Ag85a-卡介苗重组疫苗的构建及鉴定

目的 构建结核分枝杆菌ag85a-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性或治疗性疫苗.方法 通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原Ag85a的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,通过电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗.结果 通过PCR扩增获得约800 bp的ag85a基因,与穿梭表达载体pYUB295重组后,通过PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定表明ag85a基因正确插入到pYUB295质粒中.将重组质粒通过电穿孔导入卡介苗,重组卡介苗在抗性培养基上生长良好.pYUB295-ag85a重组卡介苗基因组DNA的PCR扩增以及培养上清液的PAGE电泳表明:ag85a-卡介苗重组疫苗构建正确,Ag85a蛋白在卡介苗中分泌表达.结论 成功构建了ag85a-卡介苗重组疫苗.     

LMP-3功能区真核表达质粒的构建

目的:构建LMP-3功能区真核表达重组质粒.方法:设计合成LMP-3活性区引物,应用PCR方法,扩增其基因片段,亚克隆至真核表达质粒pEGFP-N1,最终构建重组表达质粒pEGFP-N1-LMP-3,同时进行酶切鉴定和测序.结果:PCR扩增LMP-3基因序列正确,构建的重组表达质粒pEGFP-N1-LMP-3经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切及测序鉴定正确.结论:成功获得真核表达重组质粒pEGFP-N1-LMP-3,为进一步研究其成骨功能奠定基础.     

结核分支杆菌HSP70原核表达载体的构建和表达及蛋白纯化

目的：构建结核分支杆菌HSP70原核表达载体并诱导其表达和纯化及鉴定目的蛋白。方法：利用PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增出Mtb HSP70 DNA序列，构建重组质粒pGEM-Mtb HSP70，经酶切、PCR和测序鉴定后，将Mtb HSP70基因亚克隆到原核表达质粒PQE30，构建重组表达质粒PQE30-Mtb HSP70，在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层析的方法纯化目的蛋白，Western blotting杂交鉴定纯化蛋白。结果：经测序证实，获得的目的基因与GenBank中公布的结核杆菌Mtb HSP70基因序列一致。构建的原核表达载体PQE30-Mtb HSP70在大肠杆菌M15中经1 mmol•L^-1 IPTG诱导后表达出相对分子质量约为70 400的蛋白，镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Western blotting,在相对分子质量约70 400处可见特异性着色带。结论：成功构建原核表达载体PQE30-Mtb HSP70，并成功诱导Mtb HSP70蛋白的 表达，通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的Mtb HSP70蛋白。     

结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定。酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体。结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。     

结核分枝杆菌毒素蛋白 higB 的原核表达及分析

目的：克隆编码结核分枝杆菌毒素基因higB并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higB基因;构建重组表达质粒pET-32a（＋）-higB;筛选出阳性重组质粒后转化大肠杆菌,诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果成功扩增出了higB基因,克隆于载体pET-32 a（＋）质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后higB蛋白没有发生表达。结论已成功构建结核分枝杆菌毒素基因higB的原核表达载体,但大肠杆菌BL21不能表达出higB蛋白。     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT—6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的：构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT－6的重组卡介苗，方法：分别以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板。通过PCR扩增得到的117bp的BCGα抗原（α－Ag)信号肽序列和285bp的结核杆菌esat-6基因序列，将esat-6基因与大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组，得到重组质粒pME,再将BCGα－Ag信号肽序列克隆至pME中，得到重组质粒pSME。结果：质粒pSME用双酶切和PCR扩增鉴定证实，克隆基因α-Ag信号肽序列和esat-6正确插入载体pMV261，结论：重组质粒pSME可望在BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT－6，该质粒的构建成功为改造卡介苗，发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85A编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVAXl中，转化大肠杆菌DH5α，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，用Ag85A引物PER扩增出1041bp特异性片段，以重组子DNA为模板用Ag85A引物PCR扩增为阳性，重组子经限制性内切酶消化后可见目的片段，所测定序列与报道的Ag85A序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株，该DNA疫苗的免疫效果有待进一步研究。     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT-6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的　构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法　分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列。将 esat- 6基因与大肠杆菌 -卡介苗穿梭质粒载体 p MV2 6 1重组 ,得到重组质粒 p ME。再将 BCGα- Ag信号肽序列克隆至 p ME中 ,得到重组质粒 p SME。结果　质粒 p SME用双酶切和 PCR扩增鉴定证实 ,克隆基因 α- Ag信号肽序列和 esat- 6正确插入载体 p MV2 6 1。结论　重组质粒 p SME可望在 BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白 ESAT- 6 ,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础     

分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6重组卡介苗构建研究

目的构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法，体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因，插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000，构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，用电穿孔法将pBCG3000-CFPIO-ESAT6质粒转化BCG细胞，得到重组卡介苗，热诱导表达CFPIO—ESAT6融合蛋白，SDS—PAGE电泳观察CFP10-ESAT6融合蛋白的表达，Western blot鉴定其生物活性。结果经PCR、酶切及测序鉴定，证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，经热诱导表达出约22kDa的CFP10-ESAT6蛋白，可分别被鼠抗ESAT6血清、鼠抗CFP10血清识别。结论分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗构建成功。     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.     

分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗的构建和表达

目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PCR分别扩增出结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B的全编码序列及ESAT-6基因,然后将两基因融合插入pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6分泌性表达质粒。用电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗。重组卡介苗经热诱导后,SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白85B-ESAT-6的表达及其免疫学活性。结果通过PCR、酶切以及测序鉴定,pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒构建完全正确,SDS-PAGE电泳未能直接观察到表达的融合蛋白条带,用ESAT-6蛋白的多抗血清通过Westernblotting证实了该蛋白主要分泌性表达于胞外并具有免疫学活性。结论分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗构建成功。     

微小隐孢子虫重组BCG-CP15／60-23疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定微小隐孢子虫CP15／60—23基因重组卡介苗。方法以pET-30a-CP15／60-23质粒为模板，PCR扩增CP15／60—23基因片段，然后克隆至TA载体；通过酶切、测序鉴定后，将CP15／60—23基因片段用限制性内切酶切下定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262结核杆菌热休克蛋白（HSP）启动子下游，构建重组质粒pMV262-CP15／60—23，用电穿孔将该质粒导入野生卡介苗（BCG—WT）构建微小隐孢子虫CP15／60—23基因重组卡介苗。结果扩增出792bp的微小隐孢子虫CP15／60—23基因片段，成功构建pMV262-CP15／60—23质粒，并通过PCR扩增和提取质粒、酶切等表明该质粒被正确导入BCG—WT中。结论成功构建微小隐孢子虫CP15／60—23基因重组卡介苗，为研究隐孢子虫病新的防治方法打下了基础。     

血吸虫重组卡介苗—Sj20GTST疫苗的构建及免疫原性的研究

目的 构建含日本血吸虫相对分子质量为２６０００的抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因的 且卡介菌（ＲＢＣＧ）疫苗,观察其对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的免疫保护作用。方法 采用分子生物学技术,将Ｓｊ２６ＧＳＴ ｃＤＮＡ克隆到人结核杆菌热休克蛋蛋白（ＳＨＰ）７０启动子下游,构成融合基因,再将事基因亚克隆到Ｅ,ｃｏｎｌｉＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ）疫苗,经热诱导,在ＢＣＧ中Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原。用ｒＢＣ     

卡介苗穿梭表达质粒pMSIL-2的构建及鉴定

目的 构建分泌性表达白介素(IL)-2的重组卡介苗(BCG)。方法 分别以BCG和IL-2cDNA为模板，通过PCR扩增得到约117bp的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和399bp的IL-2基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列克隆至大肠杆菌-BCG穿梭质粒pMV261，得到重组质粒pMS。再将IL-2基因克隆至pMS中，得到重组质粒pMSIL-2。结果 质粒pMSIL-2经双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实，克隆基因BCG-Ag85B信号肽和IL-2正确插入载体pMV261。结论 重组质粒pMSIL-2可望在BCG中分泌性表达细胞因子IL-2，该质粒的构建成功为改造BCG、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础。     

The Construction of Schistosoma Japonicum Vaccine BCG Sj26GST and Its Identification

Ｖａｃｃｉｎｅｓａｒｅｔｈｅｍｏｓｔｅｃｏｎｏｍｉｃａｎｄｅｆ－ｆｅｃｔｉｖｅｔｏｏｌｓｉｎｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｄｉｓｅａｓｅｓ．ＢＣＧｈａｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇｕｎｉｑｕｅｆｅａｔｕｒｅｓ：Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｃａｎｂｅｕｓｅｄｉｎｉｍｍｕｎｉｔｙｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｘｐｅｒｉ－ｍｅｎｔｄｉｒｅｃｔｌｙｗｉｔｈｏｕｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏ－ｃｅｄｕｒｅｉｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｃｈｅａｐ;ｓｉｍｐｌｅｏｎｅｖａｃ－ｃｉｎａｔｉｏｎｃａｎｉｎｄｕｃｅｉｍｍｕｎｉｔｙｃｏｎｔｉｎｕ…     

Molecular cloning and expression of the immunodominant protein Ag85A from Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain]

OBJECTIVE: To provide the target gene and target antigen for the development of new vaccine against tuberculosis. METHODS: According to the gene sequence encoding protein Ag85A from Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain, we designed a pair of oligonucleotide primers, obtained the gene by using polymerase chain reaction, and inserted the gene into the BamH I and EcoR I site of plasmid pBK-CMV to construct recombinant plasmid, and after that, the recombinant plasmid was transferred into E. coli XL1-Blue MRF' and induced with IPTG. The expression product of the gene was analyzed by using SDS-PAGE and western-blotting. RESULTS: The gene encoding the protein Ag85A of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain was successfully amplified by using PCR. A recombinant shuttle plasmid was constructed. The recombinant plasmid stably expressed recombinant Ag85A protein relative molecular mass 32 x 10(3) in E. coli XL1-Blue MRF'. CONCLUSION: A recombinant plasmid which contains the gene encoding the protein Ag85A of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain has been successfully constructed. The recombinant plasmid can stably express recombinant protein relative molecular mass 32 x 10(3) in E. coli XL1-Blue MRF'. These results could serve as a basis for further studies on the usefulness of the gene and its expression product in the development of new vaccine against tuberculosis.     

卡介苗穿梭表达质粒pMS MCP-1的构建与鉴定

目的:构建分泌性表达单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的重组卡介苗。方法:分别以卡介苗(BCG)和MCP-1cDNA为模板,通过PCR扩增得到120bp的BCG Ag85B信号肽序列和300bp的MCP-1基因序列。将BCG Ag85B信号肽序列插入大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒pMV261,得到重组质粒pMS。再将MCP-1基因序列克隆至pMS中,得到重组质粒pMS MCP-1。结果:质粒pMS MCP-1用双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因BCG Ag85B和MCP-1正确插入载体pMV261。结论:重组质粒pMS MCP-1可望在BCG中分泌性表达细胞因子MCP-1,从而协同加强对肿瘤的杀伤作用,该质粒的成功构建为改造卡介苗、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础。