恶性疟原虫基因文库构建及特异DNA探针的应用研究

将恶性疟原虫Ｆｃｃ－１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ用ＨｉｎｄⅢＤＮＡ用ＨｉｎｄⅢ消化与ｐＢＲ３２２重组后导入大肠杆菌ＨＢ１０１,转化效率为１．５×１０＾６转化子／μｇ ＤＮＡ,建成基因库。用Ｐ．ｆ基因组ＤＮＡ原位杂交,证明了该库的有效性,又筛出特异克隆。克隆之一ｐＢＦ２ ＤＮＡ用＾３２Ｐ和光敏生物素标记作探针,可分别从间日疟原虫,恶疟原虫,伯氏疟原虫,食蟹猴疟原虫和人白细胞ＤＮＡ样本中特异地检出Ｐ,ｆ     

恶性疟原虫DNA探针检测血内恶性疟原虫的初步研究

从培养恶性疟原虫(Fcc-1)中分离纯化基因组DNA,用~(32)P标记,作为探针,按DNA斑点杂交法,检测血样。结果表明:该探针可检出9个恶性疟原虫感染红细胞/10_6红细胞;在现场应用时,与13例恶性疟阳性标本镜检符合率为92％:与1例间日疟原虫病例和正常人血、白细胞之间,未发现非特异性杂交。     

基因组、克隆重组DNA探针平行检测恶性疟原虫的初步研究

本文报告实验室制备恶性疟原虫（Ｆｃｃ－１／ＨＮ分离株）基因组ＤＮＡ．酶切冻融回收克隆重组ｐＰＦ１４ＤＮＡ，经３２Ｐ缺口移位法标记作为探针，按ＤＮＡ—ＤＮＡ斑点杂交试验平行检测Ｐ．ｆ．ＤＮＡ及血样中恶性疟原虫的初步结果．两探针检测人工培养的恶性疟原虫（Ｆｃｃ－１／ＨＮ）敏感度，基因组探针为０．０００７８％原虫血症和７．８３ｐｇ原虫ＤＮＡ，ｐＰＦ１４探针为０．００７８％和１５．６３ｐｇ。镜检确诊并复核后的５６例云南恶性疟病人血样，基因组探针检出５３例（９４．６４％），ｐＰＦ１４探针检出５１例（９１．０７％）．９例间日疟病人血样，基因组探针阳性７例，ｐＰＦ１４探针均未显示杂交．２例伯氏鼠疟、１例刚地弓形虫阳性鼠及１０例正常人血样皆为阴性．结果揭示：这两种探针似可用于我国疟疾主要流行区恶性疟原虫检测。与基因组探针相比，ｐＰＦ１４探针似是发展适合于我因恶性疟原虫大规模核酸诊断技术中，比较经济、方便的探针来源。     

应用DNA探针检测蚊体内疟原虫的研究

本文用生物素标记的克隆ＤＮＡ探针，以斑点杂交法检测蚊体内恶性疟原虫。将一组蚊虫在还原性缓冲液中研磨后集体检测时，在２５只蚊中有１只感染蚊即可检出，亦可将单个蚊虫直接压在硝酸纤维素膜上进行检测。本技术的高特异性、敏感性以及试剂的稳定性等表明，它可作为一个适用的流行病学调查工具。     

光敏生物素DNA探针用于血内和蚊体内疟原虫的检测

从恶性疟原虫基因文库中筛选的具有Ｐ．ｆ种特异的质粒型ｐＢＦ２克隆ＤＮＡ经光敏生物素标记后作探针，用核酸杂交方法检测不同疟区病人血内和蚊体内的疟原虫，敏感性和持异性均达应用水平，显示该探针在疟疾监测中具有良好的应用前景。     

DNA探针检测间日疟原虫的初步研究

由于间日疟原虫目前尚不能体外培养,抗原制备困难,使间日疟的流行病学调查及诊断受到限制。本文报道以间日疟原虫红内期基因组DNA库0.24kb DNA片段为探针,用~(32)P标记后进行点杂交试验检测间日疟原虫的初步结果。 材料与方法 含间日疟原虫红内期基因组DNA库亚克隆VPL101/5 0.24kb DNA片段的重组质粒pUC19由澳大利亚昆士兰医学研究所Kidson赠送。按文献方法进行感受态细胞JM 109的制备、重组质     

光敏生物素DNA探针用于血内和蚊体内疟原虫的检测

从恶性疟原虫（Ｐ．ｆ） 基因文库中筛选的具有Ｐ．ｆ 种特异的质粒型ｐＢＦ２ 克隆ＤＮＡ 经光敏生物素标记后作探针，用核酸杂交方法检测不同疟区病人血内和蚊体内的疟原虫，敏感性和特异性均达应用水平，显示该探针在疟疾监测中具有良好的应用前景。     

用固相聚合酶链反应检测恶性疟原虫DNA特异片段

本文建立了固相聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测恶性疟原虫的方法，并对培养的ＦＣＣｌ／ＨＮ株及西双版纳恶性疟患者进行检测，结果表明该法对ＦＣＣｌ／ＨＮ株ＤＮＡ敏感到０．２ｐｇ，相当于１０个疟原虫，对西双版纳疟疾患者检测恶性疟３０例，间日疟４例，证实ＰＣＲ仅特异扩增恶性疟原虫ＤＮＡ。提示固相ＰＣＲ是早期、敏感、特异检测恶性疟原虫的方法。     

用[α-~(32)P]—dATP标记恶性疟原虫DNA探针诊断恶性疟疾的研究

本文报告从培养的恶性疟原虫提取基因组DNA,以[α-~(32)p]—dATP标记,作为探针,按DNA斑点杂交法检查取自海南省恶性疟患者的血样23份,结果全部呈杂交阳性反应,镜检阳性样本DNA探针检出率为100%,与10例间日疟患者血样全部出现交叉杂交。该探针可检测出恶性疟原虫密度为0.0001%的原虫血症水平,与鼠疟原虫、正常人血和人白细胞无交叉杂交。     

不同DNA探针检测疟原虫的灵敏度比较

本文通过分子杂交技术,以恶性疟原虫为靶DNA,对从恶性疟基因文库中筛出的含有高度重复顺序的pBF_4DNA探针和含单考贝基因的pBF_(13)DNA探针以及恶性疟原虫全基因组DNA探针进行了杂交比较,结果pBF_(13)DNA探针比全基因组DNA探针敏感度低10倍,比pBF_4DNA探针敏感度低100倍,全基因组DNA探针可检到的DNA含量为100pg。     

应用DNA探针检测蚊体内疟原虫的研究

本文用生物素标记的克隆ＤＮＡ探针，以斑点杂交法检测蚊体内恶性疟原虫。将一组蚊虫在还原性缓冲液中研磨后集体检测时，在２５只蚊中有１只感染蚊即可检出，亦可将单个蚊虫直接压在硝酸纤维素膜上进行检测。本技术的高特异性，敏感性以及试剂的稳定性等表明，它可作一个适用的流行病学调查工具。     

恶性疟原虫特异的基因克隆

本文用鸟枪法将恶性疟原虫基因组 DNA 片段克隆至载体 pBR_(322)质粒中,利用抗性遗传标志和琼脂糖凝胶电泳筛选重组克隆,克隆 pBF_8,pBF_(13),pBF_(23),pBF_(24)用 HindⅢ酶解后,均显示单一插入片段,分子大小分别为1.8,2.3,0.94和6.0kb。经 Southern Blot 和 Dot Blot 分析表明,克隆 pBF_(13)对恶性疟原虫基因组 DNA 特异,与人 DNA 无交叉性杂交,可用作诊断用探针。     

生物素化质粒rep20探针检测恶性疟原虫感染的研究

Bio—ll—dUTP经切口平移法标记于质粒rep20,自身杂交敏感度为100pg。检出云南株Pf(恶性疟原虫)培养血和病人血样中pf密度低限分别为1/10~5和1/10~4(虫/红细胞),病人血样中最低pf检出数为12000个。检测30份云南省恶性疟患者血样,28份阳性;检测20份云南省和海南省问日疟患者血样、29份正常人血样均为阴性;与三种动物疟原虫及人白细胞的DNA未出现杂交反应。表明质粒rep20对云南株pf具有高度同源性和特异性,该生物素化探针检测Pf具较高敏感性。     

几种不同方法制备恶性疟原虫基因组DNA的比较

目的　比较３ 种不同的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 提取方法制备恶性疟原虫基因组 Ｄ Ｎ Ａ 的效果。方法　分别采用酚－ 氯仿－ 异戊醇抽提法、 Ｗｉｚａｒｄ 基因组 Ｄ Ｎ Ａ 纯化试剂盒和磷酸钠盐溶液, 分离提取恶性疟原虫基因组 Ｄ Ｎ Ａ, 通过 Ｄ Ｎ Ａ 含量测定和 Ｐ Ｃ Ｒ 鉴定, 比较它们的提取效果。结果　前两种方法制备恶性疟原虫基因组 Ｄ Ｎ Ａ 的效果相仿, 纯度较高; 第三种方法最为简便, 所得的 Ｄ Ｎ Ａ 含量明显高于前两种方法, 但其纯度较低, 蛋白质含量最高。结论　３ 种方法各有优缺点, 第３ 种方法简便、快捷、经济, 更有实用价值。