腺病毒介导的HSV-tk基因治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的　探讨带有HSV -tk基因的重组腺病毒 (Ad -tk)结合GCV对人膀胱癌的治疗作用。方法　建立人膀胱癌裸鼠移植瘤模型 2 1只 ,采用肿瘤原位注射Ad -tk结合GCV治疗。结果　 5× 10 8PFU的Ad -tk肿瘤原位注射结合GCV治疗 ,能明显抑制肿瘤生长 ,肿瘤平均重量为 0 .2 1g ,病理检查表明肿瘤组织坏死、出血伴纤维组织增生 ;而 3个对照组Ad -tk/PBS组、PBS/GCV组、PBS组肿瘤平均重量分别为 1.6 0、1.5 2、1.71g。与对照组比较 ,肿瘤生长抑制率分别为 86 .9%、86 .2 %、87.7% ,有显著性差异 (均P <0 .0 1)。结论　Ad -tk/GCV系统对人膀胱癌的敏感性较高 ,疗效显著。     

旁观者效应在肝癌基因治疗中的作用

目的：观察HSV－tk/ACV(Herpes Simplex Virus thymidine kinase gene/Acyclovir）系统基因治疗恶性肿瘤过程中旁观者效应的作用。方法：HSV－tk基因重组逆转录病毒载体转染PA317细胞为PA317－tk细胞。培养PA317－tk细胞即可获得有感染力的携带HSV－tk基因的病毒颗粒,然后转染肝癌细胞株SMMC－7721细胞为SMMC－tk细胞。SMMC－TK细胞与SMMC－7721细胞以不同百分比混合,用ACV（100ug/ml）培养基培养,MTT法检测ACV对各组细胞抑制率（Inhibit Rate,IR),根据各组IR与该组SMMC－tk细胞数的百分比值（IR／SMMC－tk%,IR/St）的大小判断旁观者效应作用的有无和强弱。结果：旁观效应试验表明,含SMMC-tk细胞10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％各组IR／St比值分别为2．15,1．91,1．83,1．47,1．30,1．11,1．02,0．93,0．84,0．76。10％－70％各组IR／St比值均大于1,存在明显旁观者效应,以10％,20％,30％,40％组最强,80％－100％三组IR／St比值小于1,旁观者效应不明显。结论：研究结果证实用HSV－tk/ACV系统基因治疗恶性肿瘤,适宜比例TK^ 细胞时,存在明显的旁观者效应,TK／细胞为10％时旁观者效应最强,这对于HSV－TK／ACV系统基因治疗恶性肿瘤具有重要意义。     

HSV-tk基因特异性杀伤大肠癌细胞的实验研究

目的：探讨单纯疮疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－tk)ad基因在大肠癌组织细胞中特异地表达, 以达到靶向基因治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动tk基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡtkＮa,然后以重组逆转录病毒上清染法将重组组织特异性载体及非组织特异性载体分别转导入高分泌ＣＥＡ的大肠癌ＬoＶo细胞中,以Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后给予前药更昔洛韦（ＧＣＶ）进行敏感试验。结果：转导     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肝癌基因治疗实验中的初步应用

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肝癌基因治疗实验中的初步应用戈凯郑仲承冯学胜孙兰英汤钊猷刘新垣自１９９２年８月以来，美国利用逆转录病毒载体将ＨＳＶ－ＴＫ基因直接导入治疗恶性脑瘤，治疗了１０例患者，其中６例仍然存活［１］，显示ＨＳＶ－ＴＫ基因治疗肿瘤可能有临...     

HSV-tk基因反转录病毒载体的构建及体外抗脑肿瘤细胞作用研究

构建了含有pgk启动子驱动的HSV-tk基因的反转录病毒载体pLNTK，PCR证实pLNTK成功地转移至SHG44及NBA2细胞。体外实验证实，表达HSV-tk次的细胞对ACV的敏感性明显高于未修饰的亲本细胞，SHGLNTK、NBALNTK细胞对ACV的敏感性分别是其亲本细胞的1000、500倍。3H－TdR掺入法证实转染HSV－tk细胞在ACV存在下，其DNA合成能力较亲本细胞明显受抑制。共培养实验证实存在旁观者效应。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨骨肉瘤基因治疗的可行性。方法 采用逆转录病毒介导的HSV-TK基因转移和GCV治疗的方法进行研究。结果 成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK;采用DOTAP将其转入PA317细胞中进行包装,筛选,并进行病毒滴度测定。收获病毒上清体外感染骨肉瘤细胞株OS732和SAOS-2。分别用PCR和RNA斑点杂交的方法证明假病毒中不含有复制活性病毒,HSV-TK基因已整合到宿主细胞基因组中,并获得表达,MTT比色法测定结果显示GCV对OS732TK和SAOS-2TK细胞均有明显的杀伤作用。且前者强于后者,旁观者效应在高细胞密度接种条件下强于低细胞密度,在SAOS-2细胞中的作用强于OS732。结论 HSV-TK/GCV基因治疗系统可为骨肉瘤的治疗提供新途径。     

HSV-tk基因对实验性血管成形术后再狭窄的抑制作用

为探讨转染单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ ｔｋ）基因联合ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）治疗方案用于治疗冠状动脉成形术后再狭窄的可行性,构建了携带ＨＳＶ ｔｋ基因的复制缺陷型逆转录病毒,利用该病毒将ＨＳＶ ｔｋ基因转染至体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）和大鼠腹主动脉再狭窄模型的损伤动脉中,并均给予ＧＣＶ,分别观察上述处理对ＶＳＭＣ的增殖和新生内膜的形成是否有抑制作用。结果：该方案使培养的ＶＳＭＣ增殖受抑制,抑制程度对ＧＣＶ有剂量依赖关系;既往在恶性肿瘤中发现的旁观者效应,在培养的ＶＳＭＣ中也存在。同时,该方案使大鼠腹主动脉再狭窄模型的新生内膜面积减少。但单纯转染ＨＳＶ ｔｋ基因或单纯应用ＧＣＶ无论在体外还是在体内均无上述抑制作用。提示本基因治疗方案对人类冠脉成形术后再狭窄有治疗价值。     

RV-HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的实验研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内的杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.体外实验中,Hela/TK细胞对丙氧鸟苷(GCV)的敏感性和旁观者效应采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定.动物试验中分别在BALB/C小鼠的右腋窝皮下按不同比例注射Hela/TK细胞和Hela细胞,然后给予GCV治疗.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中HSV-TK基因的表达情况.结果转染HSV-TK基因的Hela/TK细胞表现出比亲本Hela细胞更强的杀伤肿瘤效应.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg·ml-1)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示,GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,Hela/TK组和混合细胞组肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小52.8%和69.4%(均P＜0.001).小鼠的平均生存期也显著延长(P＜0.001).结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

HSV-TK/GCV系统致鼠膀胱癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨HSV-TK/GCV(单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷)系统杀伤鼠膀胱癌细胞T739的机理。方法T739与T739-TK细胞经0.25、4和8μg/ml的GCV处理后,分别观察细胞形态变化、DNA电泳和流式细胞仪检测等。结果经GCV处理过T739-TK细胞DNA电泳均发现阶梯状DNA,T739细胞电泳条带无特殊。流式细胞仪检测,T739-TK细胞均发现极明显的亚G1峰,而T739细胞无此峰发现。结论HSV-TK/GCV系统可诱导携有HSV-TK基因的T739细胞发生凋亡。     

HSV-TK/GCV系统治疗口腔鳞癌移植瘤的研究

【目的】探讨腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (AdCMVHSV TK) /丙氧鸟苷 (GCV)自杀基因系统对口腔鳞癌移植瘤的治疗作用。【方法】Tca8113细胞接种于裸鼠右侧腋下 ,移植瘤形成时随机分成 4组 :①空白对照组 ,②Ad CMVHSV TK对照组 (2× 10 9PFU ,瘤内注射 ) ,③GCV对照组 (2 5mg/kg ,Bid× 6 ,腹腔注射 ) ,④AdCMVHSV TK/GCV治疗组 ,并开始治疗。观察肿瘤的生长状态、计算抑瘤率和肿瘤群体倍增时间 ;观察肿瘤的组织病理学改变 ;高效液相色谱法(HPLC)检测GCV的体内代谢。【结果】与对照组比较 ,AdCMVHSV TK/GCV治疗组肿瘤的生长受到抑制 (P <0 0 0 1) ,抑瘤率达 90 6 9% ,肿瘤的群体倍增时间延长 ;肿瘤组织中可见灶性坏死及淋巴细胞浸润 ;HPLC检测显示治疗组肿瘤组织中存在GCV和磷酸化GCV ,血液中仅有GCV ,而对照组肿瘤组织和血液均只能检测到GCV。【结论】AdCMVHSV TK/GCV系统对口腔鳞癌移植瘤具有强的抑瘤作用。     

基因转移治疗小鼠神经母细胞瘤NBA_2的体外研究

构建了由PGK启动子驱动HSV-tk基因的重组质粒pKGTK,反转录病毒载体pLNTK,并成功地转移至小鼠神经母细胞瘤NBA_2细胞内。体外实验证实NBAKGTK和NBALNTK对阿昔洛韦(acyclovir,ACV)的杀伤敏感性分别为NBA_2约100倍和500倍。应用~3HTdR掺入法检测DNA的合成能力,证实ACV能够明显抑制NBAKGTK和NBALNTK的DNA合成。共培养实验证实存在旁观者杀伤效应。     

8-Br-cAMP联合HSV-TK/GCV治疗舌鳞癌移植瘤的研究

[目的]探讨8-Br-cAMP联合单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)对舌鳞癌移植瘤的治疗作用。[方法]舌鳞癌Tca8113细胞接种于28只裸鼠右侧腋下,随机分成4组进行治疗:对照组,8-Br-cAMP组,HSV-TK/GCV组,8-Br-cAMP联合 HSV-TK/GCV组;观察肿瘤的生长状态、计算抑瘤率和群体倍增时间;观察肿瘤的组织病理学及超微结构改变。[结果]与对照组比较,8-Br-cAMP和HSV-TK/GCV单独应用时肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.01),肿瘤的群体倍增时间延长;析出分析显示两者间存在协同的抑瘤作用(P<0.01)。光镜下对照组和8-Br-cAMP组无明显差别,HSV-TK/GCV组和8-Br-cAMP联合HSV-TK/GCV组肿瘤组织中可见囊性变和大片的灶性坏死;透射电镜显示8-Br-cAMP对舌癌细胞具有诱导分化作用。[结论]8-Br-cAMP与HSV-TK/GCV系统具有协同的抑制舌鳞癌移植瘤生长作用。     

HSVtk/GCV自杀基因系统治疗小鼠实体瘤的实验研究

目的：研究单纯疱疹病毒胸苷激酶基因联合丙氧鸟苷（ Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ） 系统对实体瘤的治疗作用。方法：以感染法建立携带 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ 基因的 Ｐ３８８ｔｋ 细胞,用 Ｘ Ｔ Ｔ、动物实验、透射电镜和流式细胞仪（ Ｆ Ｃ Ｍ） 方法研究 Ｇ Ｃ Ｖ 对 Ｐ３８８ｔｋ 细胞的杀伤作用及其机制。结果： Ｐ３８８ｔｋ 细胞对 Ｇ Ｃ Ｖ 的敏感性明显增强,约为其亲本 Ｐ３８８ 细胞的３７ 倍,且当 Ｐ３８８ｔｋ 细胞与 Ｐ３８８ 细胞或 Ｓ 细胞混合培养经５ μｇ·ｍｌ－ １ Ｇ Ｃ Ｖ 处理后, Ｐ３８８ｔｋ 细胞占总细胞的１０ ％ ,可杀伤５０ ％ 的混合细胞。动物实验中, Ｐ３８８ｔｋ 细胞或 Ｐ３８８ｔｋ 细胞与 Ｐ３８８ 细胞等量混合所致的荷瘤鼠在以 Ｇ Ｃ Ｖ 治疗后与对照组相比,肿瘤生长受到明显抑制,小鼠生存期明显延长;细胞死亡的机制可能与凋亡有关。结论： Ｈ Ｓ Ｖｔｋ（ ＋ ） 的 Ｐ３８８ｔｋ 细胞能被 Ｇ Ｃ Ｖ 有效杀伤,且对其邻近的 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ（ － ） 的细胞产生旁观者效应。     

pLTKcSN／VPC及GCV系统的旁观者效应观察

目的：探讨单纯疱疹病毒Ｉ型胸苷激酶基因（ＴＫ）逆转录病毒载体生产细菌（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统杀伤恶性胶质瘤细胞过程中的旁观者效应。方法：采用大鼠胶质瘤细胞Ｃ６、人恶性胶质瘤Ｕ８７ＭＧ和它们的转染ＴＫ阳性细胞Ｃ６ＴＫ，Ｕ８７ＴＫ，将Ｃ６与Ｃ６ＴＫ，Ｕ８７ＭＧ和Ｕ８７ＴＫ按比例（ＴＫ阳性细胞占细胞总体的０－１００％，１０％梯度）分别混合培养于９６孔板中，每种混合比例设６孔。     

含HSV－tk基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建

目的：为使自杀基因在大肠癌细胞中特异性表达，以达到靶向基因治疗的目的，首先构建以ＣＥＡ基因转录调控序列驱动的重组逆转录病毒载体。方法：将目的基因片段ＨＳＶ－ｔｋ定向克隆入ｐＵＣ１１８质粒载体中，以相应的内切酶取出合适的酶切片段后，与来自ｐＣＥＡ４２４／２ＣＡＴ质粒的ＣＥＡ５＇转录调控序列相连接，克隆入逆转录病毒载体中。结果：经鉴定及筛选，构建成重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡｔｋＮａ。结论：Ｇ１ＣＥＡｔｋＮａ的成功构建，为进一步研究大肠癌组织特异性基因治疗奠定了基础。     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应

目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／更昔洛韦(herpes simplex virus thymidine kinase／ganeyclov—ir,HSV—tk／GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用脂质体将pCMV／hytk-IRES-hrGFP质粒导入HXO-Rb44细胞株。用潮霉素筛选出阳性细胞克隆并命名为HXO-Rb44／tk。RT—PCR鉴定hytk基因在HXO-Rb44／tk细胞中的转录结果。比较HXO-Rb44和HXO-Rb44／tk细胞的形态特征及生长特性。通过MTT法检测GCV对不同比例HXO-Rb44／tk和HXO-Rb44混合细胞的杀伤作用(“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果HXO-Rb44／tk细胞经RT—PCR可检测出530bp的hytk基因片段。HXO-Rb44／tk和HXO-Rb44细胞的形态特征及生长特性无明显差异。HXO-Rb44／tk细胞仅占很低比例时即可观察到明显的旁观者效应,而GCV作用的HXO-Rb44／tk细胞上清对HXO-Rb44细胞无杀伤作用。结论 HSV—tk基因转移联合GCV治疗可作为Rb基因治疗的一种有效方法,旁观者效应可能是GCV代谢产物通过缝隙连接进行细胞间转运来实现的。