恶性疟原虫特异的基因克隆

本文用鸟枪法将恶性疟原虫基因组 DNA 片段克隆至载体 pBR_(322)质粒中,利用抗性遗传标志和琼脂糖凝胶电泳筛选重组克隆,克隆 pBF_8,pBF_(13),pBF_(23),pBF_(24)用 HindⅢ酶解后,均显示单一插入片段,分子大小分别为1.8,2.3,0.94和6.0kb。经 Southern Blot 和 Dot Blot 分析表明,克隆 pBF_(13)对恶性疟原虫基因组 DNA 特异,与人 DNA 无交叉性杂交,可用作诊断用探针。     

不同DNA探针检测疟原虫的灵敏度比较

本文通过分子杂交技术,以恶性疟原虫为靶DNA,对从恶性疟基因文库中筛出的含有高度重复顺序的pBF_4DNA探针和含单考贝基因的pBF_(13)DNA探针以及恶性疟原虫全基因组DNA探针进行了杂交比较,结果pBF_(13)DNA探针比全基因组DNA探针敏感度低10倍,比pBF_4DNA探针敏感度低100倍,全基因组DNA探针可检到的DNA含量为100pg。     

质粒型pBF_4DNA探针用于疟疾诊断的研究

质粒pBF_4DNA 用~(32)P 标记后,与现场采集的50份疟疾病人血样进行斑点杂交,9份镜检为恶性疟者杂交全为阳性,与镜检符合率为100%;41份镜检为间日疟的标本,有3份出现杂交弱阳性;10份正常人血两者检查均为阴性。DNA 探针检测恶性疟原虫的灵敏度为0.001%原虫血症。血样存放2年之久,仍可用于 DNA 杂交。     

间日疟原虫特异性DNA片段的克隆和鉴定

本文从间日疟患者血液中分离出间日疟原虫,将其基因组 DNA 片段克隆到载体 pUC12质粒中,构建了间日疟原虫 DNA 文库。利用质粒的遗传标志初步筛选重组克隆;用~(32)P 标记的间日疟原虫DNA,人白细胞 DNA 和恶性疟原虫 DNA 为探针分别作菌落杂交,差异筛选出4株间日疟原虫特异的重组克隆,命名为 pVA1—4。然后酶切鉴定其插入片段,并用 Southern blot 分析,表明重组质粒 pVAl 含有间日疟原虫特异性 DNA 片段。     

质粒PF.rep20探针检测我国恶性疟原虫的初步研究

用~(33)P中标记的质粒PF rep20探针以DNA-DNA斑点杂交检测5种疟原虫,仅恶性疟原虫P.f.呈现阳性反应,间日疟原虫、约氏疟原虫、食蟹猴疟原虫及诺氏疟原虫不发生杂交;~(32)P标记的P.f.海南株基因组DNA探针与上述诸疟原虫均可发生杂交。基因诊断海南省和云南省恶性疟患者血样本39份的杂交阳性率,质粒探针和基因探针分别为94.9％和97.4％。检测人工培养的海南株、云南株和安徽株P.f.敏感度,质粒探针均为0.001％原虫血症和10Pg原虫DNA,基因组探针对海南株原虫为0.0001％和1Pg。提示质粒PF rep20探针种的特异性强,敏感性较高,似可用于我国恶性疟原虫检测。     

DNA探针检测间日疟原虫的初步研究

由于间日疟原虫目前尚不能体外培养,抗原制备困难,使间日疟的流行病学调查及诊断受到限制。本文报道以间日疟原虫红内期基因组DNA库0.24kb DNA片段为探针,用~(32)P标记后进行点杂交试验检测间日疟原虫的初步结果。 材料与方法 含间日疟原虫红内期基因组DNA库亚克隆VPL101/5 0.24kb DNA片段的重组质粒pUC19由澳大利亚昆士兰医学研究所Kidson赠送。按文献方法进行感受态细胞JM 109的制备、重组质     

光生物素标记DNA探针检测疟原虫DNA的初步研究

使用放射性同位素标记的DNA探针检测靶DNA的敏感度高,故目前多采用[~32P]作为标记物.但因~32P的半衰期甚短,而且需要特殊条件处理放射性物质,在普通实验室内难以采用.本研究使用光生物素(PH-OTOPROBE~TM Biotin)标记DNA探针,以点杂交试验检测疟原虫DNA. 材料和方法:使用美国VECTOR Laboratories公司生产的光可激活生物素标记DNA,以制备生物素化DNA探针。获自恶性疟原虫(Honduras 1株)红内期cDNA库的重组质粒DNA(克隆7,用EcoR1将其切成     

用聚合酶链反应技术鉴别恶性疟原虫不同地理株的初步研究

目的　阐明 Fcc1/ HN株与云南株间的不同生物学特性。　方法　用 M2 6 - 32 作探针 ,筛选恶性疟原虫 c DNA基因表达文库 ,根据所获得的靶抗原决定簇表位的基因序列设计引物 ,分别进行 PCR扩增 ;地高辛酶促生物标记 Fcc1- HN株 DNA的 PCR扩增产物 ,分别与 Fcc1/ HN株 DNA、云南株 DNA和阳性克隆 5 11的扩增产物杂交。　结果　 PCR扩增后 Fcc1/ HN株 DNA在约 5 0 0 bp和 4 5 0 bp处有 2条特异性条带 ;云南株 DNA在约 5 0 0 bp处有 1条较淡的条带和 130 0bp处一较亮的特异性条带 ;阳性克隆 5 11仅在约 5 0 0 bp处有 1条特异性条带。标记探针能与克隆 DNA、恶性疟原虫Fcc1/ HN株和云南株的 PCR扩增产物杂交。　结论　恶性疟原虫 Fcc1/ HN株与云南株在基因组 DNA结构上可能存在差异。     

日本血吸虫中国大陆株雌性特异性DNA片段及重复序列的分离与鉴定

目的分离鉴定日本血吸虫基因组DNA的雌性特异性片段及DNA重复序列.方法分别提取雌、雄日本血吸虫基因组DNA,制备检测子和驱动子;利用代表性差异分析(RDA)及PCR进行扣除杂交,获得目的DNA片段;对所获目的DNA片段用低熔点凝胶回收;转质粒载体、重组质粒载体的阳性克隆筛选、测序;用Southern blottmg对目的DNA片段进行鉴定.结果RDA及PCR获得5个目的DNA片段;并转质粒载体测定了5个目的DNA片段(P1～P5)的序列.Southernblottmg显示DNA片段P1和P2均与雌、雄基因组DNA强烈杂交;DNA片段P3与雌性基因组DNA的杂交强度明显高于与雄性基因组DNA的杂交强度;DNA片段P4和P5仅与雌性基因组DNA杂交,但不与雄性基因组DNA杂交.结论DNA片段P1和P2为日本血吸虫DNA重复序列,并以多拷贝存在于日本血吸虫基因组DNA中;DNA片段P3存在于日本血吸虫性染色体W和Z上,在性染色体W的拷贝数多于在性染色体Z上的拷贝数;DNA片段P4和P5仅存在于日本血吸虫性染色体W上,为日本血吸虫雌性特异性片段.     

弓形虫基因组文库的建立、特异克隆的筛选和弓形虫病的DNA诊断

首次建立弓形虫人株(ZS_2株)基因组文库,筛选出一个弓形虫特异DNA片段的克隆。对该克隆的DNA片段(1.1kb)进行了限制性内切酶图谱分析。应用Southern印迹法及斑点印迹法检测,结果示同位素~(32)P标记的该克隆DNA片段能与弓形虫DNA、人工感染弓形虫幼猪白细胞和胸腺DNA、弓形虫感染病人DNA杂交,但不与正常人、正常幼猪外周血白细胞、正常小鼠脾脏、恶性疟原虫、肺孢子虫、pBR322的DNA杂交。斑点杂交检测低限为100个弓形虫或500pg弓形虫DNA。该探针已成功地应用于多种弓形虫感染病例的检测,为弓形虫病提供了一个特异、灵敏的DNA诊断方法。     

用重复DNA克隆作为种特异性探针检测恶性疟原虫DNA

用恶性疟原虫重复顺序克隆进行杂交的方法可提高检测系统的重现性和敏感性。分离疟原虫DNA并用CsCl放线菌素D离心去除人DNA杂质。Tanzania株Ⅰ用Sau 3AI部分酶切并克隆到有Bam HI切点的噬菌体M13mp 18中,用标记的全部恶性疟原虫基因组DNA探针进行噬菌斑杂交选出带有重复顺序的克隆株。用标记的恶性疟基因组DNA探针与人     

免疫筛选恶性疟原虫cDNA克隆

目的 :获取恶性疟原虫 (海南株 )抗原的 c DNA克隆并进行初步鉴定。方法 :采用 dot-EL ISA,以兔免疫血清对恶性疟原虫 c DNA表达文库约 80万个重组噬斑进行筛选 ,并用 2 0株单克隆抗体和恶性疟患者血清对强阳性克隆进行再筛选。 PCR初步鉴定 17个强阳性克隆。结果 :兔免疫血清确定了 17个强阳性克隆, 患者血清检测到 11个阳性克隆 (含 8个强阳性 ) ,11株单抗与 9个 c DNA克隆呈阳性反应。 17个强阳性克隆均能扩增出大小在 30 0 bp- 2 .5kb左右的条带。结论 :已筛选到能与抗恶性疟原虫兔血清、单克隆抗体及患者血清产生特异性免疫反应的 c DNA克隆。     

（Dig）—DNA探针检测恶性疟病人的研究

采用异羟基洋地黄毒苷配基(Digoxigenin,(Dig)-11-dUTP),以随机引物法标记含有恶性疟原虫(P.f.)DNA的重组质粒片段(酶切克隆pPF14),制成pPF14-F-Dig探针。用此探针,以斑点杂交试验检测提纯的P.f.DNA及海南地区疟疾病人。结果显示,pPF14-F-Dig探针至少可检出40pg的P.f.DNA和低至0.005％原虫血症。38例P.f.病人中,检出阳性33例。3例恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染者中,2例阳性。4例间日疟病人中,阴性3例,可疑1例。21例正常人血皆为阴性。     

重组质粒DNA探针用于间日疟诊断的研究

用~(32)P标记含间日疟原虫DNA片段的重组质粒pVA1作为探针,通过DNA打点杂交试验检测红内期间日疟原虫。该探针检测间日疟原虫基因组DNA的敏感度达1ng;与现场采集的25份间日疟患者血样(原虫血症为0.003％～0.7％)的杂交阳性率为72％,与6例恶性疟和3例食蟹猴疟血样中各1例杂交阳性;与3例约氏疟和6例正常人血样均为阴性。     

恶性疟原虫大片段DNA在酵母菌人工染色体中稳定克隆

恶性疟原虫大片段DNA在大肠杆菌中克隆不稳定,很可能与恶性疟原虫DNA的A+T含量非常高(82%)有关。酒酿酵母菌与恶性疟原虫的A+T含量较大肠杆菌与恶性疟原虫的A+T接近,因此对100kb以上的恶性疟原虫DNA片段在酵母菌人工染色体(YACs)克隆的稳定性进行了研究。pYAC4经氯化铯标准法纯化,EcoRI和BamHI完全酶切,小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化作为载体DNA。恶性疟原虫B8分离株DNA经EcoRI部分酶切,约15μg埋于琼脂糖井内,用EcoRI部分酶切,然后进行脉冲电场梯度凝胶电泳(PFGE),去除<100kb     

一步反转录PCR技术在检测4种人疟原虫中的初步应用

目的探讨应用一步反转录PCR(RT-PCR)技术检测4种人疟原虫的可行性和特异性。方法取恶性疟(1例)、间日疟(1例)、卵形疟(1例)和三日疟(5例)患者全血,提取疟原虫总RNA和基因组DNA。应用一步RT-PCR和一步实时荧光RT-PCR分别扩增经脱氧核糖核酸酶(DNase)消化的疟原虫RNA样品中的18S rRNA序列,应用普通PCR和一步RT-PCR技术分别扩增不同稀释浓度的疟原虫RNA(未经DNase消化和经DNase消化)和DNA样品中的疟原虫18S rRNA序列和18S r DNA序列,比较2种检测技术可检测到目标序列的样品最低稀释浓度。结果患者全血基因组DNA经一步RT-PCR分别扩增出310、394和323 bp条带,测序结果显示分别为恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、卵形疟原虫(P.ovale)和间日疟原虫(P.vivax)的18S rRNA序列特异性条带,但未扩增出三日疟原虫(P.malariare)特异条带。一步实时荧光RT-PCR结果显示,4种人疟原虫RNA样品均出现相应的荧光信号,除三日疟原虫样品外,各溶解曲线均仅有单一的扩增峰。因4种人疟原虫DNA和RNA原液样品中模板量的差异,一步RT-PCR可检测到的最低稀释浓度从1至10-4不等,但可检测到的DNA样品的最低稀释浓度与未经DNase消化的RNA样品相同或较后者低一个数量级,且两者最低稀释浓度均低于经DNase消化的RNA样品。与普通PCR的检测结果比较发现,同一样品均以一步RT-PCR可检测到的稀释浓度最低,较普通PCR的敏感性提高10~1 000倍。结论一步RT-PCR技术可检测出人血液样品中的恶性疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫DNA,但在检测三日疟原虫样品中的适用性有待进一步分析。     

恶性疟原虫DNA探针检测血内恶性疟原虫的初步研究

从培养恶性疟原虫(Fcc-1)中分离纯化基因组DNA,用~(32)P标记,作为探针,按DNA斑点杂交法,检测血样。结果表明:该探针可检出9个恶性疟原虫感染红细胞/10_6红细胞;在现场应用时,与13例恶性疟阳性标本镜检符合率为92％:与1例间日疟原虫病例和正常人血、白细胞之间,未发现非特异性杂交。     

短期体外培养间日疟原虫和卵形疟原虫用于药敏试验

Brockelman等(1989)发展了一种间日疟原虫短期体外培养系统进行药敏试验,该法基于镜下计数成熟裂殖体。作者试图用氚标记的DNA前体物作指标,对间日疟原虫和卵形疟原虫进行药敏试验,以评价此法的适用性。实验中使用了卵形疟原虫的9个分离株(P.o.-1到P.o.-9)和4株间日疟原虫的4个分离株(P.v.-1到P.v.-4),前者来自非洲移民,而间日疟原虫来自亚洲移民及     

约氏疟原虫基因条件修饰体系的构建及其应用分析

目的构建Flp/FRT位点特异重组系统介导的致死型约氏疟原虫基因条件修饰体系,用于疟原虫红前期基因功能的研究。方法构建含有Flp酶基因序列和FRT标记耐药基因的重组质粒,通过Nucleofector电转技术将线性化质粒转染至约氏疟原虫P.yoelii 17XL。经药物筛选并克隆后,利用PCR和核酸探针杂交进行基因型鉴定。经蚊体内发育,启动Flp酶介导的位点特异重组去除药物筛选基因(hDHFR),并利用PCR技术分析基因工程疟原虫内Flp酶介导的FRT位点间的重组效率。通过检测感染小鼠的发病情况、疟疾血症及生存曲线分析基因工程疟原虫的生物学特性。结果成功构建打靶载体pyUIS4/Flp并重组至UIS4基因的5′调控区,获同源重组疟原虫P.yUIS4/Flp(R),经蚊体内发育获位点特异重组删除药物筛选基因的基因工程疟原虫P.yUIS4/Flp。PCR和核酸探针鉴定基因工程疟原虫基因型正确。基因工程疟原虫内Flp酶介导的FRT位点间的重组在发育至14d的子孢子内达到近100%的重组效率。与野生型疟原虫比较,小鼠感染后3 d镜下均查见感染红细胞,其内疟原虫形态未见异常,7 d红细胞寄生率达峰值,分别为80.5%和82.7%,疟疾血症及生存曲线均无统计学差异(P0.05)。结论成功构建基因工程疟原虫P.yUIS4/Flp,其生物学特性与野生型疟原虫无明显不同,并具有较高的位点特异的重组效率,可用于疟原虫红前期基因功能的研究及减毒活疫苗的研制。     

云南中缅边境等地5种疟原虫18S rDNA基因的序列分析及种系发育

目的分析我国云南中缅边境等地5种疟原虫18S rDNA的基因差异和种系发育。方法 2000-2015年收集来自我国云南中缅边境等地的疟疾患者血样(或疟原虫DNA),提取血样中的疟原虫DNA,对它们的18S rDNA基因进行扩增、测序分析,并与Gen Bank中疟原虫相应序列进行比较分析,利用邻接法(neighbor joining,NJ)、最大似然法(maximum likelihood,ML)和最大简约法(maximum parsimony,MP)构建系统进化树。结果共收集了94例疟疾患者血样或DNA,所有样品均扩增出18S rDNA基因序列。序列比对分析显示,恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)、卵形疟原虫(P.ovale)和诺氏疟原虫(P.knowlesi)的种内差异分别为0~0.2%、0~0.1%、0~0.1%、0~0.1%和0。种系发育关系分析显示,NJ、MP和ML法构建的系统进化树的拓扑结构基本一致。本研究的疟原虫形成5个大的分支:恶性疟原虫形成一个分支,与Gen Bank中来自喀麦隆(KC428741、KC428742)、巴西(KC906718)和马来西亚(HQ283221)的分离株聚集在一起;间日疟原虫形成一个分支,其中大部分样品与来自喀麦隆(HF945443)、印度(HM014361、JQ627158)和哥伦比亚(U83877)的分离株形成一较小分支,小部分样本(Pv11、Pv18和Pv21)形成一个更小的分支后与食蟹猴疟原虫(P.cynomolgi)(L07559)相聚形成一较小分支;三日疟原虫形成一个分支,来自云南的三日疟原虫Pm1、Pm3和Pm4聚在一个小分支内,并与来自日本的分离株(AB250682)相聚,再与来自海南的分离株Pm5相聚,显示出地区差异性;卵形疟原虫形成一个分支,与来自越南的分离株(EU935736、AF387038)聚在一起;诺氏疟原虫形成一个分支,与来自缅甸的分离株(GU816250、GU816246)聚在一起。结论我国云南中缅边境等地5种疟原虫18S rDNA基因均无明显种内差异;种系发育关系分析显示,NJ、MP和ML法构建的系统进化树的拓扑结构基本一致。