氢化可的松抑制人中性粒细胞与滑膜细胞粘附机理研究

目的研究氢化可的松对正常人中性粒细胞(PMN)与滑膜细胞(HSC)粘附的作用及其机理.方法MTT比色法检测PMN与HSC的粘附,Cell-ELISA和RT-PCR法检测HSC粘附分子的表达,EMSA研究核转录因子NF-κB的活化.结果氢化可的松可显著抑制50U·mL^-1rhTNF-α与IL-1β刺激的HSC与PMN的粘附;显著抑制HSC表面VCAM-1的表达及VCAM-1mRNA表达,但对ICAM-1mRNA的表达无显著影响;同时对TNF-α诱导的NF-κB活化有显著抑制作用.结论氢化可的松显著抑制PMN与HSC的粘附,其作用机理可能是通过抑制NF-κB的活化,进而抑制滑膜细胞中VCAM-1mRNA及蛋白表达而实现的.     

獐牙菜苦苷的抗炎活性及其对NF-κB通路相关因子p65和IKK-α表达的影响

目的 观察獐牙菜苦苷（Swertiamarin）的抗炎活性以及对核转录因子-κB（NF-κB）通路的调控作用。方法 采用脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7构建体外炎症模型,CCK-8法观察獐牙菜苦苷对细胞活性的影响,ELISA法检测其对炎症相关因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）表达的影响,RT-PCR法测定其对NF-κB通路相关因子p65和IKK-α的mRNA表达的影响。结果 100 μg·mL^-1獐牙菜苦苷能降低细胞存活率,3.125~50 μg·mL^-1浓度对细胞存活率无影响;25~50 μg·mL^-1獐牙菜苦苷能降低炎症相关因子TNF-α及IL-6的释放;12.5~50 μg·mL^-1獐牙菜苦苷能抑制p65的mRNA表达,50 μg·mL^-1獐牙菜苦苷能抑制IKK-α的mRNA表达。结论 獐牙菜苦苷对LPS诱导的炎症模型中TNF-α、IL-6的生成具有抑制作用,其机制可能与抑制NF-κB通路相关因子p65、IKK-α的表达有关。     

美洛昔康抑制正常人中性粒细胞与滑膜细胞粘附的作用机理研究

目的研究美洛昔康对正常人中性粒细胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN)与滑膜细胞(human synovial cell,HSC)粘附的抑制作用及其作用机理。方法用MTT比色法检测PMN与HSC的粘附,分别用Cell-ELISA和RT-PCR法检测粘附分子ICAM-1和VCAM-1的蛋白及基因表达,用EMSA法检测NF-κB的活性。结果美洛昔康可显著的并以剂量依赖的方式抑制TNF-α(50 u·mL^-1)和IL-1β(50 u·mL^-1)作用12 h诱导的PMN与HSC粘附,其IC₅₀分别为3.38×10^-7和3.56×10^-6 mol·L^-1。进一步研究发现美洛昔康在1×10^-6～1×10^-5 mol·L^-1时还可在蛋白水平及mRNA水平抑制TNF-α(50 u·mL^-1)诱导的HSC细胞ICAM-1的表达,但对VCAM-1蛋白及mRNA表达均未见显著影响;同时美洛昔康还可显著抑制50 u·mL^-1 TNF-α诱导的NF-κB的活化。结论美洛昔康抑制NF-κB的活化,进而抑制ICAM-1的表达可能是其抑制PMN与HSC粘附的机制之一。     

银杏内酯B对脂多糖刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TNFα生成及大鼠胸腔多形核白细胞NF-κB活化的影响

目的研究银杏内酯B对脂多糖刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TNFα生成及大鼠胸腔多形核白细胞NF-κB活化的影响。方法用L929细胞结晶紫染色法检测TNFα的含量，用电泳迁移率改变检测法检测NF-κB的结合活性。结果1和10 μmol·L^-1银杏内酯B能够显著抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TNFα的生成，其IC₅₀为0.26 μmol·L^-1；1 mg·L^-1 LPS和1 nmol·L^-1 PAF均可活化大鼠胸腔多形核白细胞NF-κB；银杏内酯B能够抑制LPS或 PAF刺激的NF-κB活化。结论银杏内酯B能够抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TNFα生成及大鼠胸腔多形核白细胞NF-κB的活化。PAF参与LPS激活NF-κB的过程。     

肺热普清散对斑马鱼炎症模型的抗炎作用及机制研究

目的 探讨藏药肺热普清散对斑马鱼炎症模型的作用及机制。方法 挑选受精后 72 h 斑马鱼随机移入 24 孔板中,分为对照组、模型组和肺热普清散低、中、高质量浓度(3、10、30 mg·L^-1)组,对照组与模型组不加药,肺热普清散与斑马鱼共孵育 1 h 后,除对照组外,其余各组用 20 μmol·L^-1硫酸铜处理 2 h 制备炎症模型。在荧光显微镜下观察绿色荧光标记中性粒细胞的 Tg(Lyz:EGFP)系斑马鱼体内炎症细胞迁移情况;实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测野生型斑马鱼核因子κB2(NF-κB2)、白细胞介素(IL)-1b、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-8 mRNA 水平;Western blotting 实验检测野生型斑马鱼 NF-κB、TNF-α 蛋白表达水平;免疫荧光法检测各组鱼尾 NF-κB 表达。结果 对照组斑马鱼荧光细胞主要分布于头部和主动脉部,躯干部位主动脉以上荧光细胞稀少;模型组荧光细胞在各区域均增加,显示出炎症细胞向血管外迁移的明显趋势,躯干侧线以上荧光细胞计数较对照组显著增加(P<0.001);肺热普清散 10、30 mg·L^-1组躯干部荧光细胞计数与模型组比较显著降低(P<0.01、0.001)。与模型组比较,肺热普清散 3、10、30 mg·L^-1 组 IL-1b、TNF-α、IL-8 的 mRNA 水平显著下调(P<0.05、0.01),10、30 mg·L^-1 组 NF-κB2 mRNA 水平显著下调(P<0.01);10、30 mg·L^-1 组 NF-κB、TNF-α 蛋白表达水平显著降低(P<0.01、0.001)。免疫荧光结果显示,模型组躯干部位和鱼鳍 NF-κB 白色荧光点较对照组明显增加,经 10 mg·L^-1肺热普清散处理后的相同部位荧光点减少。结论 肺热普清散对硫酸铜诱导的斑马鱼炎症模型具有抗炎作用,机制与抑制 NF-κB、TNF-α 表达有关。     

西红花酸对乙醛诱导的肝星状细胞增殖和胶原合成的影响

目的:探讨西红花酸(Crocetin)对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖和胶原合成的影响及其作用机制.方法:培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,建立乙醛诱导的HSC纤维化模型;用不同浓度的西红花酸(10-6、10-7、10-8 mol/L)对乙醛刺激的HSC-T6进行处理,MTT法检测细胞增殖;羟脯氨酸测定检测HSC-T6胶原含量;流式细胞分析仪测定细胞凋亡;Western blot检测细胞ERK1/2、Bax、Bcl-2蛋白的表达;RT-PCR检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白、间质胶原酶(MMP-2)、组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的基因表达.结果:在一定浓度范围里,西红花酸能抑制乙醛引起的HSC增殖和胶原合成;西红花酸诱导乙醛刺激的HSC细胞凋亡;西红花酸能增加Bax蛋白表达,降低乙醛刺激升高的ERK1/2、Bcl-2蛋白表达;西红花酸能明显降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原、TIMP-1的表达,提高MMP-2的表达.结论:西红花酸通过抑制乙醛诱导的HSC增殖和胶原合成以及促进活化的HSC凋亡起到抗肝纤维化作用,其机制可能与ERK信号传导通路和对基质金属蛋白酶的调节有关.     

黄芪总苷对肝星状细胞增殖和合成胶原的抑制作用

目的　探讨黄芪总苷 (AST)对肝星状细胞增殖和合成胶原的影响。方法　采用枯细胞条件培养基 (KCCM )及含新生牛血清 (NBS)和健康大鼠血清 (RS)的混合血清刺激大鼠肝星状细胞 (HSC)系HSC T6 ,用 3H TdR和3H 脯氨酸参入法检测HSC增殖活性和胶原合成状况。结果　AST(1 6、32、64、1 2 8和 2 56mg·L- 1 )对KCCM 1∶4刺激HSC T6细胞增殖和胶原合成均有明显的抑制作用 ;在含 1 0 %NBS- 3 %RS混合血清刺激的HSC T6细胞 ,AST(32、64、1 2 8和 2 56mg·L- 1 )作用 48h对HSC T6细胞增殖 ,及AST(1 6、32、64、1 2 8和 2 56mg·L- 1 )作用 72h对HSC T6细胞胶原合成均有明显的抑制作用 ,呈浓度依赖型趋势。结论　AST对体外激活肝星状细胞的增殖和产生胶原有明显抑制作用 ,该作用可能是AST抗肝纤维化的机制之一     

红景天苷调控PI3K/Akt信号通路对LPS诱导的BV2小胶质细胞的抗炎作用

目的探讨红景天苷对脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞的抗炎作用及其机制。方法建立LPS诱导BV2小胶质细胞损伤模型。经不同浓度的红景天苷作用后,q PCR法检测细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA的表达; Western blot法检测Akt、p-Akt、核蛋白NF-κB p50的蛋白表达。PI3K抑制剂LY294002作用30 min,再经红景天苷作用后,检测Akt、p-Akt、核蛋白NF-κB p50、IL-6、IL-1β、TNF-α等指标。结果与模型组比较,红景天苷能够抑制BV2小胶质细胞IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA的表达,促进p-Akt蛋白表达,抑制核蛋白NF-κB p50;经LY294002作用后,红景天苷对pAkt、核蛋白NF-κB p50、IL-6、IL-1β等作用不明显。结论红景天苷能够抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应,主要是通过激活PI3K/Akt信号通路,促进Akt的磷酸化,抑制NF-κB p50核转录,进而抑制细胞因子。     

Ghrelin通过核因子-κB抑制肿瘤坏死因子-α诱导的HepG2细胞PAI-1 mRNA表达

目的探讨Ghrelin对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的HepG2细胞纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)mRNA表达的影响及核因子-κB(NF-κB)在其中的作用.方法HepG2细胞培养,加入不同浓度TNF-α,采用逆转录-聚合酶链反应测定(RT-PCR)检测PAI-1 mRNA的水平;免疫印迹法检测胞浆胞核NF-κBp65和胞浆κB抑制蛋白(IκB)的表达.给予Ghrelin预处理1 h后,加入TNF-α检测NF-κKBp65和IκB表达的变化.结果TNF-α(0.1,1,10μg·L-1)浓度依赖地增高HepG2细胞PAI-1 mRNA的表达;Ghrelin组的PAI-1 mRNA表达减少.TNF-α组胞核NF-κBp65表达增加,胞浆IκBα的表达减少;Ghrelin组较TNF-α组胞核NF-κBp65减少,胞浆IκBα的表达增加.结论TNF-α通过NF-κB介导HepG2 PAl-1mRNA的表达;Ghrelin通过抑制NF-κB而抑制TNF-α诱导PAI-1mRNA的表达.     

异丙酚对大鼠心肌缺血/再灌注损伤时核因子-κB信号途径的影响

目的观察异丙酚对大鼠在体心肌缺血/再灌注时核因子-κB(NF-κB)信号途径的影响,以探讨异丙酚的心肌保护作用机制。方法阻断大鼠左冠状动脉前降支30min,再灌注2h引起心肌缺血/再灌注损伤。60只SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、缺血/再灌注组(I/R)和异丙酚3、6、12mg·kg-1·h-1组。分别于缺血前、缺血30min末、再灌注2h末记录心率、平均动脉压,并计算心率-血压指数。ELISA及放射免疫法分别测定血清、心肌中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)的含量。分别用原位杂交法(ISH)和半定量RT-PCR法检测心肌组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、粘附分子1(ICAM-1)的mRNA的表达。免疫组化染色分析心肌组织中NF-κB的核移位,Western blot检测心肌组织NF-κB的表达量。结果缺血/再灌注后各组大鼠的平均动脉压、血压-心率指数均呈进行性下降(与Sham组相比P<0.05)。异丙酚12mg·kg-1·h-1组在缺血/再灌注后的平均动脉压和血压-心率指数明显高于I/R组(P<0.05)。与Sham组相比,I/R组NF-κB活化,明显从细胞质移位于细胞核,表达量也增加(P<0.05);血清、心肌中TNF-α、IL-1β含量明显升高(P<0.01),心肌中iNOSmR-NA、ICAM-1 mRNA表达增强(P<0.01)。而异丙酚6、12mg·kg-1·h-1组,NF-κB从细胞质向细胞核的移位被明显限制,NF-κB的表达量也明显低于I/R组(均P<0.05);血清、心肌中TNF-α、IL-1β含量明显较I/R组降低(P<0.05),心肌中iNOS mRNA、ICAM-1 mRNA表达减弱(与I/R组相比,P<0.05,P<0.01)。结论异丙酚能减轻缺血/再灌注损伤,同时明显抑制心肌缺血/再灌注时NF-κB的活化,阻断NF-κB相关信号通路的传导,下调TNF-α、IL-1β、ICAM-1和iNOS等炎症相关因子的表达。     

15d-PGJ_2对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的观察15d-PGJ2上调过氧化质体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达以及对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖凋亡的影响。方法体外培养HSC-T6细胞,取对数生长期的细胞,应用1、2、3μmol.L-1不同浓度的PPARγ激动剂15d-PGJ2作用24h,同时以不加药物只加无血清培养基做为对照组,24h后应用RT-PCR的方法观察分析各组间肝星状细胞PPARγ mRNA表达的变化,Western blot检测相应的胞质内NF-κB抑制蛋白表达。MTT检测HSC增殖,吖啶橙荧光染色观察细胞凋亡,流式细胞仪分析细胞周期。结果经15d-PGJ2处理的HSC细胞中PPARγ mRNA表达比例上调;胞质内NF-κB蛋白表达明显抑制。MTT结果显示不同浓度的15d-PGJ2对HSC-T6细胞的增殖均有抑制作用,以2μmol.L-1组最为明显;吖橙啶染色显示经PPARγ激动剂处理组凋亡细胞数明显增多,流式细胞仪结果显示15d-PGJ2处理组细胞产生了G1期阻滞作用。结论15d-PGJ2能够上调PPARγ表达并抑制HSC-T6增殖及诱导其凋亡,其诱导凋亡机制可能与抑制NF-κB活性有关。     

NF-kB/IκB-α信号通路对ATRA诱导HL-60细胞凋亡的影响

目的探讨NF-kB/IκB-α信号通路对全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60细胞凋亡的影响。方法将HL-60细胞与不同浓度的ATRA共同孵育,MTT法观察ATRA对细胞增殖作用,流式细胞术及电镜分析细胞凋亡,Western-Blot检测NF-κB及IκB-α的变化。结果MTT显示ATRA呈时间-剂量依赖方式抗HL-60细胞增殖,作用72h流式细胞术DNA直方图上出现典型的亚二倍体凋亡峰,透射电镜下见细胞核染色质致密浓缩,凋亡小体形成,Western-Blot产物显示HL-60细胞NF-κBp65下降,而IκB-α上升。结论ATRA能抗HL-60细胞增殖诱导凋亡,该过程可能与抑制IκB-α的降解阻止NF-κB的活化有关。     

DATS通过NF-κB抑制LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞促炎细胞因子表达

目的探讨二烯丙基三硫(DATS)抑制脂多糖(LPS)诱导小鼠肺泡巨噬细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-1β表达的信号转导机制。方法体外培养MH-S细胞,用DATS和(或)LPS进行干预。反转录PCR检测细胞中TNF-α、IL-1β mRNA表达,电泳迁移率改变分析(EMSA)检测细胞核因子-κB(NF-κB)活性,Western blot检测细胞磷酸化(p-IκB)及非磷酸化IκB的表达。结果LPS刺激MH-S细胞可导致TNF-α、IL-1β mRNA、p-IκB表达增加及NF-κB活性升高。用DATS(0.1、0.5、2.5、5.0mg.L-1)预处理细胞30min后再给予LPS刺激,可使TNF-α、IL-1β mRNA表达降低,并呈剂量依赖性;升高的NF-κB活性及p-IκB表达均显不同程度的抑制。单独DATS对TNF-α、IL-1β mRNA表达及NF-κB活性无影响。结论DATS可通过抑制IκB磷酸化及NF-κB活化,进而下调LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-1β mRNA表达。     

吡咯烷二硫代氨基甲酸盐下调基质金属蛋白酶9表达机制的研究

目的探讨TNF-α诱导的肺泡巨噬细胞(AM)性基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的信号通路以及吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对MMP-9表达的影响机制。方法从慢性阻塞性肺疾病患者支气管肺泡灌洗液中分离与培养AM,以PDTC预处理AM,以TNF-α或IL-1刺激AM。半定量逆转录-聚合酶链反应法检测MMP-9 mRNA的表达;Western blot检测MMP-9蛋白的表达及TNF-α或IL-1诱导的IκBα磷酸化水平。凝胶阻滞分析实验检测NF-κB活性。结果TNF-α上调AM源性MMP-9 mRNA和蛋白的表达(P<0.05);PDTC抑制TNF-α诱导的MMP-9的表达(P<0.05)。PDTC对TNF-α或IL-1诱导的IκBα的磷酸化均无抑制作用(P>0.05)。PDTC对TNF-α或IL-1诱导的NF-κB的活化均有抑制作用(P<0.05);且PDTC不能在体外直接抑制NF-κB的DNA结合活性(P>0.05)。结论NF-κB在TNF-α诱导的AM源性MMP-9的表达中起着重要作用;PDTC可能通过抑制泛素化-蛋白酶小体途径来下调TNF-α诱导的AM源性MMP-9的表达。     

补体旁路激活致血管平滑肌细胞增殖活化及干预研究

目的研究补体旁路途径激活诱导人血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活化及其干预作用。方法采用CVF特异激活血浆补体旁路途经。将VSMC与补体旁路激活产物共同孵育,采用倒置相差显微镜和MTT法分别检测细胞形态变化和增殖活性,ELISA法检测培养上清中E-selectin、ICAM-1和VCAM-1含量,Western blot检测p-NF-κB p65、IKK和NF-κB p65蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测NF-κB p65转录活性,采用PDTC对上述指标的变化进行干预。结果补体旁路激活导致VSMC增殖活化,上调表达E-selectin、ICAM-1和VCAM-1,其中ICAM-1和VCAM-1含量在6 h达到高峰,E-selectin在12 h出现明显上调;VSMC经补体旁路激活产物刺激后,NF-κB p65磷酸化明显增加,NF-κB p65核内转录活性升高,IKK和NF-κB p65蛋白表达上调,PDTC对上述相关指标的变化有明确的干预作用。结论补体旁路激活可导致VSMC增殖活化,其机制与NF-κB信号通路活化有密切关系,且NF-κB抑制剂PDTC对其增殖活化具有明显的干预作用。     

宝华玉兰种子提取物对NF-κB及IκBα表达的抑制作用

目的探讨宝华玉兰种子提取物对核转录因子-κB(NF-κB)、核转录因子-κB抑制蛋白α(IκBα)表达的抑制作用机制。方法使用宝华玉兰种子提取物处理人肝癌细胞HepG2后,用Western blotting法检测NF-κB及IκBα蛋白的表达变化情况。结果宝华玉兰种子提取物对IκBα的磷酸化及降解有抑制作用。宝华玉兰种子提取物可有效抑制NF-κB介导的基因转录。结论宝华玉兰种子提取物可能通过抑制IκBα磷酸化及降解,阻断NF-κB活性,进而抑制COX-2而发挥其抗炎和抗肿瘤作用。