mrp反义mRNA真核表达载体pcDNA-Amrp的构建

0 引言 肿瘤多药耐药(MDR)是目前临床化疗的主要障碍和失败的根本原因,是亟待解决的问题之一[1]. MDR相关蛋白(MRP)是1992年Cole等[2]在耐阿霉素的小细胞肺癌细胞系H69AR中发现的一种新的肿瘤耐药相关分子,经研究证实,这种蛋白参与体内多种肿瘤耐药的发生,在某些肿瘤组织如胃癌,食管癌和乳腺癌等中呈强阳性表达. 为进一步探讨mrp在人类肿瘤MDR中发生的意义及反义mrp逆转耐药的可能性,我们构建了反义mrp真核表达载体,以了解用其转染耐药细胞后降低细胞MRP的表达对MDR功能的影响.     

人反义SOD2基因真核表达载体的构建与鉴定

人反义ＳＯＤ２基因真核表达载体的构建与鉴定李福洋１惠宏襄１莫简２王成济１（第四军医大学：１生物化学与分子生物学教研室，２化学教研室西安７１００３３）关键词自由基超氧化物岐酶反义核酸表达载体中图号Ｑ２６自由基与机体的许多生理，病理过程关系密切．近年来分...     

RON基因反义核酸真核表达载体的构建策略

目的 构建RON基因跨膜区段(RONm)的反义核酸真核表达载体。方法 用RT-PCR技术，从人肺癌细胞提取的总RNA克隆RONm eDNA序列。然后酶切鉴定与测序分析得到RONm的T载体，再将RONm反向插入peDNA3．1 中，酶切鉴定得到RONm反义真核表达载体。结果 用RT-PCR亚克隆RONm，测序结果与GenBank的RONm相应序列(X70040)一致，阅读框无改变。构建出正确的RONm反义真核表达载体。结论 成功构建RONm反义核酸真核表达载体，为进一步将RON基因反义核酸作为一种肺癌基因治疗方法的研究打下了分子生物学基础。     

人GRP78基因真核表达载体的构建及鉴定

目的利用PCR技术克隆人GRP78基因编码基因（约2000bp）。方法将PCR产物连接到pcDNA3.1（＋）载体上,酶切鉴定后测序分析。结果序列分析表明,扩增片段与GenBank里登陆的序列同源性为100%。并以pcDNA3.1（＋）表达载体为框架结构,尝试构建真核表达载体。结论测序分析结果表明序列同源性为100%。     

neu基因反义表达载体的构建及小鼠乳癌细胞株转染

ｎｅｕ基因反义表达载体的构建及小鼠乳癌细胞株转染郝新保，张盈华，惠宏襄，梁国栋（唐都医院中心实验室，生物化学教研室）关键词ｎｅｕ基因；反义核酸；表达载体中图法分类号Ｒ７３９．９ｎｅｕ基因所编码的膜表面蛋白Ｐ１８５在哺乳动物的乳癌发生和演进中具有重要意...     

肝素酶反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建肝素酶（heparanase，Hpa）反义RNA真核表达载体。方法 提取胃癌组织总RNA，按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列，设计并合成反义Hpa基因片段的引物，进行RT-PCR，并将扩增产物克隆至DGEMT载体，PCR鉴定及测序证实后，双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段，再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果 PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3．1-antiHpa，分别作PCR及双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定，证实其中有目的片段完整插入，插入片段测序结果与反义Hpa序列设计完全一致。结论 成功构建了Hpa反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-antiHpa，此结果为进一步研究Hpa蛋白分子的生物学功能和以Hpa为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

人NHE-1基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的构建人Na -H 交换蛋白-1(Na -H exchanger-1,NHE-1)基因反义真核表达载体.方法采用分子克隆技术,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶从NHE-1cDNA pEAP切下所需目的片段,然后将该片段反向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)/Zeo的多克隆位点,最后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳鉴定.结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,将目的片段成功的连接到pcDNA3.1(-)/Zeo载体上.结论成功地将NHE-1目的片段反向插入到pcDNA3.1(-)/Zeo中,构建了人NHE-1反义表达真核载体hNHE-1.     

分步克隆法构建人拓扑异构酶Ⅲalph真核反义表达载体及鉴定

目的 应用分步克隆法构建人拓扑异构酶Ⅲ alpha(hTOP 3 alpha)真核反义表达载体，为进一步阐明其与控制细胞周期的相关基因ATM之间的相互作用，研究ATM的生物学功能奠定基础。方法 采用分步克隆法首先用Hind Ⅲ和EcoRI双酶切构建插入2．6kb的片段，再用EcoRI酶切插入另一1kb的片段，最终获得人拓扑异构酶Ⅲ真核反义表达的重组载体。结果 经酶切、测序鉴定，人拓扑异构酶Ⅲ真核反义表达载体构建成功。结论 为研究ATM基因与人拓扑异构酶Ⅲ的相互作用，阐明其生物学功能奠定了基础，同时为大片段的基因的表达载体构建探索了新的方法和途径。     

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的：为诱导HBV特异性CTL，构建HBV全基因真核表达载体，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法：以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3，回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3，T4 DNA连接酶连接HBV和pcDNA3，转化、筛选，酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，RT-PCR检测转染细胞中PreSl mRNA的表达。结果：经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV，转染HepG2后，建立了新的肝癌细胞系HepG2．02G，细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg，PreSl mRNA在转染细胞中表达。结论：经体外重组，获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体，并可在肝癌细胞中稳定表达。     

分步克隆法构建人拓扑异构酶Ⅲalpha真核反义表达载体及鉴定

目的应用分步克隆法构建人拓扑异构酶Ⅲ alpha (hTOP 3 alpha)真核反义表达载体,为进一步阐明其与控制细胞周期的相关基因ATM之间的相互作用,研究ATM的生物学功能奠定基础.方法采用分步克隆法首先用 Hind Ⅲ和EcoRI双酶切构建插入2.6 kb的片段,再用EcoRI酶切插入另一1 kb的片段,最终获得人拓扑异构酶Ⅲ真核反义表达的重组载体.结果经酶切、测序鉴定,人拓扑异构酶Ⅲ真核反义表达载体构建成功.结论为研究ATM基因与人拓扑异构酶Ⅲ的相互作用,阐明其生物学功能奠定了基础,同时为大片段的基因的表达载体构建探索了新的方法和途径.     

MGMT反义RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：探讨反义RNA逆转胶质瘤细胞耐药的可能性，构建MGMT反义RNA的真核表达载体。方法：以Xho Ⅰ和PvuⅡ双酶切质粒pHM14，回收178bp的片段，定向插入以HpaⅠ和XhoⅠ双酶切pLXSN所获得的线性化载体，构建针对MGMTmRNA5′端的反义表达载体pLaMT5SN；以EcoRⅠ单酶切pHM14，回收779bp的片段，插入以EcoRⅠ单酶切pLXSN并经CIAP去磷酸化的线性载体，构建针对MGMTmRNA全长序列的反义表达载体pLaMTSN。结果：pLaMT5SN经HindⅢ酶切可见370bp的片段；pLaMTSN经PCR扩增证明目的片段反向插入pLXSN，鉴定结果表明构建成功。结论：成功构建了两个MGMT反义RNA的真核表达载体，为研究MGMT反义RNA逆转胶质瘤耐药细胞的耐药表型提供了良好的实验材料。     

人白细胞介素－2基因真核表达载体pDORIL－2的构建

目的：构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆人表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ．结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆人ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２．结论：用ＰＣＲ扩增目的基因片断，有快速、获得量大、可改变酶切位点等优点；ｐＤＯＲＩＬ－２的构建成功，为开展基因治疗的研究打下了基础。     

人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

大鼠谷氨酰胺酶反义真核表达载体的构建及鉴定

目的 :构建大鼠谷氨酰胺酶 (GA)反义真核表达载体。　方法 :采用分子克隆技术将rGAcDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA 3.0中。　结果 :EcoRⅠ和HinDⅢ双酶切后 ,反义重组基因为 0 .2 8kb和 5 .4kb两条带 ,与理论计算相符。　结论 :成功构建了大鼠GA反义真核表达载体 ,为肿瘤细胞的GA反义基因治疗研究创造条件     

单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建

目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段,与带有相同酶切位点的ｐＬＸＳＮ逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接,构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析。证明反义载体构建成功。结论 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增插入ＤＮＡ片段,简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建     

人HNF1α真核表达载体的构建及表达

目的 构建人肝细胞核因子-1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)真核表达载体,在体外表达并检测.方法 提取HepG2总RNA,用RT-PCR方法制备HNF1α cDNA,进行T-A 克隆.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切测序正确的重组质粒,回收HNF1α cDNA片段,将其亚克隆于pcDNA3.1( )载体的多克隆位点内.将构建好的真核表达质粒用脂质体法转染HepG2细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测HNF1α的表达. 结果正确构建了pcDNA3.1( )-HNF1α重组载体,并且在转染该质粒的HepG2细胞中检测出了HNF1α的高表达. 结论成功地构建了人HNF1α真核表达载体,其可以在体外表达.     

反义VEGF165真核载体的构建

以质粒pcDNA3.1为载体，将血管内皮基因（VEGF）165cDNA片段反向插入得到反义VEGF165真核表达载体，经过酶切电泳和基因测序证实获得的载体插入方向正确，可以进一步用于反义基因表达的实验研究。     

人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。     

人γ干扰素基因真核表达载体pZip—γ干扰素的构建

为构建逆转录病毒载介导的人γ干扰素（ＩＮＦ－γ基因真核细胞表达载体，将质粒ｐＧＥＭ－１－ＩＦＮ－γ用ＢａｍＨＩ酶切，分离回收入ＩＦＮ－γｃＤＮＡ片段，再定向克隆入逆转录病毒载体ｐＺｉｐ、Ｎｅｏ、ＳＶ（Ｘ）１。经酶切鉴定证实该片段已被正确克隆入ｐＺｉｐ．Ｎｅｏ．ＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ酶切位点，构建成ＩＦＮ－γ基因真核表达载体ｐＺｉｐ－ＩＦＮ－γ。ｐＺｉｐ－ＩＤＮ－γ的构建成功。为开展ＩＦＮ－γ基因