真核表达载体pEGFP-C3-MASH-1的构建

目的构建含小鼠MASH1基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MASH1，为进一步研究MASH1在间充质干细胞神经分化中的作用打下基础。方法应用RT-PCR方法从小鼠13．5d胚胎组织中扩增出两端带有HindⅢ和EcoRI酶切位点的MASH1cDNA编码片段，经回收、纯化、酶切后，依次连接到质粒pGEM-T和pEGFP-C3上。结果酶切及测序结果表明：重组质粒PEGFP-C3含有MASH-Ⅰ片段，方向及大小正确。结论成功构建了小鼠真核表达载体PEGFP-C3-MASH-Ⅰ。     

ASAP3真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建ASAP3的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肝癌细胞株HepG2克隆ASAP3基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明ASAP3基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论:成功构建ASAP3的真核表达载体p ASAP3。     

凝血因子Ⅷ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体的构建及鉴定

目的本研究以含有凝血因子Ⅷ(FⅧ)cDNA的pCI/FⅧ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅧ并进行鉴定,在HEK-293细胞中表达。方法以pCI/FⅧ质粒为模板,扩增出FⅧ的开放阅读框(ORF)区,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅧORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆,对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定。野生型pIRES2-ZsGreen1/FⅧ转染HEK-293细胞后,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测野生型FⅧ基因mRNA表达水平。结果成功构建pIRES2-ZsGreen1/FⅧ并转染入HEK-293细胞中,实时定量PCR检测FⅧmRNA在HEK-293细胞中的表达,激光共聚焦显微镜观察转染情况。结论为实时观察FⅧ真核表达载体在HEK-293细胞中的表达及FⅧ基因突变导致血友病A的分子发病机制的研究奠定实验基础。     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达

目的：摸索真核细胞翻译启动因子5A（eIF5A）编码基因的合成、pcDNA3．1／eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达。方法：用PCR合成eIF5A基因，将基因分别接在克隆载体pMD18-T的EcoR V多克隆位点上和真核表达载体pcDNA3．1的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ的多克隆位点之间，构建eIF5A基因的克隆载体和真核表达载体，分别在大肠杆菌E．coli DH5α中转化并提取质粒，将真核表达载体pcDNA3．1／eIF5A的质粒提取后，用脂质体包合并转染真核细胞CCRF-CEM，用流式细胞仪对eIF5A的表达水平进行检测。结果：eIF5A在CCRF-CEM细胞中的表达水平为107．03，eIF5A在转染细胞CCRF-CEM／trans中的表达水平为114．27，表达升高。结论：本实验构建了pcDNA3．1／eIF5A真核表达载体，发现其在CCRF-CEM细胞中高表达。本实验结果将有助于探讨肿瘤治疗过程中的新靶标。     

肺癌相关基因LSCC-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建含有肺癌相关基因LSCC-3全长ORF片段的真核表达载体,并验证其在细胞内的表达。方法PCR方法获取LSCC-3基因全长ORF片段,构建含有上述片段的真核表达载体（含3’端绿色荧光蛋白尾）并验证、纯化;将该真核表达载体转染人肺腺癌PAa细胞系,在倒置荧光显微镜下对LSCC-3基因的表达进行观察和验证。结果成功将LSCC-3基因全长ORF片段装入真核表达载体pLPS-3’EGFP（pLPS-LSCC-3-3’EGFP）并转染人肺腺癌PAa细胞系,在倒置荧光显微镜下观察到了核外细胞浆内LSCC-3基因蛋白表达产物的存在。结论成功构建了LSCC-3真核表达载体pLPS-LSCC-3-3’EGFP,该载体可在肺癌细胞胞浆内顺利表达。     

Exendin-4真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建Exendin-4基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得Exendin-4奠定基础。方法:采用重叠聚合酶链反应法扩增出Exendin-4的完整序列,将其亚克隆到表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-Exendin-4。重组质粒经SacI线性化后用电穿孔法导入到GS115中,经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,甲醇诱导表达后用凝胶电泳法分析Exendin-4的表达。结果:序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,电泳结果证明Exendin-4在毕赤酵母中能高效表达。结论:实现了Exendin-4单体在毕赤酵母中的表达,为Exendin-4的规模化生产奠定了基础。     

pCEP4/hIL-17真核表达载体的构建及表达

目的构建pCEP4/hIL-17载体及在真核细胞中表达hIL-17/mFc融合蛋白;初步研究IL-17生物学特性。方法采用RT-PCR的方法克隆hIL-17CDS段基因序列;将测序正确的hIL-17序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/IL-17真核表达载体,转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞后,筛选阳性表达细胞株;并用RT-PCR、ELISA和Western blot等法鉴定IL-17基因的mRNA和蛋白表达;流式细胞术分析纯化的蛋白对Raji细胞表达的hIL-17受体的结合能力;以体外实验验证其促炎症作用。结果成功构建了pCEP4/hIL-17重组载体,并在CHO细胞中稳定表达;所获得hIL-17重组蛋白能稳定结合Raji细胞上的IL-17受体;体外刺激HeLa细胞,能明显促进IL-6等炎症因子的分泌。结论稳定表达hIL-17重组蛋白的CHO细胞系的建立,为进一步研究hIL-17的生物学功能奠定了良好的基础。     

β-半乳糖苷结合凝集素-9真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建β-半乳糖苷结合凝集素-9的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β-半乳糖苷结合凝集素-9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明β-半乳糖苷结合凝集素-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论:成功构建β-半乳糖苷结合凝集素-9的真核表达载体pGal-9。     

人白细胞介素10 cDNA的克隆及其真核表达载体的构建

<正>白细胞介素10(interlekin-10,IL-10)是已知的细胞因子网络中为数不多的一种抑制性细胞因子,主要由Ⅱ型辅助T细胞分泌产生,具有重要的免疫调节功能和抗炎作用,其生物学效应在重症感染、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的发生、发展和转归过程中发挥着重要的调节作用,已有的研究资料显示IL-10有望成为临床相关疾病治疗的新选择。本文旨在利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞中克隆人IL-10的cDNA并构建其真核表达质粒,为进一步研究IL-10基因在细胞内的表达特征及其影响因素和探讨临床     

携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αhPPARα)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARα受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRES2-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα基因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论成功构建重组质粒phPPARα-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。     

p15、p16与p53在人脑胶质瘤中的表达及相关性的研究

目的研究p15、p16与p53基因在人脑胶质瘤中的表达及与胶质瘤恶性表型的关系.方法应用免疫组织化学技术检测73例脑胶质瘤中p15、p16与p53基因的表达.结果随着胶质瘤恶性程度的增高,p15、p16基因的表达阳性例数减少,p53基因则相反.结论提示p15、p16与p53抑癌基因在胶质瘤的发生、发展过程中起重要作用.     

MCHR2在CHO细胞中的稳定表达及其信号通路分析

目的构建人MCHR2基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并分析MCHR2介导的信号转导通路。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,定向插入到真核表达载体pcDNA3·1(+),经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,经RT-PCR和Western blot鉴定后,通过测定细胞内cAMP、Ca2+浓度的改变分析MCHR2的信号转导通路。结果成功构建了pcDNA3·1-MCHR2真核表达载体并稳定转入CHO细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因,MCH作用于MCHR2后不影响细胞内cAMP生成,可促使细胞内钙库释放Ca2+,进而使胞内Ca2+浓度出现明显而短暂的升高,提示MCHR2的信号转导通路主要是与Gq蛋白偶联。结论人MCHR2的稳定表达和信号转导通路分析为进一步体外研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础。     

非融合重组人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的克隆及高效表达

目的:获得大肠杆菌中高效表达的非融合重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF).方法:采用RT-PCR技术,以人胎儿脑组织的总RNA克隆出hbFGF基因,再以此为模板,设计引物,对hbFGF的TIR(翻译起始区)部分碱基进行改造和降低G C含量,最后将该新基因克隆于质粒载体pET-3C,转化于大肠杆菌中表达.结果:非融合rhbFGF在大肠杆菌中高效表达,占总蛋白量的30％以上.采用离子交换和亲和层析方法纯化后,生物活性与标准蛋白一致.结论:非融合rhbFGF及调整TIR区域的碱基序列能有效提高重组蛋白的表达效率.     

人脂联素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人脂联素（adiponectin）基因，并在大肠杆菌宿主系统中高效表达出adiponectin蛋白进行鉴定。方法：从人皮下脂肪组织提取总RNA，确认其正确性后经RT-PCR扩增得到全长cDNA片段，此片段经纯化回收后克隆至pMD 18-T载体，经行DNA序列分析，进一步克隆构建到表达载体至pET-DEST42中，用IPTG在大肠杆菌中诱导表达。结果：含重组adiponeetin质粒的大肠杆菌经0．4mmol／L的IPTG诱导6h后有高表达。结论：adiponeetin基因的克隆构建和在大肠杆菌中的表达获得成功。     

黄芪总苷对肝癌细胞凋亡及wtp53基因表达的影响

目的　研究黄芪总苷 (TA)对肝癌细胞凋亡的影响及其机制。方法　将两种人肝癌细胞株HepG2细胞和Bel 740 4细胞分别与TA(2 0 ,40和 80mg·L-1)共培养 6d ,经流式细胞术检测凋亡峰以及p5 3癌基因的表达。结果　TA(2 0 ,40和 80mg·L-1)可明显促进人肝癌HepG2细胞和Bel 740 4细胞的DNA亚G1峰 (凋亡峰 )升高 ,分别使HepG2细胞凋亡率由 4 1%增至 2 5 4%、5 7 0 %、74 6 % ;使Bel 740 4细胞凋亡率由 4 5 %增至 43 6 %、48 1%、5 0 5 %。TA(80mg·L-1)可促进人肝癌HepG2细胞野生型 p5 3(wtp5 3)的表达 ,还可促进Bel 740 4细胞的wtp5 3癌基因表达 ,并有降低突变型 p5 3(mtp5 3)表达的趋势。 结论　TA具有诱导肝癌细胞凋亡的作用 ,其机制可能与其上调肝癌细胞的wtp5 3表达有关     

preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6×His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。     

新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因的慢病毒载体的构建与表达

目的采用改良的Tet-On四环素可调控系统,构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因的慢病毒载体,观察四环素类抗生素对GDNF、TH基因的表达调控。方法 PCR方法获得大鼠GD-NF、TH基因,将其克隆至改良的Tet-On四环素调控慢病毒载体。通过瞬间转染法包装出病毒上清,用实时荧光定量PCR鉴定滴度。将包装的慢病毒-TH-GDNF与rtTA2S-M2以相同感染复数(MOI)感染293T细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测强力霉素对GDNF、TH基因mRNA和蛋白的表达调控。结果实验成功构建重组慢病毒载体质粒;生产的病毒浓缩后滴度为2.1×1011TU·L-1;感染293T细胞实时荧光定量PCR和免疫印迹显示强力霉素阳性组可见GDNF、TH基因mRNA表达明显升高(P<0.01)和蛋白条带,阴性组未见。结论在改良的Tet-On调控系统的慢病毒载体上成功克隆大鼠GDNF、TH双基因,其表达受四环素类抗生素调控并未见背景效应。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础     

刀额新对虾精氨酸激酶基因的克隆与真核表达

目的克隆刀额新对虾精氨酸激酶的基因并进行真核表达。方法提取刀额新对虾总RNA,经逆转录获得精氨酸激酶的cDNA,插入质粒pPIC9K构建重组真核表达质粒,转化毕赤酵母进行诱导表达,用SDS-PAGE和斑点免疫分析鉴定重组表达产物。结果逆转录获得的精氨酸激酶cDNA全长1071bp,DNA序列分析结果与GenBank收录的序列(EU497674)比较,同源性为99.5%;重组表达质粒转化酵母的表达产物经SDS-PAGE分析,其相对分子质量约40kD;表达产物与虾过敏者血清呈较强反应性。结论克隆得到刀额新对虾的精氨酸激酶基因并获得其重组真核表达产物,为进一步研制虾类食物过敏症的相关检测试剂提供了试验依据。