副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′末端序列测定及分析

目的测定副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′末端序列，分析其前导区～级及二级结构与功能的关系。方法从感染病毒的鸡胚尿囊液中提取总RNA，利用cDNA末端快速扩增（RACE）法分别扩增基因组3′和5′端cDNA片段，并克隆至pGM—T载体中，然后分别测定插入片段的核苷酸序列，用DNAStar软件将测得的3′和5′端前导区序列与GenBank中选取的6株仙台病毒代表株相应序列进行相似性比较及序列比对，用RNAdraw软件预测基因组3′和5′端前导区二级结构并进行比较分析。结果副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′末端非编码区长度分别为119和142个核苷酸，前导区核苷酸序列与6株仙台病毒基因组的相似性分别在89．1％～96．4％和93．0％～96．5％，二级结构与选取的已知仙台病毒株高度相似而且稳定。结论副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′端前导区序列相对保守，可能与病毒复制、转录调控及致病性有关。     

副粘病毒Tianjin株基因组3''和5''末端序列测定及分析

目的 测定副粘病毒Tianjin株基因组3'和5'末端序列,分析其前导区一级及二级结构与功能的关系. 方法 从感染病毒的鸡胚尿囊液中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增(RACE)法分别扩增基因组3'和5'端cDNA片段,并克隆至pGM-T载体中,然后分别测定插入片段的核苷酸序列,用DNAStar软件将测得的3'和5'端前导区序列与GenBank中选取的6株仙台病毒代表株相应序列进行相似性比较及序列比对,用RNAdraw软件预测基因组3'和5'端前导区二级结构并进行比较分析. 结果 副粘病毒Tianjin株基因组3'和5'末端非编码区长度分别为119和142个核苷酸,前导区核苷酸序列与6株仙台病毒基因组的相似性分别在89.1%～96.4%和93.0%～96.5%,二级结构与选取的已知仙台病毒株高度相似而且稳定. 结论 副粘病毒Tianjin株基因组3'和5'端前导区序列相对保守,可能与病毒复制、转录调控及致病性有关.     

cDNA文库基础上运用热启动聚合酶链反应末端延伸快速分离全长cDNA序列

建立一种cDNA文库基础上运用热启动聚合酶链反应末端快速扩增分离人类新基因全长cDNA序列的新技术。以文库载体序列与待扩增目的基因片段为模板各设计引物进行热启动聚合酶链反应扩增，从人胎肝cDNA文库中获得氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞泡沫化过程中差异表达序列标签片段（FRG4）的全长cDNA序列，聚合酶链反应产物克隆到pGEM-T载体中，并测序鉴定，从而成功获得FRG4的全长cDNA序列，该技术是一种快速有效的分离人类新基因全长cDNA序列的方法。     

恶性疟原虫海南株子孢子期SSU rRNA编码基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株子孢子期小亚基核糖体核糖核酸(SSU rRNA)编码基因片段,分析其序列特征.方法 根据恶性疟原虫基因库相关核酸序列设计1对引物,采用PCR方法从海南恶性疟患者血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSU rRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接,构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆经双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAST软件分析其特征.结果 恶性疟原虫子孢子期SSU rRNA基因扩增片段大小约为347bp;阳性克隆重组质粒双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;核酸序列测定显示插入的SSU rRNA基因扩增片段含有347个核苷酸,与GenBank中的恶性疟原虫3D7株相同序列进行比对,其同源性为100%,而与7G8株的同源性则为98.0%,其中第153位碱基发生了缺失,第184位碱基由C取代了T,而第188位T碱基与第189位A碱基为插入碱基,第243位碱基则由T取代了C.结论 成功克隆恶性疟原虫海南株孢子期SSU rRNA编码基因序列,该序列相对保守,不同地理株间存在单核苷酸多态性.     

日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列基因的全长cDNA序列分析

目的 对带有信号序列的日本血吸虫虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列进行分析。方法 根据日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列的cDNA片段序列设计合成基因特异性引物。以虫卵的第一链全长cDNA为模板，采用套式PCR，快速扩增带信号序列的虫卵毛蚴cDNA的5’、3’末端片段，将特异性扩增片段进行TA克隆与序列分析。将每个带信号序列的虫卵毛蚴cDNA片段序列与其5’、3’末端片段序列进行比对和拼接，构建每个带信号序列的虫卵毛蚴基因的完整全长cDNA序列，对部分带信号序列虫卵毛蚴基因的信号序列所对应的基因组序列结构进行分析。结果 本研究分析了30个带有信号序列的cDNA片段，其中16个片段的5’、3’末端cDNA序列被成功扩增，并测定了它们的DNA序列，通过序列比对和拼接，获得了该16个虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列。对开放阅读框演绎的氨基酸序列进行分析，发现基因SjP4001与SjP1531的信号肽序列完全相同，而基因SjP3742和SjP1183的信号肽氨基酸序列甚为相似，从而进一步证明不同的基因可拥有相同或相似的信号肽。基因组序列分析表明，基因SjP1183的信号肽基因序列与成熟肽基因序列通过交替拼接（alternative splicing）方式进行拼接；而基因SjP4001、SjP1531、SjP3742的信号肽基因序列与成熟肽基因序列之间可能是通过转移拼接的方式进行拼接。结论 确定了16个带有信号序列的虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列，虫卵毛蚴基因可通过交替拼接方式或转移拼接方式获得信号肽序列。     

日本血吸虫卵壳蛋白前体基因Sj423的克隆表达及分析

据日本血吸虫菲律宾株编码卵壳前体蛋白的一段230bp的序列设计PCR引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出日本血吸虫中国大陆株相应的基因片段、然后根据测序结果设计一系列引物,用5’RACE和3’RACE法扩增出该基因cDNA的5’和3’端,再根据测序结果设计全长引物,用RT-PCR方法扩增出大小为423bp的片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株卵壳前体蛋白基因的完整阅读框,对相应基因组区段测序证实该基因没有内含子(GenBank登录号:AF519182)。将其克隆到表达载体pET28c(+)中,在大肠杆菌中获得表达,融合表达产物分子量约为20.9 kD。Real-ti me PCR结果显示该蛋白在尾蚴感染宿主后第23d即卵壳形成时高表达。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。     

中国大陆新发现丙型肝炎病毒3'非编码区终止密码子变异

目的获得全长中国大陆1b型丙型肝炎病毒(HCV)3'非编码区(3'UTR)cDNA,并分析一级结构的变异,为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制和开发新的抗HCV药物奠定基础.方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)初步筛选出1例1b型HCV感染者,采用半套式RT-PCR法扩增出约400bp的cDNA片段,克隆测序.结果获得的全长1b型HCV 3'端序列,由高变区、Poly(u)区、Poly(u/c)区及98碱基区4部分组成;首次发现终止密码子突变由TGA突变为TGG,可导致NS5B的翻译不能及时终止.结论半套式RT-PCR法可有效获得病毒基因组的全长末端序列;首次报道终止密码子突变导致NS5B区延长,3'UTR缩短.该发现对了解HCV的复制和翻译机制可能有一定的理论和实践意义.     

山东省丙型肝炎病毒分离株NS5区核苷酸序列分析

目的：了解山东省丙型肝炎病毒（HCV）分离株的基因型及其基因的变异情况，方法：应用德国UBI HCV EIA 4．0诊断试剂盒筛选山东省部分地区64例临床检验为抗－HCV阳性的血清标本，有54例阳性，随意抽取其中28例，应用逆转录套式－聚合酶链反应（RT－nested-PCR)扩增319bp的HCV NS5区基因片段，结果12例出现特异性条带，随后将这12个NS5区片段直接进行T载体克隆，并用Sanger法对克隆成功的10个NS5区基因片段进行序列测定，将所得到的10个序列与GenBank中所有的HCV分离株进行同源性比较。结果：10例山东省部分地区HCV分离株的基因型均属于HCV－1b型，对获得的10个NS5区片段进行是性分析发现，所有的核苷酸变化都是由于替代作用引起的，没有碱基的插入和缺失；大部分的突变属于同义突变，占突变总数的74％。RNA－依赖性RNA聚合酶的G－D－D基序和所有的半胱氨酸都完全保守，结论：本研究证明了HCV－1b型是山东省部分地区主要的基因型。     

丙型肝炎病毒5''端非编码区的5''端序列对其翻译启动活性的影响

目的分析丙型肝炎病毒(HCV)5’端非编码区(5’NCR)的5’端序列对其翻译启动活性的影响。方法用PCR技术扩增获得全长和5’端17个碱基缺失的HCV5’NCR片段,定向克隆至表达质粒pSEAP2Control的SEAP基因上游,分别构建成全长和5’端截短的HCV5’NCR调控SEAP表达的重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP。用脂质体方法将重组质粒转染至肝细胞株QSG7701,并用化学发光法检测SEAP的表达。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP构建成功。表达的发光强度分别为390482±42856和635265±52285RLU,二者有差异显著性(P<0.01)。结论HCV5’NCR的5’端碱基缺失提高了它对SEAP基因的翻译启动活性,为进一步分析HCVIRES的结构提供了实验基础。     

Association with 5'-untranslated region and response to interferon in chronic hepatitis C

BACKGROUND/AIMS: The 5'-untranslated region (5'UTR) of hepatitis C virus (HCV) is a useful region for determinations of genotype and viral load. 5'UTR can be used for simultaneous analysis of HCV genotype and viral load, therefore several assays have been described. A method which used direct sequencing of the 5'UTR can also be used to identify mutations in this region. The objective of the present study was to evaluate possible associations of 5'UTR mutations with responsiveness to interferon (IFN) therapy in chronic hepatitis C patients. METHODOLOGY: Seventy patients with chronic hepatitis C were included in this study. The relations between responsiveness to IFN therapy and HCV genotype, viral load, and 5'UTR mutations before IFN treatment were evaluated. RESULTS: We detected HCV genotype 1a (n = 5), 1b (n = 32), 2a (n = 15), 2b (n = 12), and 3a (n = 6). Forty-eight patients were non-sustained responders (NR). Seven of 37 (18.9%) patients with the 1a or 1b genotype were sustained responders (SR), and 14 of 27 (51.9%) patients with genotype 2a or 2b were SR. Responses of patients with genotype 1 were poorer than those of patients with genotype 2. HCV viral loads of all SR patients infected with genotype la or 1b were less than 100 KIU/mL, but more than 50% of SR patients infected with genotype 2a or 2b had viral loads over 100 KIU/mL. Thus, viral load in patients with genotype 1 is strongly associated with IFN sensitivity. 5'UTR were well conserved, and there were no differences in the distribution of genotypes between SR and NR. CONCLUSIONS: The 5'UTR is a suitable region for determining HCV genotype and viral load, which are predictors of responsiveness to IFN therapy, but specific mutations of the 5'UTR do not appear to be associated with responsiveness to IFN.     

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒E1蛋白反式激活基因

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)E1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVE1蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVE1表达质粒pcDNA3 .1( -) E1转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( -)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成 2组 ,分别与 2种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果　成功构建人HCVE1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 89个阳性克隆 ,进行菌落PCR分析 ,均得到 10 0 10 0 0bp插入片段。挑取 46个含有插入片段的阳性克隆测序分析 ,获得 44个已知基因序列和 2个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录。结论　应用SSH技术成功构建了HCVE1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE1反式调节的靶基因及致肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据     

Transactivating effect of hepatitis C virus core protein： A suppression subtractive hybridization study

AIM: To investigate the transactivating effect of hepatitis C virus (HCV) core protein and to screen genes transactivated by HCV core protein. METHODS: pcDNA3.1(-)-core containing full-length HCV core gene was constructed by insertion of HCV core gene into EcoRI/BarnHI site. HepG2 cells were cotransfected with pcDNA3.1(-)-core and pSV-lacZ. After 48 h, cells were collected and detected for the expression of β-gal by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit. HepG2 cell swere transiently transfected with pcDNA3.1(-)-core using Upofectamine reagent. Cells were collected and total mRNA was isolated. A subtracted cDNA library was generated and constructed into a pGEM-Teasy vector. The library was amplified with E. coil strain JM109. The cDNAs were sequenced and analyzed in GenBank with BLAST search after polymerase chain reaction (PCR). RESULTS: The core mRNA and protein could be detected in HepG2 cell lysate which was transfected by the pcDNA3.1(-)-core. The activity of β-galactosidase in HepG2 cells transfected by the pcDNA3.1(-)-core was 5.4 times higher than that of HepG2 cells transfected by control plasmid. The subtractive library of genes transactivated by HCV core protein was constructed successfully. The amplified library contained 233 positive clones. Colony PCR showed that 213 clones contained 100-1 000 bp inserts. Sequence analysis was performed in 63 clones. Six of the sequences were unknown genes. The full length sequences were obtained with bioinformatics method, accepted by Genl3ank. It was suggested that six novel cDNA sequences might be target genes transactivated by HCV core protein. CONCLUSION: The core protein of HCV has transactivating effects on SV40 early promoter/enhancer. A total of 63 clones from cDNA library were randomly chosen and sequenced. Using the BLAST program at the National Center for Biotechnology Information, six of the sequences were unknown genes. The other 57 sequences were highly similar to known genes.     

人肝细胞癌差异表达基因TCTP的克隆和分析

目的 筛选和鉴定在人肝细胞癌中差异表达的基因。方法 采用抑制性消减杂交技术建立人肝细胞癌eDNA消减文库，通过DNA测序分析、Northern印迹、cDNA末端快速扩增和RT-PCR等方法对其中一个克隆基因加以分析。结果 从所建eDNA消减文库中分离到一个插人子长度为479bp的克隆，该片段含有3’端Poly(A)结构，Northern杂交证明其表达水平在癌组织和肝癌细胞株均显著升高，同时经5’末端快速扩增获得一个长度为865bp的全长cDNA序列，具有一个编码172个氨基酸的完整开放阅读框，与GenBank数据库作同源性分析显示其为已报道的TCTP基因。RT-PCR分析表明TCTP基因在癌组织样本中的扩增水平高于癌旁非癌组织样本。结论‘I'CTP基因的差异表达可能在肝癌发生机制中扮演重要角色。     

抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA，克隆HCV-F蛋白反式激活相关基因。方法 以HCV-F表达质粒pcDNA3．1（-）-F转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HcVF蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200～1000bP插入片段的克隆，随机挑选其中28个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得19种编码基因，其中2个为未知功能的新基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。     

日本血吸虫视黄酸X受体2全长cDNA的克隆及初步分析

目的克隆编码日本血吸虫视黄酸X受体2(SjRXR2)蛋白的全长cDNA,并对其进行初步研究。方法利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得SjRXR2蛋白全长编码cDNA。利用生物信息学技术,对基因结构进行初步分析。利用实时荧光定量(Real time)PCR技术对该基因在日本血吸虫不同时期虫体中的转录情况进行分析。应用在线抗体表位预测软件获得SjRXR2配体结合区抗原性较强的一个多肽序列,合成该多肽片段,并免疫小鼠制备抗血清。利用Western blot技术分析该蛋白在日本血吸虫中的表达。结果采用RACE技术成功获得了SjRXR2蛋白全长编码cDNA,总长度为5 960bp,其完整开放阅读框为4 308 bp,编码1 435个氨基酸,预测分子量为159 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白质序列具有核受体家族2的典型结构域特征,且与曼氏血吸虫RXR2有较高的相似性。Real time PCR分析表明,该基因在21、42 d龄日本血吸虫虫体内有较高的转录水平。Western blot分析表明,小鼠SjRXR2多肽免疫血清可特异性识别日本血吸虫虫体150 kDa蛋白。结论成功获得了编码SjRXR2蛋白的全长cDNA,并制备了针对该蛋白的特异性多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.     

编码日本血吸虫Argonaute 3蛋白全长cDNA的获得及初步研究

目的获得日本血吸虫Argonaute3(Ago3)蛋白的全长编码cDNA并对其初步分析。方法利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得日本血吸虫Ago3蛋白全长编码cDNA,利用原核表达系统对此蛋白片段进行重组表达,采用亲和层析法纯化重组蛋白,并免疫动物制备多克隆抗体。利用Western blot技术分析该蛋白在日本血吸虫中的表达。结果采用RACE获得了日本血吸虫Ago3蛋白编码全长cDNA,长度为2772bp;利用原核表达系统获得了该蛋白片段的重组融合蛋白,并制备了多克隆抗体;Western blot分析表明,该抗体与日本血吸虫全虫蛋白在分子量约为100kDa处具有特异性反应。结论获得了编码日本血吸虫Ago3蛋白的全长编码cDNA,并制备了多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。