豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后iNOS活性与细胞凋亡关系

目的：探讨椎基底动脉缺血再灌注耳蜗组织损伤方式及可能的损伤机制。方法：健康豚鼠72只，随机分成正常组、假手术组、模型组，每组各8只。用组织化学方法观察缺血再灌注不同时间耳蜗各部位的组织改变；用免疫组织化学法（ABC）检测各组动物耳蜗中诱导型一氧化氮合酶的表达和变化；用原位凋亡法（TUNEL法）观察耳蜗的细胞凋亡情况。结果：缺血再灌注的内外毛细胞变形缺损、血管纹变薄等；诱导型一氧化氮合酶在缺血及再灌注的表达增强；正常组及假手术组没有或仅有个别部位出现细胞凋亡，缺血及再灌注各组内外毛细胞及螺旋神经节部位凋亡细胞明显增多。结论：再灌注期间细胞凋亡数较缺血期间明显增多，其原因为包括一氧化氮在内的多种氧自由基表达增高所致。     

豚鼠脑缺血再灌注损伤后螺旋神经节细胞形态改变及BDNF的表达

目的 观察豚鼠脑缺血再灌注损伤(IRI)后螺旋神经节细胞形态、结构的改变和脑源性神经营养因子(BDNF)表达的变化,探讨BDNF对脑IRI后螺旋神经节细胞的营养保护作用.方法 将48只健康豚鼠随机分成正常组、假手术组和IRI 6 h、12 h、24 h、48 h组,用灼断两侧椎动脉、夹闭一侧颈总动脉的方法建立豚鼠IRI模型.光镜下观察螺旋神经节的病理改变,透射电镜观察螺旋神经节细胞超微结构的改变;免疫组织化学法和Western blot检测BDNF表达部位和表达量的变化.结果 光镜和透射电镜观察表明脑IRI导致螺旋神经节细胞数量减少和细胞损伤,IRI 24 h细胞的损伤最为严重;Western blot检测显示各组豚鼠螺旋神经节细胞都有BDNF表达,正常组、假手术组分别为0.390±0.021和0.381±0.019,两组表达差异无统计学意义(P＞0.05),IRI6h组(0.423±0.041)表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05),随后各组表达量减少,IRI 24 h组最少(0.218±0.081),差异有统计学意义(P＜0.05);免疫组织化学法与Western blot检测结果一致,并显示BDNF表达部位在细胞浆.结论 脑IRI可导致耳蜗螺旋神经节细胞损伤和BDNF表达量的改变,BDNF可能参与了 IRI引发的螺旋神经节细胞损伤的病理过程.     

豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后FasL蛋白的表达及其与细胞凋亡的关系

目的探讨豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后细胞凋亡的情况、凋亡相关蛋白FasL表达的改变以及二者之间的关系。方法健康豚鼠40只随机分成正常组、假手术组和模型组,模型组再分为缺血30min、再灌注6h及24h三组。用组织化学方法观察缺血及再灌注不同时间段耳蜗各部位的组织学改变,用免疫组织化学法检测内耳FasL的表达,用原位凋亡法(TUNEL法)检测内耳细胞凋亡的情况。结果正常组、假手术组内耳罕见凋亡细胞,FasL为弱阳性表达;模型组Corti器、血管纹、螺旋神经节在缺血及再灌注每个时间段均有细胞凋亡,FasL为阳性表达,与正常组比较明显增多(<0.05)。结论 FasL参与了豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后细胞凋亡的发生。     

大鼠全脑缺血再灌注后内耳细胞凋亡与NGF、p75的动态表达

采用大鼠全脑缺血再灌注模型,用原位缺口末端标记法(TUNEL)检测缺血再灌注不同时间内耳的细胞凋亡情况,通过免疫荧光染色观察内耳细胞神经生长因子(NGF)与其低亲和力受体p75的表达和变化,并用透射电镜观察各组大鼠内耳细胞超微结构的改变,探讨NGF与p75在缺血再灌注诱导内耳细胞凋亡过程中的作用。结果显示:再灌注3d时内耳Corti器出现毛细胞凋亡,同时伴有p75与NGF的过表达;随着缺血再灌注时间延长,P75和NGF表达逐渐增强又逐渐减弱。结果提示:p75和NGF参与了脑缺血再灌注诱导的内耳延迟性毛细胞凋亡的过程,p75与NGF的过表达可能起了促进内耳感觉细胞凋亡的作用。     

豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后Fas蛋白的表达及其与细胞凋亡的关系

目的:研究豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后凋亡相关蛋白Fas蛋白表达,以及与细胞凋亡的关系.方法:健康豚鼠随机分成正常组、假手术组、模型组.组织学方法观察缺血再灌注不同时间点耳蜗各部位的组织学改变;免疫组织化学法检测内耳Fas的表达;原位凋亡法(TUNEL法)观察耳蜗缺血及不同时间段内再灌注的细胞凋亡情况.结果:正常组及假手术组没有或仅有个别部位出现细胞凋亡,Fas为弱阳性表达;模型组Corti器、血管纹、螺旋神经节在每个时间点上均有细胞凋亡,Fas为阳性表达.结论:Fas的过度表达可能是耳蜗缺血再灌注后细胞凋亡的重要原因.     

丹参对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后细胞凋亡及Fas表达的蛋白影响

目的:探讨丹参对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury I/RI)后细胞凋亡及Fas蛋白表达的影响.方法:健康豚鼠72只,雌雄不拘.随机分成正常组、假手术组、丹参干预假手术组、模型组和干预组(术前腹腔注射丹参注射液,每天一次共7d),后两组各在缺血30min、再灌注6h及24h取材.用组织化学方法观察缺血及再灌注不同时间段耳蜗各部位的组织学改变;用免疫组织化学法检测内耳Fas的表达;用原位凋亡法(TUNEL法)检测内耳细胞凋亡情况.结果:正常组、假手术组、丹参干预假手术组内耳罕见调亡细胞,Fas为弱阳性表达;模型组Corti器、血管纹、螺旋神经节在缺血及再灌注每个时间点均有细胞凋亡,Fas为阳性表达,与正常组比较有统计学意义(P＜0.05);干预组Corti器、血管纹、螺旋神经节在缺血及再灌注每个时间点均有细胞凋亡,Fas为阳性表达,程度较模型组减弱.与模型组比较有统计学意义(P＜0.05).结论:Fas参与了耳蜗I/RI后细胞凋亡的发生,丹参可能通过抑制Fas蛋白的表达使凋亡细胞减少而对I/RI后的耳蜗起保护作用.     

缺血预处理诱导脑缺血再灌注损伤后Bcl-2及Bcl-xl表达

目的 探讨调亡抑制基因Bcl-2及Bcl-xl在缺血预处理（IPC）对海马CA1区神经元细胞保护中的作用。方法 利用大鼠四血管阻断及再通建立前脑缺再缺血灌注损伤模型,采用尼氏染色光镜观察、流式细胞术、免疫组织化学等技术,观察缺血预处理海马CA1区神经元病理组织学改变、细胞凋亡面分率有Bcl-2及Bcl-xl蛋白表达的情况。结果 1、大鼠前脑缺血再灌注引起海马CA1区部分神经元发生调亡。2、IPC可明显地减少缺血再灌注损伤后调亡的神经元数目,产生细胞保护作用。3、IPC可诱导缺血再灌注损伤早期缺血敏感神经元中Bcl-2和Bcl-xl蛋白表达。结论 抑制神经元调亡发生可能IPC对缺血再灌注损伤起保护作用的机制之一。     

地塞米松对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

目的:研究地塞米松对缺血再灌注损伤及细胞凋亡的防治作用。方法:健康豚鼠,随机分成正常组、假手术组、地塞米松干预后假手术组、模型组和干预组(地塞米松术前腹腔注射)。后2组各在缺血30 min、再灌注6 h及24 h取材。用TUNEL法观察耳蜗缺血及不同时间段内再灌注的细胞凋亡情况,并与地塞米松干预后进行比较。结果:干预组的螺旋神经节及螺旋器(Corti器)较模型组在每个时间点上凋亡小体减少。结论:地塞米松可通过抑制诱导型一氧化氮合酶使凋亡细胞明显减少。     

脑缺血再灌注损伤后神经细胞增殖相关因子基因的表达

目的：观察大鼠脑缺血再灌注后神经细胞巢蛋白、干细胞因子（SCF）和神经细胞粘附分子（NCAM）基因的表达。方法：成年SD大鼠,以线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型,随机分为缺血1．5h再灌注2h～14d组和假手术组。原位杂交技术检测脑缺血再灌注后脑组织巢蛋白SCF和NCAM mRNA的表达。结果：脑缺血再灌注后,巢蛋白mRNA表达在大部分时相点,均明显高于假手术组。SCF mRNA的表达除早期时相点外,均明显高于假手术组。NCAM mRNA于再灌注2h后开始表达,12h～1d达高峰,7d后逐渐减少,14d降至假手术组水平。结论：脑缺血再灌注后SCF mRNA表达可能具有促进神经干细胞增殖作用,NCAM表达可能参与了损伤后脑组织的修复过程。     

高血脂对脑缺血再灌注损伤大鼠Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

目的:通过检测大脑皮质内Bcl-2和Bax蛋白的表达,探讨高血脂加重脑缺血再灌注损伤的可能机制.方法:高脂饲料喂养建立高脂血症动物模型,线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型.神经行为学评分观察大鼠神经行为改变、TTC染色检测梗死灶体积、免疫印迹检测Bcl-2和Bax的表达.结果:与假手术组比较,单纯脑缺血再灌注组和高血脂合并脑缺血再灌注组Bcl-2和Bax表达增加,并随再灌注时间的延长表达逐渐增加,再灌注24 h时达高峰,而后又降低.相同再灌注时间点,与单纯脑缺血再灌注组比较,高血脂合并脑缺血再灌注组Bcl-2减少但Bax增加.结论:高血脂可通过影响Bcl-2和Bax蛋白的表达,使Bcl-2/Bax值降低,加重脑缺血再灌注损伤.     

黄芪对脑缺血再灌注损伤c-fos表达和细胞凋亡的影响

目的探讨黄芪注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的保护作用。方法采用线栓法阻断大鼠一侧大脑中动脉(MCA)血流2h,再灌注24h制成局灶性脑缺血再灌注损伤模型。将24只Wistar雄性大鼠随机分成假手术组、缺血再灌注组、黄芪组。造模前1h时黄芪组给与黄芪200mg/kg腹腔注射。假手术组、缺血再灌注组给予等剂量生理盐水。再灌注24h后断头取脑、切片,进行HE染色、c-fos免疫组化染色和细胞凋亡检测。结果缺血2h再灌注24h后,黄芪组和缺血再灌注组大鼠缺血侧皮层可检测到细胞凋亡细胞,黄芪组凋亡细胞数明显少于缺血再灌注组,假手术组未见凋亡细胞;黄芪组和缺血再灌注组大鼠缺血侧皮层c-fos阳性细胞数均高于假手术组,与缺血再灌注组相比,黄芪组大鼠缺血侧皮层c-fos表达降低。结论黄芪可抑制缺血再灌注损伤后缺血侧皮质的细胞凋亡。     

高血脂对大鼠脑缺血再灌注损伤后海马内bFGF表达的影响

目的:研究高血脂对大鼠脑缺血再灌注损伤后海马内碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响。方法:高脂饮食建立高血脂模型。以线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞的局灶性脑缺血再灌注模型,采用蛋白印迹和神经行为学相结合的方法,观察缺血再灌注侧海马内bFGF的表达及其意义。结果:与假手术组比较,脑缺血再灌注组bFGF的表达均增高,其变化趋势均为1 d有所升高,3 d达高峰,7 d后下降。在相同再灌注时间点内与脑缺血再灌注组比较,高血脂合并脑缺血再灌注组bFGF的表达减少。结论:脑缺血再灌注损伤后bFGF的表达是呈动态变化的。高血脂可能影响bFGF的分泌。     

高血脂对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮质基质金属蛋白酶9表达的影响

目的:研究高血脂对脑缺血再灌注损伤后大脑皮质基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的影响,探讨高血脂加重脑缺血再灌注损伤的机制。方法:高脂饲料喂养和线栓法分别建立高血脂动物模型和局灶性脑缺血再灌注模型,采用蛋白印迹、TTC染色、EB染色以及神经行为学评分,检测MMP-9的表达和脑梗死体积、血脑屏障通透性及神经行为的变化。结果:与假手术组比较,单纯脑缺血再灌注组和高血脂合并脑缺血再灌注组大脑皮质MMP-9表达增加,再灌注2 h时开始增加,24 h时达高峰,48、72 h时降低。相同再灌注时间点,与单纯脑缺血再灌注组比较,高血脂合并脑缺血再灌注组大脑皮质MMP-9表达明显增加,且脑梗死体积、血脑屏障通透性及神经行为评分均明显升高。结论:高血脂可通过上调大脑皮质MMP-9的表达而加重脑缺血再灌注损伤。     

半胱氨酸蛋白酶-3抑制剂对大鼠缺血再灌流脑区神经元凋亡的影响

目的探讨半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)抑制剂z DEVD fmk对大脑皮层缺血再灌流区神经元凋亡的影响。方法制备大脑中动脉栓塞再灌流大鼠模型,于再灌流前向治疗组缺血侧脑室注射z DEVD fmk(7μg/kg)。采用Western印迹分析、TUNEL和免疫组织化学染色(SPAB法)等方法,检测各组颞顶叶皮层缺血再灌流区caspase3表达和活化、多(ADP核糖)聚合酶(PARP)表达和切割灭活及神经元凋亡。结果未治疗组(A组)、二甲基亚砜对照组(B组)、z DEVD fmk治疗组(C组),再灌流1h及24h缺血脑区的caspase3前体含量分别为16.7±3.0、11.5±3.0、47.5±3.5及76.1±3.5、71.3±6.4、88.2±5.5;12000caspase3切割片段含量分别为8.2±2.3、9.4±1.2、4.3±1.6及59.0±6.3、60.5±7.2、17.3±2.8;PARP含量分别为12.6±3.0、13.9±2.0、53.7±4.1及67.5±8.6、61.1±6.6、93.6±4.1;24000PARP切割片段含量分别为6.0±0.7、6.6±1.2、3.6±1.1及27.4±2.6、25.8±3.2、12.1±2.8(相对灰度值);凋亡神经元密度分别为83.3±7.5、84.3±5.7、45.7±4.0及197.4±11.8、185.2±11.2、99.1±5.8(个/0.1mm2,x±s)。3组各自再灌流不同时间点缺血脑区以上5种指标的差异均有统计学意义(P<0.05～0.001);C组再灌流各时间点缺血脑区以上5种指标与A组及B组对应时间点比较,差异也均有统计学意义(P<0.05～0.001),但A、B两组间比较差异无统计学意义(P>0.05);各组再灌流不同时间点这5种指标的变化彼此间均呈正相关(r=0.630～0.942,P<0.01)。各组缺血再灌流脑区表达PARP的细胞主要是神经元,但3组间比较其密度差别不大。结论再灌流激发的caspase3表达和活化异常增加使PARP过度切割灭活,是再灌流导致缺血脑区受损神经元凋亡的重要分子机制;z DEVD fmk可通过抑制caspase3活性和自活化,减少PARP切割灭活,阻止受损神经元凋亡。