响因素众多,体外培养生精细胞一般有组织培养和细胞培养两类方法,目前,已有生精细胞成功地在体外从细线期精母细胞经2次减数分裂分化为精子细胞的报道,但 精原细胞的分化和精子细胞的成熟仍是两个难点,建立生精细胞体外培养模型有助于研究精子发生的调控机制,可用于辅助生育技术,治疗精子发生阻滞的患者,对精子发生机制的进一步阐明,也会促进生精细胞体外培养研究的发展。     

睾丸Sertoli细胞与精子发生调控

哺乳动物精子发生是一个高度有序的细胞发育和分化过程.睾丸Sertoli细胞为唯一与生精细胞接触的体细胞,以其独特的结构和功能为精子发生提供适宜的微环境,对生精过程起至关重要的调控作用.本文从Sertoli细胞结构、Sertoli细胞与精子发生的内分泌、旁分泌调控、Sertoli对生精细胞的营养支持及Sertoli细胞和生精细胞体外培养等方面,就睾丸Sertoli细胞对精子发生过程的调控作用如下综述.     

实验性隐睾术后大白鼠生精上皮的反应性变化——一,光镜下形态学观察

本文报道人工隐睾术后雄性成年大白鼠生精上皮的组织学变化。术后1—10天,曲细精管界膜呈波纹状收缩、增厚和断裂。支持细胞发生空泡样变。各级生精细胞的增生、分化失调、排列紊乱、游离和逐渐退化,出现双核和多核细胞。术后15—30天,上皮中只剩支持细胞和精原细胞,其它生精细胞逐渐消失。术后40—70天,形态学变化处于相对稳定状态。本文提出了实验性隐睾术后,引起生精上皮的原发性和继发性变化,生精上皮各种细胞对腹温的敏感性和耐受性的差异,初步讨论了多核细胞形成机理及生物学意义。     

生精细胞的体外培养

目的：在体外培养中,观察精原细胞的增殖、分化和形态变化规律。方法：用胶原酶、透明质酸酶和胰蛋白酶分次消化法制取睾丸组织的细胞悬液．密度梯度离心法富集生精细胞,贴壁培养后观察生精细胞的存活、分裂和形态变化,并行Annexin V—FITC／PI染色,采用激光共聚焦扫描显微镜检测细胞的凋亡情况。结果：睾丸组织细胞悬液中的体细胞在培养中较早贴壁,胞质形成多个突起;精原细胞贴壁较迟．贴壁后呈规则的圆形或卵圆形,以链状或团块状位于体细胞层之上,细胞分裂不完全,相互间以细胞间桥相连。Annexin V—FITC／PI染色显示,培养第2天时精原细胞已出现凋亡,但数量极少,后逐渐增多。结论：在本实验所提供的体外培养条件下,精原细胞能够存活并发生贴壁、分裂、分化等行为,但同时也有细胞凋亡。     

显示分化阶段不同的细胞的荧光染色法

荧光染色法是一种敏感的细胞化学染色法,它可以反映出细胞内生物化学成分的微小变化。硫代黄素作为一种荧光染料配制的7690—Xu荧光染液可以使处于分化阶段不同的细胞呈现异质性荧光。分化程度低的幼稚细胞呈蓝色荧光,分化程度越低,蓝色荧光越深。随着细胞的分化,细胞的蓝色荧光逐渐向光谱的红色光侧偏移。细胞质蓝色荧光逐渐变为淡蓝色、淡蓝绿色,最后呈黄色;细胞核蓝色荧光亦经灰蓝色变为桔黄～桔红色。分化程度高的各种器官的细胞,其胞质均为黄色,核呈桔黄或桔红色。 有机体内的一些细胞,如淋巴细胞、巨噬细胞,各级生精细胞和癌变细胞等,是处于分化阶段不同的细胞,经7690—Xu荧光染液染色后,可呈     

大鼠睾丸生精细胞共培养系统的建立

目的 建立生精细胞体外分化(如减数分裂、精子变态)培养体系,为研究精子发生中各种调控因素的作用提供一个良好的细胞模型.方法 取20～22日龄的SD雄性大鼠睾丸,放在预冷的Hanks液中洗2次,用1 mg/mL胶原酶32 ℃消化15～20 min.然后将睾丸剪碎,重复用1 mg/mL胶原酶消化5～10 min.细胞用含10%胎牛血清及各种营养因子的HamF12/DMEM培养液悬浮,按约2×106 /cm2密度分别接种于双室培养槽(双室培养)或放有盖玻片的6孔板(单室培养)中,在32 ℃、95%空气、5%CO2条件下培养.每日在相差显微镜下观察共培养支持细胞/生精细胞的生长状态,定期进行苏木精-伊红染色、BrdU染色.结果 在双室培养2周后,部分生精细胞可见鞭毛出现,培养4周后,培养体系中仍有一定数量的生精细胞附着在支持细胞上,部分生精细胞上可见鞭毛.单室培养的生精细胞在培养第4～5天开始出现明显脱落,培养1周后大多数生精细胞发生脱落死亡,生精细胞上未见鞭毛出现,但在培养体系中可见次级精母细胞及精子细胞.结论 应用双室培养,生精细胞可存活达1月之久,而且部分生精细胞尾部出现鞭毛,从形态上发生了减数分裂及精子变态过程.     

高温对小鼠睾丸生精细胞凋亡影响的实验研究

目的　研究高温对睾丸生精细胞凋亡的影响。方法　选用昆明系雄性小鼠 2 0只 ,随机分为高温组和对照组 ,采用核固红 -结晶紫染色法 ,观察睾丸生精细胞凋亡数目的变化。结果　高温组睾丸生精细胞凋亡的数目 (2 8.2± 3.0 3No ./10个曲细精管切面 )较对照组的凋亡细胞数目 (6 .38± 1.4 1No ./10个曲细精管切面 )明显增多 (P <0 .0 1)。结论　高温可触发生精细胞的细胞凋亡数目增加 ,造成生精能力丧失。     

大鼠生精细胞体外培养条件的研究

目的:寻找一个最适合生精细胞体外培养的培养体系,为进一步培养人类生精细胞提供技术基础.方法:用单一酶-研磨-Percoll法制备15 d龄雄性大鼠生精细胞混悬液用于体外培养.①设计两种不同的培养条件:DMEM/F12和改良人类输卵管液(HTF)作为基础培养液,分为两组.每组根据添加不同浓度的激素分为6小组.添加的睾酮(T)和FSH浓度分别为:对照组H0(T 1 μmol/L,FSH 0 IU/L)、H1组(T 1 μmol/L,FSH 10 IU/L)、 H2组(T 1 μmol/L,FSH 25 IU/L)、H3组(T 1 μmol/L,FSH 50 IU/L)、H4组(T 1 μmol/L,FSH 100 IU/L)、H5组(T 0 μmol/L,FSH 50 IU/L). ②通过BRDU标记和流式细胞仪检测所有实验的生精细胞倍体的变化来判断其发育,进一步确认本研究使用培养条件的可靠性.结果:在生精细胞与支持细胞共培养过程中以改良人类输卵管液作为基础培养液,添加T 1 μmol/L ,FSH 50 IU/L或100 IU/L都适宜生精细胞体外培养;另通过BRDU标记及流式细胞仪检测均表明,在本研究条件下体外培养生精细胞能从初级精母细胞阶段分化到精子细胞阶段.结论:改良人类输卵管液作为基础培养液,添加浓度为50 IU/L或100 IU/L的FSH及T 1 μmol/L,最适合生精细胞的体外成熟培养.     

GDNF干预对化疗致精原干细胞耗竭小鼠生精细胞恢复效果的研究

目的：研究外源胶质细胞源性神经营养因子（ glialcell line - derived neurotrphic factor, GDNF）对化疗致不育小鼠生精细胞的恢复效果,明确GDNF促进在体精原干细胞再生的效果。方法：4周龄雄性C57小鼠腹腔注射白消安（30mg／kg）,注射后4周按601．Lg／kg体重剂量腹腔注射GDNF进行干预,每天一次连续注射7d。在干预后第4周收集睾丸,检测睾丸重量、通过HE染色检测生精小管中生殖细胞恢复情况;通过RT—PCR检测GDNF和SCF基因表达评价GDNF注射对小鼠精原干细胞微环境的影响。结果：在GDNF干预后第4周,睾丸重量明显得到恢复,生精小管中上皮细胞数量明显得到恢复,精原干细胞微环境中再生因子GDNF和分化因子SCF表达水平稳定。结论：GDNF干预可以促进化疗致精原干细胞耗竭小鼠睾丸中生精细胞数量明显恢复,且维持了精原干细胞微环境中再生分化调控的平衡关系。     

实验性大鼠隐睾中eNOS的表达与生精细胞凋亡

①目的 研究内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的表达与实验性大鼠隐睾生精细胞凋亡的关系.②方法 通过手术建立单侧大鼠隐睾模型,术后第7天采用TUNEL法检测生精细胞凋亡,免疫组化SABC法及RT-PCR检测隐睾及对侧睾丸eNOS基因表达的变化.③结果 术后第7天隐睾侧重量明显减轻,生精细胞凋亡指数较对侧睾丸明显增加;RT-PCR显示隐睾中eNOS mRNA的表达较对侧睾丸增强;免疫组化显示对侧睾丸生精上皮内未见eNOS表达,隐睾侧睾丸生精上皮中有eNOS表达.④结论 隐睾生精细胞凋亡明显增加,eNOS参与介导生精细胞凋亡.     

小鼠生精细胞体外长期培养及超微结构分析

目的初步探讨新生小鼠睾丸组织中生精细胞在体外培养条件下的增殖分化条件,建立有效的生精细胞体外成熟模型。方法用酶法和Percoll不连续密度梯度法分离纯化新生小鼠睾丸生精细胞,获取富精原细胞层,采用自制小鼠睾丸组织培养液对分离纯化后的细胞进行体外培养。用电子显微镜观察培养的细胞超微结构。结果新生小鼠生精细胞在用成年小鼠睾丸组织提取液配制的培养基中存活达194d。电子显微镜观察可见,培养后的细胞中含有精子细胞顶体样结构。结论采用小鼠睾丸组织制备的培养液培养的小鼠生精细胞可体外长期培养并显示出一定的分化趋势。     

肾阳虚大鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因的表达

目的:观察肾阳虚大鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因bcl-2和bax表达的变化.方法:选用雄性SD大鼠,每日用腺嘌呤(200mg/kg)灌胃,连续30天,造成肾阳虚生精障碍模型大鼠.采用免疫组织化学方法观察bcl-2和bax的表达情况.结果:与正常大鼠比较,模型大鼠睾丸生精细胞bcl-2的表达显著下降、bax的表达显著增高(P＜0.05).结论:睾丸生精细胞凋亡相关基因bcl-2和bax表达的改变可能是肾阳虚大鼠生精障碍的原因之一.     

小鼠生后不同发育阶段睾丸生殖细胞的超微结构研究

目的:研究生精细胞、支持细胞、睾丸间质细胞在生后不同发育阶段的超微结构特点,了解雄性生殖细胞发育、分化和成熟的过程,亲代细胞与子代细胞间及3种生殖细胞在发育过程中的相互影响关系.方法:分别取生后5天、10天、20天雄性小鼠睾丸,固定后作超薄切片,染色后透射电镜下观察并拍片记录.结果:生精小管的细胞组合在不同发育阶段表现不同.生后5天,小管管腔很小,管壁细胞排列呈单层,细胞类型仅有精原细胞和幼稚的支持细胞两种,且均于基膜相贴,睾丸间质细胞不可见.生后10天,小管管腔增大,细胞排列呈2～3层,精原细胞增殖分化,支持细胞、睾丸间质开始发育.生后20天,细胞层数增多,出现各级生精细胞,增殖的子代细胞分布于近腔面,可见胞质间桥和变态发育中的精子;支持细胞、间质细胞发育成熟.结论:生精细胞在生精小管中的分布具有规律性,不同发育阶段表现出不同的细胞组合.在发育过程中,间质细胞、支持细胞的结构和功能的成熟先于生精细胞的分化,表明生精细胞的发育分化受间质细胞、支持细胞及基膜的共同参与下完成的.     

生精细胞凋亡与P53

精子发生始于精原细胞的克隆扩增,经细胞的分化、有丝分裂、减数分裂、变态,最终形成精子.精子发生受到许多因素的调节,其中最主要受激素控制,促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinising hormone,LH)、雄激素等是生精细胞的存活因子[1].细胞内分子对精子发生的调节也不容忽视,如cAMP反应元素调节子(cyclin AMP-responsive element modulator,CREM)在减数分裂后精子细胞中高表达,是一种转录因子,CREM基因突变致精子缺失可引起不育;c-myc基因可促进生精细胞的凋亡.生精细胞的存亡还与周围的支持细胞以及间质细胞所形成的微环境有关[2].各种生长因子对精子发生也有直接或间接的调节作用,如表皮生长因子(epidermalgrowth factor,EGF)、转化生长因子(transforming growth factor,TGF),胰岛素样生长因子( insulin-like growth factor,IGF)等.在精子发生过程中,各级生精细胞都会发生凋亡.在生理条件下,凋亡是机体清除过量或异常生精细胞的一种方式.     

棉酚对小鼠睾丸生精细胞凋亡影响的实验研究

目的　研究棉酚对小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响。方法　选昆明种雄性小鼠 2 0只 ,随机分成对照组和服棉酚组 ,采用核固红—结晶紫染色法 ,对比观察小鼠睾丸生精细胞凋亡数目的变化。结果　服棉酚组小鼠睾丸生精细胞凋亡的数目 (3 0 .5 7± 3 .0 3 )较对照组 (6.3 8± 1 .41 )明显增多 (P <0 .0 1 )。结论　棉酚可促使小鼠睾丸生精细胞的凋亡数目增加 ,造成睾丸生精功能受损     

大鼠睾丸支持细胞、生精细胞及管周细胞的体外团聚研究

用5、10、15、20和25天龄大鼠睾丸曲细精管分离细胞制成悬液,在体外经固体琼脂培养和旋转培养,得到圆球状和索状细胞团聚体,其主要由支持细胞组成,管周细胞包绕在支持细胞外周。10天龄以前组,在团聚体中可见到部分生精细胞,15天龄以后组的生精细胞全部位于团聚体外.表明新生大鼠睾丸支持细胞、管周细胞及生精细胞间仍保留着部分胚胎期的识别和选择性粘附能力。