注射用人组织尿激酶型纤溶酶原激活剂质量标准研究

目的:建立注射用人组织尿激酶型纤溶酶原激活剂(HTUPA)的质控方法和质量标准。方法:以纤维蛋白平板法测定HTUPA 的生物学活性,还原型 SDS-PAGE 确定相对分子质量,SDS-PAGE 和反相高效液相色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,用胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按2005年版中国药典三部规定进行。结果:用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组 DNA 制品质量控制技术指导原则》和2005年版中国药典三部的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于注射用人组织尿激酶型纤溶酶原激活剂产品的常规检定。     

重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白(rhG-CSF-Fc)的质量研究

目的:建立重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准。方法:采用NSF-60细胞增殖法测定生物学活性;非还原SDS-PAGE电泳和RP-HPLC测定纯度;以ELISA法分别测定残留CHO细胞蛋白和蛋白A;其余检测项目按中国药典2010年版三部规定进行。结果:用建立的方法对重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和中国药典2010年版三部的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。     

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白质量标准研究

目的:建立重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(TNHH)的质控方法和质量标准.方法:采用抗凝血酶活性试验和抗白细胞黏附试验测定活性;通过胰蛋白酶消化分析该蛋白还原型肽图;利用RP-HPLC法和SEC-HPLC法分别测定有关物质和高分子蛋白质含量;其余检测项目均按<中华人民共和国药典)2005版三部相关规定进行.结果:用建立的方法分别对一批TNHH原液和成品进行了检定,各项指标均符合<入用重组DNA制品质量控制技术指导原则>和现版<中华人民共和国药典>的要求.结论:建立的质控方法可有效地控制TNHH产品质量,并可用于TNHH原液及成品的常规检定.     

重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX的质量研究重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX的质量研究

目的研究并建立重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX(recombinant adeno-associated virus type 2/human blood coagulation factor IX,rAAV-2/hFIX)的质量标准。方法采用PCR法确认病毒所携带的重组核酸结构和测定辅助病毒(helper virus)和野生型腺相关病毒（wtAAV）的残留片段。SDS-PAGE电泳测定病毒外壳蛋白分子量及纯度，TSK gel SP-NPR阳离子交换柱系统测定病毒颗粒纯度。以斑点杂交法测定病毒颗粒数。一期法于IX因子基因剔除小鼠体内测定rAAV-2/hFIX生物学活性，并通过ELISA法测定感染BHK-21细胞后hFIX的表达量。结果PCR法确证病毒的重组核酸结构与构建预期相同；在1×10⁷ VG的rAAV-2/hFIX颗粒中，残留辅助病毒的基因片段数少于1个拷贝；在1×10⁸ VG的rAAV-2/hFIX颗粒中，野生型AAV-2基因片段数少于1个拷贝。病毒颗粒及外壳蛋白纯度均大于98%，病毒颗粒数大于1.0×10₁₅VG·L^-1(virus genome·L^-1)。IX因子剔除小鼠肌肉注射病毒后21 d，小鼠血液中人凝血因子IX活性达到大于正常人因子IX活性的15%，IX因子的体外表达水平大于20.0 μg·L^-1。其他各项检测指标均符合规定。结论建立了rAAV-2/hFIX的质量标准，用于控制产品质量。     

重组人源化兔抗VEGF单克隆抗体质控方法与质量标准研究

目的:建立重组人源化兔抗VEGF单抗的质控方法和质量标准。方法:利用HUVEC细胞增殖抑制试验测定重组人源化兔抗VEGF单抗的生物学活性;SDS-PAGE和SEC-HPLC测定纯度;胰酶酶切,HPLC测定其肽图;实时定量PCR检测CHO宿主DNA残留量;采用ELISA法分别测定VEGF结合力、残留ProA含量和残留菌体蛋白含量;水平等电聚焦电泳法测定等电点;其余检测项目按中国药典2010年版三部规定进行。结果:用建立的方法对重组人源化兔抗VEGF单抗的原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》、《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》和中国药典2010年版三部的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。     

重组人脑利钠肽质量标准与检定方法研究

目的：建立重组人脑利钠肽（rhBNP)质量标准与检定方法，用于该产品的质量控制。方法：用离体动脉条测定法测定rhBNP的生物活性；用反相HPLC和SDS-PAGE分析蛋白纯度；用肽图，免疫印迹及N-端氨基酸序列测定分析。鉴定产品特性；用固相斑点杂交法测定残余外源DNA含量；用ELISA测定残余工程菌蛋白含量；用《中国生物制品规程》的方法对rhBNP成品进行无菌，热原，细菌内毒素和异常毒性等常规试验等。结果：用建立的方法对连续3批rhBNP原液和成品进行检定，结果各项指标均符合《重组DNA制品质量控制要点》和《中国生物制品规程》的要求。结论：建立的rhBNP质量标准与检定方法，具有保证产品安全，有效，质量可控等特点，可用于该产品的常规检定。     

N-辛基-O-硫酸酯基壳聚糖质量分析

目的:建立N-辛基-O-硫酸酯基壳聚糖质量分析方法。方法:采用高效凝胶色谱法测定分子质量,湿法消化后重量法测定磺化度(总硫酸根含量),EDTA返滴定法测定游离硫酸根。结果:3批样品重均分子质量分别为9.7×105,8.9×105,7.4×105;数均分子质量分别为2.0×105,1.8×105,1.6×105;总硫酸根含量约为32%;游离硫酸根含量均小于1%。结论:质量分析指标适宜,结果准确,适用于N-辛基-O-硫酸酯基壳聚糖的质量控制。     

重组人血小板衍生生长因子（rhPDGF—BB）质控方法和质量标准的研究

目的：建立重组人血小板衍生生长因子(rhPDGF—BB)的质控方法和质量标准。方法：以BALB／C 3T3细胞增殖实验及MTT染色法测定rhPDGF—BB的生物学活性，还原型SDS—PAGE确定B链分子量，SDS—PAGE和反相高效液相色谱测定纯度，毛细管电泳法测定等电点，用胰蛋白酶酶切后分析肽图，其余检测项目按《中国生物制品规程》2000版规定进行。结果：用建立的方法对连续3批rhPDGF—BB原液和成品进行了检定，各项指标均符合《重组DNA制品质量控制要点》和《中国生物制品规程》的要求。结论：建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点，可用于重组人血小板衍生生长因子产品的常规检定。     

重组人白介素12质量标准与检测方法研究

目的：建立白介素12的质量标准与检测方法，用于该产品的质量控制。方法：采用诱导PBMC生成IFN-γ的方法测定生物学活性；用胰酶酶解分析肽图；用分子排阻HPLC、离子交换HPLC和SDS-PAGE法分析蛋白纯度；免疫印迹及N端氨基酸序列测定分析、鉴定产品特性。按照《中国药典》三部2005年版的有关规定进行了其他项目检查。结果：用建立的方法对重组人白介素12成品及原液进行检定，结果各项指标均符合《中国药典》的要求。结论：建立了重组人白介素12的质量标准，并可有效地控制制品的质量。     

重组腺病毒人白细胞介素2的质量分析

目的通过对重组腺病毒人白细胞介素2(Adv-IL2)的质量研究和实验方法参数的选择,建立Adv-IL2的质量控制标准。方法选用CPE法测定病毒滴度;将病毒转染Hela细胞,表达出IL-2,分别用MTT法和ELISA法测定IL-2的活性和表达量。建立了UV和IE-HPLC系统分析纯度;琼脂糖凝胶电泳检查基因组分子量和基因组酶切图谱;PCR法鉴定病毒特征基因E2B区、IL-2表达基因盒和外源因子(复制型病毒RCV,HIV,HBV和HCV);按照《中国生物制品规程》的有关规定进行了其他项目检查。结果测定的重组腺病毒人白细胞介素2原液滴度达3×10¹⁰ pfu·mL^-1。IL-2表达活性达700 U·mL^-1,表达量约25 ng·mL^-1。制品的A_{260 nm}/A_{280 nm}为1.23;IE-HPLC纯度检查大于98%。基因组分子量和基因组酶切图谱以及病毒特征基因E2B区和IL-2表达基因检查结果均在理论值范围;复制型病毒RCV,HIV,HBV和HCV检测均呈阴性;其他项目均符合规定。结论建立了重组腺病毒人白细胞介素2的质量标准,并可有效地控制制品的质量。     

聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的质量标准和质控方法研究

目的:建立聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的质量标准和质控方法.方法:采用荧光分光光度法测定PEG-rhG-CSF的PEG化率,RP-HPLC方法蒸发光检测器检测游离PEG残留量,胰蛋白酶裂解进行肽图分析,其它指标按照<中国生物制品规程>进行.结果:建立了聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的质控方法和质量标准.结论:建立的方法和质量标准已用于聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子产品的检定.     

重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白质控方法和标准的研究

目的建立重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白质控方法和质量标准。方法用中和TNF-α生物学活性的方法测定重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白效价,用胰蛋白酶酶切分析肽图,用ELISA方法分别测定蛋白A、残留宿主细胞蛋白残留量和重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白含量。结果建立了重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的生物学活性、肽图分析、残留蛋白A等质控方法和质量标准。结论建立的方法和质量标准已用于重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白产品的检定。     

重组人血管内皮抑制素冻干粉针剂的研制和质量评价

目的研究重组人血管内皮抑制素(endostar)冻干粉针剂的制备和质量控制。方法以4%甘露醇、2%蔗糖、30mm乙酸钠为辅料,将endostar制备成冻干粉针剂。分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和高效液相法(HPLC)分析冻干粉的纯度,使用人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)分析冻干粉的活性,其他检测项目按照《中国药典》进行。结果 Endostar冻干粉的纯度大于99%,生物学活性每支含量2.4×105U,等电点主区带在8.8～9.8之间,冻干粉用胰蛋白酶消化后,肽图与理化对照品一致。结论按照此工艺制备的endostar冻干粉针剂各项指标均符合《中国药典》要求。     

肿瘤治疗性多肽疫苗——重组人纽表位肽12质控方法的研究

目的建立重组人纽表位肽12质控方法和检定规程。方法采用FVB/N转neu基因小鼠,以ELISA法检测给药后小鼠的抗体阳转百分率评价其生物学活性,用胃蛋白酶酶切分析肽图,用SEC-HPLC法测定抗原含量。结果与结论建立了重组人纽表位肽12的生物学活性、肽图分析、抗原含量测定等质控方法及检定规程,并已用于重组人纽表位肽12产品的检定。     

乳化溶剂挥发法制备重组人血管内皮抑制素缓释微球

目的:制备重组人血管内皮抑制素(恩度)缓释微球,并对微球理化性质及体外释放行为进行初步考察。方法:采用乳化溶剂挥发法(W/O/O)制备恩度载药微球;对微球载药量、粒径、突释、体外释放速率及降解行为进行考察,同时利用凝胶电泳初步评价体外释放过程中恩度的完整性。结果:增加聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物(PLGA)中羟基乙酸的比例、提高PLGA浓度、降低内水相体积、提高理论载药量均增加微球载药能力;降低内水相体积、提高分散速度均减小突释。增加PLGA中羟基乙酸的比例,30 d时累积释放可增加到65%。降解实验说明释放初期微球主要以扩散方式释放恩度,释放后期主要表现为微球的降解。凝胶电泳结果表明微球制备过程对蛋白质聚集性的影响不大。结论:用PLGA作为载体材料制备微球,可以延缓恩度的释放。     

Quality aspects of fibrinolytic agents based on biochemical characterization.

The purity, composition and in vitro fibrinolytic activity of four commercially available fibrinolytic agents, alteplase (recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA, Actilyse; CAS 105857-23-6), streptokinase, urokinase and anistreplase (ansioyl-plasminogen-streptokinase activator-complex, APSAC), have been compared in this investigation. The fibrinolytic activity was measured in an in vitro thrombolytic assay. In this assay a human blood thrombus is dissolved in an environment of human plasma. This assay is representative for the in vivo situation, where plasminogen activation is also a limiting step in thrombolysis. In the in vitro thrombolytic assay alteplase is about 10 times more effective in clot lysis than either streptokinase or urokinase and more than 300 times more active than anistreplase. In addition, the ratio of active ingredient to total protein content in the preparations was analysed by RP-HPLC, SDS-PAGE, GPC-HPLC and amino acid analysis. The portion of active ingredient per total protein was 99.9% for alteplase, 55% for anistreplase, 20% for urokinase and 1% for streptokinase. This demonstrates that alteplase is the only fibrinolytic agent tested which is essentially free of protein additives of human origine and potential contaminants associated therewith. The superior purity of alteplase compared to the other fibrinolytics was confirmed by SDS-PAGE, RP-HPLC, and HPLC-GPC. Significant levels of aggregates were detected in streptokinase and urokinase preparations, whereas alteplase and anistreplase were essentially free of aggregates. These data demonstrate that there are significant differences in composition, purity and in vitro activity between different fibrinolytic agents.     

重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的制备

目的 以壳聚糖(CS)为载体,研究其对重组人血管内皮抑制素(Endostar)的包封及控释能力.方法采用大分子复合法制备纳米粒,考察形成条件及冻干工艺,并对纳米粒的形态、包封率、体外释放及Endostar的完整性进行考察.结果CS与羧甲基纤维素钠( CMC - Na)的质量比介于6∶1～1∶2时可以形成纳米粒,粒径为1...