人CDK7基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建带Myc标签的细胞周期蛋白依赖性激酶7（cyclin－dependent kinase 7, CDK7）的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶与已知相互作用蛋白P53之间的相互作用。方法应用PCR技术从人乳腺文库中扩增出CDK7全长编码区基因,将其克隆到pXJ－40载体中;继而重组质粒转染人胚肾293 T细胞,以SDS－PAGE和Western印迹鉴定表达情况;免疫共沉淀检测Myc－CDK7与FLAG－p53的相互作用。结果双酶切和基因测序鉴定显示,Myc－CDK7真核表达质粒克隆构建成功;SDS－PAGE和Western印迹结果表明,Myc－CDK7转染人胚肾293T细胞后成功表达;免疫共沉淀显示,重组Myc－CDK7与已知相互作用蛋白P53在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论成功构建Myc－CDK7的真核表达载体,为进一步探讨Myc－CDK7对细胞周期的调控奠定了实验基础。     

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的：为进一步研究脑红蛋白（NGB）的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体，应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体，并对其进行鉴定。方法：用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183-pAdEasy-l细菌，再以后者作为电感受态细菌，与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB，转染293细胞。制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果：通过PCR、序列测定和Western印迹杂交鉴定，确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论：成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体，为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。     

小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达。方法利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3′末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcD-NA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建的重组质粒通过脂质体转染COS-7细胞,分别采用RT-PCR和免疫荧光法检测其FABP3mRNA及蛋白的表达情况。结果所构建的pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag重组载体可酶切出418bp的FABP3 cDNA片段和442bp的FABP3-FlagcDNA片段,经测序证实正确。转染后的COS-7细胞经RT-PCR可扩增出278bp的目的片段,且免疫荧光分析可见特异性的FABP3及Flag蛋白表达。结论构建了FABP3基因真核表达载体pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并于COS-7细胞中成功转录表达,为后续研究奠定了基础。     

突变型脑红蛋白原核表达载体的构建与表达鉴定

目的 为了研究脑红蛋白(neuroglobin, Ngb)发挥神经保护功能的作用机制,拟构建Ngb中关键氨基酸His突变的原核表达载体,并对其进行诱导表达与鉴定.方法 利用引物突变法和PCR技术,扩增出突变型Ngb的cDNA,并克隆到原核表达载体pBV220,经测序鉴定正确转化到大肠杆菌HB101;对突变型Ngb蛋白进行诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western印迹进行鉴定.结果 与结论成功构建了pBV220-Ngb(H64V)和pBV220-Ngb(H96A)原核表达载体,SDS-PAGE和Western印迹检测结果显示突变型Ngb能够正常表达,为进一步揭示脑红蛋白神经保护功能与作用机制奠定了重要基础.     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

用pProEXHT载体进行人FLT3配体基因的表达与产物的亲和层析纯化

目的 :探讨寡聚组氨酸多肽与目标蛋白融合基因的表达及其产物的金属离子螯合亲和层析纯化方法。方法 :将人FLT3配体 (FL)胞外段cDNA连入 pProEXHT载体 ,转入大肠杆菌实现表达。分离包涵体并进行复性处理后 ,通过Ni2 离子螯合亲和层析纯化融合蛋白表达产物。结果和结论 :6×组氨酸 FL融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的 15% ,用Ni2 离子螯合亲和层析纯化表达产物 ,一次过柱的纯度可达 90 %以上 ,操作程序简便省时 ,是日后FL基因工程产品大规模制备的可行途径     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

EOLA1基因小干扰RNA载体构建及其干扰效应检测

目的 构建人类新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)特异性的小干扰RNA表达载体,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白(GFP)-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2／EOLA1,并转染人ECV304细胞株,G418压力筛选获得稳定表达株;针对靶基因EOLA1,设计靶点特异性的寡核苷酸,插入pSlincer3．1／H1质粒。转染重组质粒到稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,通过观察转染细胞绿色荧光的强弱和Westem blot实验检测靶基因的抑制情况。结果 获得了稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的细胞株,构建的小RNA干扰质粒siEOLA1能够抑制靶基因EOLA1的表达。结论 成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

微丝相关蛋白hHBRK1突变体的构建、表达及纯化

目的：构建微丝相关蛋白hHBRK1截短体和突变体原核表达载体，并表达及纯化融合蛋白。方法：采用常规PCR并结合定点突变技术，对hHBrkl基因进行缺失和点突变；利用限制性内切酶将PCR产物克隆至原核表达载体pGEX-4T；IPTG诱导融合蛋白表达，通过谷胱甘肽一琼脂糖纯化技术分离纯化GST融合蛋白。结果与结论：构建了包括氨基端缺失截短体hHBRK1-AN、羧基端缺失截短体hHBRK1-AC和点突变蛋白hHBRKl-S^56G^57在内的原核表达质粒，分离获得较高纯度的重组hHBRKl突变体融合蛋白，Western杂交证实纯化蛋白为GST融合蛋白。本实验为进一步研究hHBRK1的相互作用蛋白及其可能的结合位点提供了基础。     

人α-磷酸丙酮酸水合酶原核表达载体的构建及蛋白纯化

目的 构建带PET-28a标签的人ENO1基因原核表达产物,观察其表达并纯化出带PET-28a标签的ENO1融合蛋白,为研究肿瘤糖酵解的相关机制奠定实验基础.方法 以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增出ENO1基因编码片段,将其插入到PET-28a载体中,鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate,小量诱导表达后,利用PET-28a-琼脂糖凝胶4B亲和珠纯化PET-28a-ENO1融合蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹检测,获得纯度较好的PET-28a-ENO1蛋白.结果 利用PCR技术从乳腺文库中扩增得到大小约1300 bp的目的基因片段,插入PET-28a载体中,经双酶切鉴定及测序,结果表明PET-28a-ENO1质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量(Mr)约为57×103的目的蛋白.结论 成功获得了人糖酵解相关基因ENO1的原核表达产物,为进一步研究ENO1在糖酵解过程中的作用机制奠定基础.     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.     

Ni2+亲和胶的制备及其对带His6标签融合蛋白的纯化

目的：制备Ni^2 亲和胶，并检测其纯化带His6标签融合蛋白的效果。方法：在强碱条件下，用环氧氯丙烷活化Sepharose 4B后，接上多个IDA臂，将Ni2 连接在IDA臂上，即为亲和胶成品，用亲和胶分别在变性和非变性的条件下，纯化包涵体和可溶性表达的带His6标签的人TRF1和人tankyrase的PARP结构域，并通过Western印迹鉴定纯化的靶蛋白。结果：用自制的Ni2 亲和胶可以获得SDS－PAGE单一条带的目的蛋白，并得到Western印迹的鉴定，结论：自制的Ni^2 亲和胶对带His6标签融合蛋白的纯化能力与商品胶完全等同，但价格低廉。     

基于生物信息学分析的人ID4基因启动子表达载体的构建及鉴定

目的:基于生物信息学分析构建人ID4基因启动子表达载体,以其作为研究ID4基因启动子表达调控分析的工作基础.方法:在分析人ID4基因启动子结构和调控元件的基础上,据UCSC基因组生物信息学中人ID4基因转录起始点(TSS)上游启动子区-643 bp及5'非翻译区(5'-UTR) 164 bp序列设计并合成引物,进行PCR扩增;以PCR产物作为模板经巢式PCR扩增了TSS上游启动子区-621 bp片段,将PCR产物回收、纯化后再连接到pGEM-T Easy载体上并转化至DH5α感受态大肠杆菌中构建成pGEM-T Easy-人ID4基因启动子重组质粒.转化产物经半巢式PCR及酶切鉴定,对得到的阳性克隆进行测序.结果与结论:成功构建出含有糖皮质激素受体、cAMP结合蛋白及雌激素受体反应调控元件序列的人ID4基因启动子表达载体.该表达载体的构建为进一步研究人ID4基因的启动子活性及表达调控奠定了基础.