应用聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌的研究

应用聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌的研究谭耀驹李一耕谭守勇我们选用分子量为３８０００片段长度为４１９ｂｐ（３８０００－４１９ｂｐ）系统，对患者的痰液、胸液、脑脊液、支气管冲洗液、淋巴分泌物等进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测，探讨其在实际应用中的可信性...     

应用多重聚合酶链反应法检测并鉴别结核分支杆菌与非结核分支杆菌DNA

OBJECTIVE: To improve the specificity and sensitivity of polymerase chain reaction (PCR) technique for detecting and identification of DNA of M. tuberculosis and M. nontuberculosis. METHOD: Three pairs of oligonucleotide primer were used in triplex-PCR. A 383 bp DNA fragment encoding part of the 65,000 mycobacterial surface antigen, a 123 bp fragment corresponding to a specific M. tuberculosis complex sequence which was the insertion sequence 6110 (IS 6110) and a 268 bp fragment for human beta-globin were amplified by triplex-PCR respectively. RESULT: The sensitivity of the triplex-PCR-electrophoresis for the DNA of mycobacterium was 0.6 pg. The specific bands of 383 bp and 123 bp among the amplified DNA from M. hominis, M. bovis, BCG and M. simiae were present in the agarose gel. By contrast, only a band of 383 bp was found among the M. nontuberculosis which contained M. avium, M. chelonae, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. kansasii, M. intracellulare and M. smegmatis. Compared with the standard strains, there was an additional 268 bp band in simulated clinical samples infected by Mycobacterium. The above 3 specific bands were found neither in other 15 bacterial species tested nor in Mycoplasma pneumoniae. 182 clinical samples were examined by culture, smear and triplex-PCR. 72 nontuberculous clinical samples were all negative. In 110 tuberculosis clinical samples, the positive rates were 2.7%, 13.6% and 32.7%, respectively. CONCLUSION: The triplex-PCR possesses a high specificity and sensitivity. This method could detect and identify the DNA of M. tuberculosis and M. nontuberculosis except M. simiae. It is a valuable tool for early diagnosis and differentiation for infection of M. tuberculosis and M. nontuberculosis.     

结核分支杆菌DNA的单管巢式聚合酶链反应检测

目的探讨单管巢式聚合酶链反应（ＳＮＰＣＲ）检测石蜡包埋组织结核分支杆菌ＤＮＡ的特异性和敏感性。方法应用普通ＰＣＲ（ＧＰＣＲ）、双管巢式ＰＣＲ（ＤＮＰＣＲ）和ＳＮＰＣＲ对结核分支杆菌ＢＣＧ和３０例结核性淋巴结炎石蜡包埋组织进行结核分支杆菌复合群ＩＳ６１１０特异插入序列片段ＤＮＡ检测。结果ＤＮＰＣＲ和ＳＮＰＣＲ检测ＢＣＧＤＮＡ均于１５ｆｇ以上呈现阳性结果，其敏感性明显优于ＧＰＣＲ（４８０ｆｇ）。ＧＰＣＲ、ＤＮＰＣＲ和ＳＮＰＣＲ检测３０例结核性淋巴结炎阳性率分别为４３％、１００％和１００％，抗酸染色阳性率（１０％）与３种ＰＣＲ法相比差异有非常显著意义（均Ｐ＜０．０１）。ＧＰＣＲ阳性率与ＤＮＰＣＲ和ＳＮＰＣＲ相比差异亦具非常显著意义（均Ｐ＜０．０１）。ＳＮＰＣＲ阳性率与ＤＮＰＣＲ相同。结论巢式ＰＣＲ检测淋巴结石蜡包埋组织结核分支杆菌的敏感性显著高于ＧＰＣＲ，其中ＳＮＰＣＲ具有与ＤＮＰＣＲ相同的特异性和敏感性，并具有更大的实用价值。     

结核病人外周血结核分支杆菌聚合酶链反应检测及临床意义

采用巢式聚合酶链反应 (ＰＣＲ)方法扩增结核病人外周血单核细胞 (ＰＢＭＣ)结核分支杆菌 (ＭＴＢ)ＩＳ6 110部分序列 ,并将其克隆与测序 ,结合临床资料分析探讨其临床意义。材料与方法　①对象 :我院 1999年住院的 77例活动性肺结核病人。另以同期住院的非结核病人 (10例肝炎 ,30例肺炎和慢性阻塞性肺疾病 )作对照。②ＰＣＲ引物 :根据Ｔｈｉｅｒｒｙ等[1] 报道的结核分支杆菌ＩＳ6 110序列 ,采用Ｇｏｌｄｋｅｙ软件 ,在其保守区设计两对套式引物 ,委托上海生工生物工程公司合成。引物序列为 :ＴＢ15′ＣＧＴＧＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＧＧＴ…     

TaqMan聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌DNA及其临？…

目的 探讨ＴａｑＭａｎ聚合酶链反应（ＴａｑＭａｎ－ＰＣＲ）技术在肺结构诊断中的价值。方法 对１６８例活动性肺结核、５７例肺癌患者的痰和外周血及３４－例健康对照外周血,同时应用ＴａｑＭａｎ－ＰＣＲ、ＰＣＲ检测,并与痰涂片法、ＢＡＣＴＥＣ法及改良罗氏培养法结果进行比较。结果 ＴａｑＭａｎ－ＰＣＲ检测痰和外周血总的阳性率分别为５３．０％和６１．３％,显著高于ＰＣＲ、痰涂片法、ＢＡＴＣＴＥＣ法及改良罗氏培     

荧光定量聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌的临床应用

我们采用荧光定量聚合酶链反应 (ＦＱ ＰＣＲ)技术检测了115例结核患者高度疑有结核分支杆菌的标本和 3 0例非结核病的患者标本 ,并与培养法、抗酸染色法和ＰＣＲ 电泳法进行了比较 ,现报告如下。对象与方法　对象 :115例临床诊断为结核病的患者为四川省人民医院门诊和住院患者 ,符合结核病诊断标准。 3 0例非结核患者为对照组 ,其中肺炎 2 5例 ,慢性支气管炎 5例。标本包括痰、胸腹液、晨尿和精液。方法 :标本经处理后 ,进行碱性复红染色 ;罗氏培养基培养 ;ＰＣＲ电泳 ,每份用该法检测 2次。ＦＱ ＰＣＲ :仪器为美国ＡＢＩ公司生产的 770 0…     

聚合酶链反应试剂对检测痰结核分支杆菌的影响

目的观察聚合酶链反应（ＰＣＲ）的试剂对检测痰结核分支杆菌的敏感性和特异性的影响。方法对结核病组２０５例和非结核病组１０５例的痰标本同时进行三个厂家生产的ＰＣＲ试剂检测、普通细菌培养和抗酸染色法涂片检测。再对ＰＣＲ假阳性的痰普通细菌培养结果进行分析，试找出ＰＣＲ假阳性的其它因素。结果三种不同引物序列和扩增产物片段长度的ＰＣＲ试剂对结核性痰标本的阳性率分别为８２．４％、７１．７％和６１．０％，组间差异有非常显著意义（Ｐ＜０．００５）。结论ＰＣＲ试剂的引物序列和扩增产物长度对检测痰结核分支杆菌的阳性率和假阳性率有很大的影响     

标本处理方法对聚合酶链反应检测结核分支杆菌结果的影响

目的探讨应用十二烷基硫酸钠（SDS）处理标本在结核分支杆菌聚合酶链反应（PCR）中的价值。方法从186例活动性结核病人收集痰、胸腹水、脑脊液、尿、血液等标本266份,标本分别用SDS和常规方法进行处理。两种方法处理的标本同时用PCR-反相膜杂交试验检测结核分支杆菌,并将结果进行比较。结果用SDS和常规方法处理的标本,PCR-反相膜杂交试验结核分支杆菌的检出率分别为65.0%（173/266）和51.5%（136/266）。通过配对计数资料卡方检验,SDS法和常规法之间的差异具有非常显著性意义（χ     

应用多重聚合酶链反应法检测并鉴别结核分支杆菌与非结 …

目的 提高聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测分支杆菌ＤＮＡ的特异性和敏感性、以检测和鉴别结核分支杆菌与非结核分支杆菌ＤＮＡ。方法 应用三对具有特异性的寡核苷酸引物，进行多重ＰＣＲ扩增。这三对引物分别对应于分支杆菌６５０００表面抗原、结核分支杆菌插入序列ＩＳ６１１０及人类β－珠蛋白基因的部分序列，其扩增产物分别为３８３ｂｐ、１２３ｂｐ和２６８ｂｐ。结果 此多重ＰＣＲ电泳检测的灵敏度为０．６ｐｇ。经多重ＰＣＲ     

聚合酶链反应—冷单链构象多态性快速检测结核分支杆菌r…

评估ｒｐｏＢ基因突变检测在结核分支杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（Rifampicin Resistance Determining Region，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，531TCG和531TTG），应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较，部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中，其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份肺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株，其中利福平耐药株48份，荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变，3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区(Rifampicin Resistance Determining Region,RRDR)526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针(526CAC,526TAC,531TCG和531TTG),应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而,应用该技术检测84份肺结核病例痰标本,与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较,部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中,其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100%。在84份肺结核病例的痰标本中,罗氏培养阳性62株,其中利福平耐药株48份,荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例,526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中,荧光定量PCR检测43株为531TTG突变,3株为526TAC突变,另2株利福平耐药株,经测序证实,1株514密码子TTC插入突变,1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变,并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

聚合酶链反应检测肺结核患者外周血单个核细胞中结核分 …

探讨外周血单个核细胞中结核分支杆菌ＤＮＡ检测在肺结核诊断中的价值。方法采用改良Ｔｒｉｔｏｎ－ｘ－１００法分离，制备单个核细胞中模板，ＤＮＡ，聚合酶链反应扩增结核分支杆菌２４０ｂｐ基因片段，同时分析了影响ＰＣＲ结果的有关因素。结果８９例肺结核患者的血标本，８４例肺结核患者的痰标本中，结核分支杆菌ＤＮＡ阳性率分别为７３％和５７％；８４例肺结核患者外周血，痰标本配对检测总阳性率可达８７％。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（RifampicinResistartceDeterminingReglon，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，53ITCG和531TrG）．应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较．部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中．其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份哺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株．其中利福平耐药株48份．荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到53l密码子突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变．3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子．TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为I晦床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

AmpliSensor—聚合酶链反应定量检测肺结核患者外周血结 …

目的 探讨ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－聚合酶链反应定量检测外周血中结核分支杆菌ＤＮＡ在肺结核的应用价值。方法 采用ＱｌＡａｍｐ和ＡｃｕＰｕｒｅ法提取，制备全血中模板ＴＢ－ＤＮＡ，应用ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ定量检测，并与ＩＳ６１１０－单管巢式聚合酶链反应（ＳＮ－ＰＣＲ）作比较。结果２００例肺结核患者的血液标本中，两种方法测得结核分支杆菌ＤＮＡ的阳性率分别为６０．５％、６３．５％。８５例非结核肺病     

PCR－SSCP技术快速检测结核分枝杆菌 rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

Amplisensor-聚合酶反应定量检测脑脊液中结核分支杆菌DNA的研究

目的　探讨Amplisensor-聚合酶反应 (Amplisensor-PCR)定量检测脑脊液中结核分支杆菌DNA(TB-DNA)对结核性脑膜炎的诊断价值。方法 采用Amplisensor-PCR对117例结核性脑膜炎患者及36例非结核性脑膜炎患者的脑脊液标本进行检测,并与PCR(凝胶电泳后,经溴化乙锭染色)、涂片、培养法比较。结果 Amplisensor-PCR的敏感性显著高于涂片及培养,阳性率分别为57.13%、1.7%、6.7% (P＜0.001)。结论 Amplisensor-PCR可以通过标准曲线划定检出下限,并可换算出标本中原始的靶DNA值,同时具有较高的特异性和敏感性,对结核性脑膜炎的诊断有一定的临床意义。