实时荧光PCR方法在A型流感病毒检测中的应用

目的比较流感病毒实时荧光PCR检测(FQ-PCR)方法与常规细胞培养、血凝试验及分型鉴定在流感病毒鉴定中的优劣,以期建立能快速简便、特异地从临床标本中检测并鉴定流感病毒的新方法。方法对76株不同型别的流感病毒分离株进行鉴定,比较两种检测方法的敏感性和特异性;对2倍梯度稀释的A型流感病毒(H1N1亚型、H3N2亚型,各1株)用FQ-PCR方法进行灵敏度检测,同时用常规细胞培养法进行病毒增殖,用血凝试验判断病毒滴度。另外,对临床采集的684份咽拭子样本直接检测,并同时进行常规培养、血凝试验及Quidel试剂检测,综合比较两种监测方法之间的差异。结果在76株流感病毒阳性细胞培养液中,FQ-PCR方法检出A型60份,同分型结果相吻合。FQ-PCR方法的灵敏度约高出常规培养法的25～26倍,无非特异性反应。结论流感病毒FQ-PCR方法具有简便快捷、特异、敏感的特点。     

2002～2003年南京地区流感病毒的分离与分子生物学鉴定

目的:从南京流感样患者中分离流感病毒并通过分子生物学方法鉴定,为研究南京地区流感病毒基因变异特点提供基础。方法:将流感样患者咽拭子接种狗肾传带细胞,筛选血凝阳性细胞培养上清,以甲、乙型流感病毒型及甲1、甲3亚型特异性引物通过RT-PCR方法鉴定并分型和亚型,用血凝抑制试验证实。结果:13份标本中血凝阳性为8份,甲型流感病毒型特异性引物RT-PCR扩增结果4株为阳性,且均为甲3型;乙型流感病毒型特异性引物RT-PCR结果2株为阳性。血凝抑制试验支持此结果。结论:从南京地区流感样患者中成功地分离并鉴定了6株流感病毒。     

实时荧光定量PCR法在急性呼吸道传染病病原筛查中的应用

目的利用实时荧光定量PCR法筛查和鉴定某战区发热伴呼吸道症状病例的呼吸道病毒感染情况,为部队呼吸道传染病疫情的早期预警和防控提供科学依据。方法采集某战区发热伴呼吸道症状病例咽拭子标本,采用实时荧光定量PCR法对标本进行流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒5类常见呼吸道病毒及其亚型的检测和鉴定,评价该方法在呼吸道病毒检测中的应用价值。结果利用实时荧光定量PCR法在采集的488份咽拭子标本中筛查出了240份甲型流感病毒阳性标本(其中季节性流感H3亚型71份,其它分型未检出)、7份乙型流感病毒阳性标本,未检出副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒。结论实时荧光定量PCR法可以对呼吸道病毒进行快速、特异、准确的筛查和鉴定,科学指导部队对呼吸道传染病疫情进行早期防控和预警预测。     

流感病毒抗原快速检测与real-time RT PCR的比较

目的介绍一种可同时检测甲型、乙型流感病毒的快速方法,便于及早确诊流感病原体。方法采用快速抗原法对2014年1月—2015年12月收集的632份流感样患者标本进行甲型、乙型流感病毒抗原检测,并对其中102份进行real-time RT PCR检测。结果快速抗原法检测到样本中甲型流感病毒阳性14例,乙型流感病毒阳性10例。real-time RT PCR法检测到甲型流感病毒阳性15例,乙型流感病毒阳性12例。快速抗原法针对甲型流感病毒诊断灵敏度93.3%,特异度100.0%;针对乙型流感病毒,诊断灵敏度83.3%,特异度100.0%,耗时15 min,明显少于real-time RTPCR法的3 h。结论采用快速抗原法可及早筛查甲型、乙型流感标本。     

2017-2018年内蒙古乌兰察布市流行性感冒病原学监测结果分析

目的了解2017年4月～2018年3月乌兰察布市流行性感冒(简称流感)的病原学特点,为流感防控工作提供依据。方法利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Real-time PCR)方法,检测流感监测哨点医院送检的流感样病例(influenza-like illness,ILI)咽拭子标本,阳性标本接种狗肾细胞(Madin-daiby canine kidney cells,MDCK)进行分离,采用血凝集抑制试验(Hemag-glutination Inhibition Assay,HIA)鉴定流感病毒的型别。结果共检测ILI咽拭子标本核酸548份,阳性97份,阳性率为17. 70%,其中新甲H1N1型63份(64. 95%)、B型Yamagata 24份(24. 74%)、季节性H3亚型10份(10. 31%);培养鉴定出43株流感病毒,阳性率为7. 85%;核酸检测阳性率高峰值在冬春季(11月～次年3月);流感样病例采集和流感病毒核酸检测阳性数构成比最多的为0～5岁组(42. 27%),阳性率最高的为6～17岁组(26. 05%);不同性别流感病毒核酸检测阳性率差异无统计学意义(χ~2=0. 05,P=0. 819)。按照时间、年龄组、性别分析,病毒分离鉴定的结果与核酸检测的结果基本一致。结论乌兰察布市流感病毒优势毒株为新甲H1N1型,A型H3N2亚型和B型Yamagata系也有出现;防控重点人群为学前儿童、老人,防控重点季节为冬春季。应不断加强病原学监测,根据监测情况及时接种流感疫苗是预防流感的重要措施。     

分子流行病学调查在一起流感暴发疫情控制中的应用

目的调查分析深圳市某大型企业流感暴发的原因和特点,为流感暴发疫情的监测和控制提供科学依据。方法对流感样病例（ILI）进行流行病学调查,采集患者咽拭子以胶体金法和荧光定量RT-PCR检测流感病毒,采用鸡胚和MDCK细胞分离病毒,采用常量半加敏抑制试验（HI）鉴定病毒,微量半加敏抑制试验测定抗体。结果ILI总罹患率为1．05％,以二分厂罹患率较高,女性罹患率远高于男性,发病年龄以15～岁组居多。15份咽拭子样品中,荧光定量RT—PCR法A型流感病毒核酸阳性15份。培养分离鉴定出2株H3N2亚型流感病毒。血凝抑制试验检测H3亚型流感抗体,9份急性期和恢复期血清抗体滴度呈4倍以上增长。结论该起暴发疫情由H3N2亚型流感病毒引起,采用分子流行病学调查、制定针对性措施对疫情控制有重要的意义。     

实时荧光PCR检测B型流感病毒方法的建立及病毒培养法验证

目的建立B型流感病毒实时荧光PCR检测(FQ-PCR)法,并与常规病毒培养法比较,判断二者结果的相关性,确定两种检测方法各自更适合的应用领域。方法建立FQ-PCR法并对76株经Quidel胶体金试纸条鉴定型别的流感病毒分离培养株进行检测,比较其敏感性和特异性。21～223梯度稀释的B型流感病毒分别用FQ-PCR法和病毒培养法进行检测,记录FQ-PCR的Ct值及培养物的血凝效价,并对FQ-PCR阳性但血凝无效价的梯度进行盲传,再次检测HA效价,比较二法的灵敏度及相关性。对临床采集的881份咽拭子标本做FQ-PCR检测,同时进行病毒培养并盲传、血凝试验及Quidel胶体金试纸条分型,综合比较两种检测方法之间的差异。结果在76株已知流感病毒标本中,FQ-PCR方法检出B型16份,与Quidel胶体金分型结果相符。FQ-PCR方法的灵敏度约高出常规培养法的25～26倍。FQ-PCR法对临床咽拭子的检测灵敏度高,无非特异性反应。结论流感病毒FQ-PCR法具有与组织培养法一致的特异性,前者操作简便快捷,灵敏度更高,在流感病毒临床快速检测和鉴定中具有更广阔的应用前景。     

1996～1997年江西省南昌地区流感监测

为了监测流感动态确定优势病毒株,在江西省南昌地区进行了流感病毒分离和鉴定研究。从1996年5月～1997年4月共采取感冒病人鼻咽拭子1440份,全部用双腔接种法接种鸡胚,部分标本又进行细胞培养。采用血凝抑制试验（HAI）鉴定病毒株的型及亚型,对细胞培养获得的20株病毒同时应用间接免疫荧光试验（IFA）鉴定病毒株的型别,取HAI法检测为甲型的任意20株进行多聚酶链反应（PCR）试验。结果：共分离得流感病毒47株,其中,甲1型（H1N1）26株,占55．32％;甲3型（H3N2）10株,占21．28％;乙型（B）11株,占23．4％,优势流行株是甲1型,发现了甲1、甲3、乙型在同一地区同时流行的现象,也发现了“O”相毒株。因流感病毒的变异均局限在量变范围内,预计短期内没有大流行的危险。IFA法PCR试验结果全部与HAI法一致,故结论可靠,IFA、PCR法也是快速准确鉴定流感病毒的好方法。     

深圳南山区2005年流行性感冒病原学监测分析

目的了解流感病毒的流行情况，探讨流感流行规律，为制订流感控制措施提供依据。方法对辖区监测门诊及疫情点的疑似流感样病例采集咽拭子标本，接种狗肾传代细胞（MDCK）培养进行流感病毒分离及进行血凝试验，并对阳性者进行血凝抑制试验进行分型鉴定。结果全年检测流感样标本与咽拭子标本共480份，分离出流感病毒64株，分离率13．33％。分别为H1N1亚型9株、H3N2亚型44株、B型11株。结论2005年深圳市南山区是以H3N2亚型流感病毒流行为主，九月份以H3N1亚型和B型流感流行为主。     

定量实时PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒

目的:对采集来的疑似甲型H1N1流感患者咽拭标本进行核酸检测,不断摸索快速检测流感的PCR方法。方法:实验方法按照WHO标准的实时PCR(Real-time PCR)检测法操作,选取343份疑似甲型H1N1流感咽拭子采用实时定量核酸检测和快速分型。结果:在343份咽拭子标本检测结果中,甲型H1N1流感病毒核酸阳性为52份,阳性率15.16%,乙型流感病毒阳性11份,甲3型流感病毒阳性13份,甲1型流感病毒未检出。结论:实时PCR技术操作方法简便、耗时短、特异性强、灵敏度高,是一种适合应用于甲型H1N1流感病毒可靠、快速诊断的检测方法。     

2012—2013年葫芦岛市流感病原学检测分析

目的通过对2012—2013年葫芦岛市流感病原学检测分析,了解当地流感毒株变异情况以及流感病原学的特征,为流感疫情防控提供科学依据。方法采集流感样病例（ILI）的咽拭子标本用狗肾细胞（MDCK）进行流感病毒检测,病毒分离后采用血凝试验方法（HA）判断是否有病毒存在,血凝抑制方法（HI）进行流感病毒型别鉴定。结果2012年4月-2013年3月共检测流感病例（ILI）咽拭子样本335份,分离到流感病毒107株,阳性率31．94％,其中新甲型H1N1共11株、H3N2型96株。结论葫芦岛市流感病毒在2012—2013年以H3N2型为主,与全国亚型吻合,未发现变异毒株。     

568份疑似甲型H1N1流感病例标本病原学检测结果分析

目的对河池市568份疑似甲型H1N1流感病例标本进行核酸检测,为甲型H1N1流感疫情的防控提供依据。方法对疑似甲型H1N1流感病例标本用实时荧光定量RT-PCR法（Real-time RT-PCR）检测,检测项目为A型流感病毒核酸、B型流感病毒核酸和甲型H1N1流感病毒核酸,对A型流感病毒核酸阳性而B型流感病毒核酸和甲型H1N1流感病毒核酸均阴性标本再进行季节性流感病毒H1N1、H3N2亚型流感病毒核酸检测。结果检测疑似病例标本568份,其中甲型H1N1流感病毒核酸阳性334份,季节性流感病毒H1N1亚型核酸阳性14份,季节性流感病毒H3N2亚型核酸阳性25份,A未分型流感病毒核酸阳性40份。结论实验室检测为甲型H1N1流感疫情的确认、防控以及病人的处理提供了依据,对提高实验室检测技术的敏感性、特异性和实效性具有重要的意义。     

深圳市南山区2010~2013年流感病原学检测结果分析

目的分析2010~2013年深圳市南山区流感样病例中流感病毒的变异及流行趋势,为辖区流感防控工作提供依据。方法流感病毒分离采用狗肾传代细胞(MDCK)进行培养,培养液做血凝试验,血凝试验阳性标本做红细胞凝集抑制试验进行分型鉴定。结果 2010~2013年共收集1 028例疑似流感样病例标本,分离出流感病毒246株,分离阳性率为23.9%,其中2010年流感病毒分离阳性率为22.3%(59/264),各型分布H1N1亚型9株、H3N2亚型5株、甲型H1N1 35株、Bv 10株。2011年流感病毒分离阳性率为23.3%(57/245),各型分布甲型H1N1亚型20株、Bv35株、By2株。2012年流感病毒分离阳性率为20%(52/260),各型分布流感病毒H3N2亚型35株、甲型H1N1亚型1株、Bv 13株、By 3株。2013年流感病毒分离阳性率为30.1%(78/259),各型分布H3N2 27株、甲型H1N1 33株、By 18株。流感病毒分离阳性率各年之间差异有统计学意义(χ2=8.0725,P0.05)。结论 2013年流感病毒分离阳性率最高,2010~2013年流感的流行株主要为甲型H1N1、H3N2、B型,而且交替流行。B型流感病毒由Bv系转向By系。流行时间在冬春和夏秋季节。     

实时荧光RT-PCR法快速检测流感病毒的应用研究

目的应用实时荧光RT-PCR快速检测2009～2012年河池市流感病毒核酸,为流感的预防控制提供科学依据。方法采集河池市哨点医院的流感样病例和暴发疫点现患病例的咽拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法进行流感病毒核酸检测分型。结果以实时荧光RT-PCR法检测2 090份标本,流感病毒核酸阳性801份,总阳性率为38.28%。其中甲型H1N1流感468份,B型126份,季节性流感H1亚型14份,季节性流感H3亚型109份。结论实时荧光RT-PCR法检测流感病毒具快速、操作方便、特异性强、灵敏度高等优点,值得推广应用。     

禽流感病毒A型和H5亚型RT-PCR检测试剂盒研究

人类和动物是互相依存的，自从地球上有了生物，经过亿万年沧桑幻变，发生过5次物种大灭绝，然后又滋生繁育、又形成了新的生物群落。按照自然竞争适者生存的法则，能存活下来的、尽管是五花八门、种类多的不胜枚举，但冥冥之中却为地球的生物界编组成了互相依存的食物链，准也离不开谁。人类由于发现发展了种植业和养殖业，生产力人人提高，称霸于地球，演变为今日世界。     

河源市2014—2016年流感流行与监测结果分析

目的 对河源市2014—2016年流感监测结果进行分析,了解其流行病学特征和病原学特点,为制定流感防控策略提供科学的参考依据。方法 采集哨点医院的流感样病例(ILI)咽拭子标本,用荧光定量RT–PCR方法检测流感病毒核酸,用狗肾传代细胞(MDCK细胞)法对核酸阳性标本进行病毒分离并鉴定毒株型别。结果 2014年流感的检出高峰在1—4月和6—7月,2015年的检出高峰在4—8月,2016年的检出高峰在2—5月和11—12月;5个年龄组中,0~4岁组和>60岁组阳性率最高,分别为12.07%和11.96%,其后依次是5~14岁组(8.79%)、25~59岁组(7.62%),15~24岁组阳性率最低,为5.53%,0~4岁组与5~14岁组间阳性率差异有统计学意义(χ²=13.776 3,P<0.05)。2014—2016年共检测ILI标本3 170份,流感病毒核酸阳性303份,总阳性率为9.56%。2014—2016年阳性率依次为7.79%、10.14%、10.73%。2014年和2015年,除BV外,其他三种流感病毒H1N1、H3N2 、BY均有检出,2016年四种都有检出。三年里,H3N2的阳性率比其他三种流感病毒高。303份核酸阳性标本中,分离出流感病毒毒株88株(29.04%),其中H1N1 7株(2.31%)、H3N2 42株(13.86%)、BY 39株(12.87%),BV没有分离到毒株。结论 河源市2014年流感较平稳,2015年和2016年活跃度逐渐增强;应加强0~4岁组和>60岁组的流感防控工作;加大H3N2亚型流感病毒的监测工作,及时掌握优势毒株的变化规律,不断完善流感监测网络体系。     

梧州市2009～2011年禽类环境标本禽流感病毒调查

目的了解梧州市禽类环境标本禽流感病H5N1、H9N2感染情况,以应对流感流行预警提供依据。方法采集2009～2011年梧州市禽类环境标本126份进行反转录-聚合酶联链式反应（RT-PCR）检测。结果梧州市禽类环境存在禽流感病毒,A型流感病毒阳性达19.05%,H9亚型禽流感病毒核酸阳性率10.32%;H5亚型禽流感病毒核酸阳性率7.14%。结论梧州市禽类环境禽流感病毒存在较为广泛,提示应继续加强禽流感病毒的监测,了解流感病毒株的流行动态,应对流感流行、禽流感的预警、防控意义重大。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测流感病毒H1、H3亚型的研究

目的 利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测流感病毒H1、H3亚型的方法.方法 根据H1、H3亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,设计两对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立优化反应体系后,将荧光定量RT-PCR的产物采用10倍稀释法,即107～100 copies/μl,再次用荧光定量PCR方法检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量标准曲线;利用多种流感病毒和具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性.结果 H1和H3亚型流感病毒的检测灵敏度为102 copies/μl,扩增效率分别为101.35％和113.28％,标准曲线相关系数大于99％,重复性良好,特异度实验未发现有非特异性扩增.结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H1、H3亚型流感病毒.