传代神经干细胞体外分化研究

目的：分离、培养和鉴定Wistar大鼠脑部的神经干细胞,传代培养后进行诱导分化。方法：分离培养神经干细胞,传代后进行诱导分化研究。结果：所分离培养的细胞具有增殖能力和分化潜能,表达nestin蛋白,诱导分化后经细胞免疫学证实为表达NSE的神经元和表达GFAP的星形胶质细胞。结论：神经干细胞具有体外诱导分化为神经元和星形胶质细胞的能力。     

补益脾胃元气方药对海马神经干细胞增殖分化的影响

目的:探讨人参、大补元煎、洗心汤三组补益脾胃元气方药对海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖分化的影响。方法:从新生24小时内的Wistar胎鼠脑中分离培养海马NSCs,制备不同药物含药脑脊液并与Aβ_(1-42)共同处理海马NSCs。通过CCK8实验检测各组海马NSCs增殖率,免疫荧光法与蛋白印迹法检测海马NSCs分化为神经元与星形胶质细胞的情况。结果:含中药各实验组的海马NSCs增殖率显著高于Aβ_(1-42)处理组(P0.05);含中药各实验组海马NSCs分化为神经元与星形胶质细胞数量明显多于Aβ_(1-42)处理组(P0.05),各中药组之间对比,差异不具有统计学意义(P0.05)。结论:人参、大补元煎、洗心汤能显著促进海马NSCs增殖、诱导海马NSCs分化为神经元与星形胶质细胞。     

脑络欣通和左归丸药物血清对体外培养的大鼠神经干细胞增殖分化的作用

目的 探讨脑络欣通药物血清和左归丸药物血清对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cell, NSC)增殖分化的作用。方法 分别采用含10%脑络欣通药物血清和含10%左归丸药物血清的培养基培养大鼠胚胎NSC,观察其促增殖效应和诱导分化效应,应用相差显微镜和免疫荧光染色对其进行比较观察。结果 脑络欣通药物血清和左归丸药物血清均可诱导绝大多数NSC分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。此外,两者还能在一定程度上促进培养的NSC生长。前者诱导NSC分化的进程虽比后者要慢,但诱导NSC向神经元方向分化的比率较高,其分化的神经元在细胞形态学上与发育成熟的神经元更为接近;后者促进NSC生长的效应较为显著。结论 脑络欣通和左归丸均能促进体外培养的NSC生长和分化,两者作用有一定差异;益气活血治法和补肾生髓治法对NSC进行诱导分化具有一定的可行性。     

电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的：研究电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养，MSCs用含10％健康大鼠电针血清、10％脑梗塞大鼠血清、10％脑梗塞大鼠电针血清和含10％丹参注射液的L-DMEM诱导MSCs，光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可以通过贴壁法成功分离，并可在体外大量扩增，健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清诱导48小时之后未见神经元样细胞出现，免疫细胞化学染色NSE、Nestin阴性。丹参诱导4小时后，大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin染色呈阳性。结论：健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清不能诱导MSCs体外分化；丹参注射液可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞。     

补阳还五汤对大鼠肌源性干细胞体外生长分化的影响

目的观察补阳还五汤含药血清对体外培养的大鼠乳鼠肌源性干细胞生长及分化的影响。方法取3 d内大鼠乳鼠骨骼肌,分离纯化肌源性干细胞,分别接种在含对照血清培养基和含药血清培养基的培养孔内,观察细胞形态变化;通过免疫荧光法和Western blot对2组细胞的神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达进行对比分析。结果药物血清组中的细胞可见多边形改变类似神经样突起,而对照组细胞呈纺锤状;药物血清组中细胞的NSE和GFAP表达均明显高于对照组(P0.05)。结论补阳还五汤含药血清可促进肌源性干细胞向神经元样细胞分化。     

蛇床子素上调miR-9促进神经干细胞分化的研究

目的:探讨蛇床子素对β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)诱导的神经干细胞分化的作用及其可能作用的机制。方法:体外分离并培养新生小鼠脑源NSCs,体外以20μmol/L的Aβ1-42诱导神经干细胞,建立阿尔茨海默病的神经干细胞模型,通过CCK-8法检测神经干细胞存活率;免疫荧光细胞化学法研究蛇床子素对Aβ1-42诱导的神经干细胞分化能力的影响;RT-PCR检测miR-9 mRNA的表达情况。结果:免疫荧光细胞化学法显示神经球显Nestin、Sox2阳性,即所培养的细胞为NSCs;CCK8法结果显示50μmol/L、100μmol/L蛇床子素作用可明显促进NSC存活;Aβ1-42孵育的NSCs用蛇床子素(50、100μmol/L)作用后,神经干细胞向神经元分化的数量明显增加,以蛇床子素100μmol/L作用神经干细胞向神经元分化的数量增加最显著。而转染了miR-9抑制剂后,与Aβ1-4220μmol/L组相比,Aβ1-4220μmol/L+miR-9抑制剂组的NF-M阳性细胞率明显降低,而Aβ1-4220μmol/L+miR-9抑制剂+蛇床子素100μmol/L组NF-M阳性细胞率与Aβ1-4220μmol/L+miR-9抑制剂组相比显著增加;PCR结果显示,蛇床子素100μmol/L可增加miR-9 mRNA的表达。结论:蛇床子素可促使NSCs向神经元分化,其机制可能与蛇床子素上调miR-9信号通路有关。     

黄芩甙诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的　黄芩甙体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法　通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞 ,体外扩增培养。中药黄芩甙定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶 (NSE)、巢蛋白 (Nestin)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果　大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。黄芩甙诱导 5h后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性 ,GFAP阴性。结论黄芩甙可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

阿魏酸钠诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的初步研究

目的 探讨阿魏酸钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能作用。方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，采用阿魏酸钠对其进行诱导培养，倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化，并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞表面神经细胞特异性标志物神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果 阿魏酸钠诱导培养6h后即可见细胞形态发生明显变化，24h后表现为典型的神经细胞样形态，NF和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达。结论 初步证实阿魏酸钠具有诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。     

火针干预脊髓损伤大鼠后血清对神经干细胞增殖分化的影响

[目的]研究离体状态下火针干预脊髓损伤大鼠后提取血清对神经干细胞增殖分化的影响。[方法]将15只SD大鼠随机分为假手术组、模型组及火针组,相应干预3 d后取各组大鼠血清。从孕14天昆明小鼠胚胎脊髓组织中分离培养神经干细胞,同时采用上述各组血清进行培养,7 d后观察各组神经干细胞增殖与分化情况。[结果]神经干细胞在各组血清中均能存活、增殖并可向神经元分化,火针组神经干细胞增殖数目显著多于假手术组及模型组,且火针组神经元分化比例高于其余两组(P<0.05)。[结论]火针干预脊髓损伤大鼠后血清可促进神经干细胞增殖并向神经元分化。     

壮药壮通饮对大鼠内源性脑神经干细胞归巢后神经元功能的影响

目的:观察壮药复方壮通饮对脑梗死模型大鼠内源性神经干细胞归巢后神经元功能的影响。方法:240只大鼠分为模型组、假手术组、壮通饮治疗组、正常组,采用线栓法制作脑梗死模型,于术后1、3、7、14、21、28d这6个时间点分批处死大鼠。用免疫组化法检测大鼠海马区Brd U、Nestin和梗死区域及相对应区域的MBP、SYN的阳性细胞数目。结果:模型组脑缺血区域相对应区域MBP、SYN阳性细胞大量表达,正常组和假手术组海马区少量Brd U、Nestin阳性细胞。模型组和壮通饮治疗组Brd U、Nestin阳性细胞表达增多,MBP、SYN阳性细胞表达减少。壮通饮治疗组Brd U、Nestin、MBP、SYN阳性细胞表达量多于模型组,Brd U、Nestin阳性细胞表达在第7天达到高峰,MBP、SYN阳性细胞表达于第14天达到高峰。结论:壮通饮可以促进脑梗死后内源性神经干细胞的增殖,诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,并发挥正常的神经功能。     

地黄多糖对大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞诱导分化作用的研究

目的:探讨地黄多糖体外对大鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为神经样细胞的诱导作用.方法:以大鼠BMSCs为研究对象,采用流式细胞仪检测BMSCs表面标志,MTT法检测细胞生长曲线,当第3代细胞爬片达到80％以上汇合时,分为对照组、化学方法诱导组(5 mmol·L -1,β-mercap toethanol)、脑源性神经生长因子(10 μg·L-1,BDNF)组和地黄多糖组(200 mg·L-1)进行诱导,6h后应用免疫细胞化学染色法检测各实验组神经元巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,RT-PCR检测nestin,NSE,βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)和GFAP mRNA的表达情况.结果:经分离鉴定培养5代以内大鼠BMSCs增殖旺盛、具有较好的细胞活力;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,对照组不表达神经细胞标志物,各诱导组诱导后有特异性神经细胞标志物表达.其中地黄多糖组Nestin,NSE阳性细胞率分别为( 56.74±1.36)％,(73.37±1.27)％,高于化学诱导组(28.21±2.43)％,(2.31±2.72)％和神经生长因子组(31.3±1.61)％,(28.87±1.65)％,(P＜0.05);GFAP阳性细胞率(20.17±1.27)％低于化学诱导组和神经生长因子组,差异具有统计学意义(P＜0.05);化学诱导组Nestin,NSE和GFAP阳性细胞率与生长因子组比较,差异无统计学意义.结论:地黄多糖具有诱导BMSCs向神经样细胞分化的作用,主要向神经元样细胞方向诱导.     

补肾填精法促进骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探讨补肾填精方右归丸含药血清体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的作用.方法:用DMEM/F-12培养液培养Wistar大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs).用右归丸含药血清诱导BMSCs分化后,倒置显微镜观察细胞形态变化;用尼氏染色法观察神经细胞特征性结构;用免疫细胞化学染色法鉴定神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经细胞特异性标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE),微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.结果:诱导6h后,骨髓基质干细胞胞体收缩,有突起伸出;诱导24 h后突起增多形成网络结构;尼氏染色法显示诱导后的细胞胞体中有尼氏体.免疫细胞化学染色示NSE及MAP-2阳性表达,GFAP无表达.结论:右归丸含药血清可以体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞.     

成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系

目的探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从成人骨髓中分离骨髓间质干细胞(MSC),培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞,经免疫组化鉴定其神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数,掺入Brdu测定,计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成,计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总数增加,诱导分化后12h内细胞增殖较快。30%以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标记,而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成,并不会阻止神经元的分化,仍有70%的分化神经元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂,但抑制细胞分裂不影响神经元分化。     

右归丸含药血清诱导骨髓基质干细胞分化的最佳浓度探索

目的:探讨右归丸含药血清体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的最佳浓度。方法:用DMEM/F-12培养液培养Wistar大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),采用不同浓度右归丸含药血清对其进行体外诱导,并用MTT法检测各组细胞生长情况,用免疫细胞荧光方法计算各组神经元样细胞阳性数加以比较。结果:BMSCs在2.5%含药血清培养液中活力最好。结论:2.5%右归丸含药血清培养液是诱导BMSCs分化实验的最佳浓度。     

左归丸对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响

目的观察左归丸药物血清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经样细胞分化的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法原代培养、传代培养BMSCs;观察细胞形态,采用免疫细胞化学染色及流式细胞术检测细胞表面CD90、CD29、CD34和CD45表达以鉴定BMSCs;分别使用β-巯基乙醇及左归丸药物血清诱导BMSCs向神经样细胞分化,采用Western blot法检测诱导后神经标志蛋白(Nestin、NSE、GFAP)表达。结果培养至第3代的骨髓间充质干细胞,CD90、CD29表达阳性,CD34和CD45表达阴性;分别经β-巯基乙醇、左归丸药物血清诱导后,BMSCs可见典型的神经元样改变,神经标志蛋白(Nestin、NSE、GFAP)表达均显著增高(P0.05)。结论左归丸药物血清可以诱导大鼠BMSCs分化,且分化细胞具备神经细胞的形态及特征,该研究为临床治疗提供了新思路、新方法;但是诱导过程中的作用机制还不清楚,有待进一步的研究。     

中药复方脑还丹对Aβ诱导的大脑皮质和海马神经元损害的保护作用研究

目的 :探讨中药复方脑还丹对Aβ诱导的大脑皮质和海马神经元损害的作用。方法 :采用MTT法及NSE免疫组化方法观察脑还丹药物血清对经Aβ2 5 35处理的原代培养的新生大鼠大脑皮质和海马神经元的影响。结果 :体外培养的新生大鼠大脑皮质和海马神经元经Aβ 2 5 35处理后 ,活细胞数减少 ,而脑还丹含药血清能够促进神经元的存活率以及促进神经元的生长发育 ,与对照组相比有显著性差异 (P <0 0 5 )。结论 :中药复方脑还丹能够减轻Aβ对大脑皮质和海马神经元的毒性作用。     

补阳还五汤载药血清对缺氧性神经干细胞增殖和分化的影响

目的:观察补阳还五汤载药血清对缺氧环境中神经干细胞的增殖及其分化的影响。方法:从孕14d(E14d)大鼠获得神经干细胞,经无血清培养基悬浮培养并传代。取传3代神经干细胞,添加不同浓度的载药血清,在5%O2三气培养箱中培养。MTT法检测不同缺氧时间点神经干细胞的增殖情况。兔抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)和兔抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色观察神经干细胞的分化情况并分别计数。结果:10%缺氧载药血清组神经干细胞MTT检测的OD值显著增高;各浓度组分化的NSE及GFAP阳性细胞的比例均升高,尤以10%缺氧载药血清组升高显著。结论:补阳还五汤药物血清对神经干细胞缺氧性损伤具有明显的保护作用,并可促进缺氧性神经干细胞的分化,10%浓度为最佳干预浓度。     

人参总皂苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨人参总皂苷体外诱导青年SD大鼠骨髓问质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用.方法贴壁筛选法分离纯化MSCs.10μg?L-1bFGF预诱导第5代的MSCs 24h,换200μg·mL-1人参总皂苷的无血清培养液诱导诱导5～6h,观察细胞形态变化,免疫组织化学法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果第5代间质干细胞形态达到均一,呈梭形.用人参总皂苷诱导30min到3h后,MSCs胞体逐渐增大,并伸出细长突起形似神经元样细胞.诱导5～6h后.NSE、MAP-2和GFAP阳性细胞数分别为(76±4.7)%、(61±5.2)%、(10±2.4)%.对照组上述染色均呈阴性.结论人参总皂苷在体外能定向诱导MSCs分化为神经元样细胞.     

大鼠海马神经细胞体外原代培养与鉴定

目的建立较为简便的新生乳鼠海马神经细胞原代培养方法。方法急性分离新生24h内的大鼠乳鼠海马组织,用胰蛋白酶消化与机械吹打相结合的方法分离海马神经细胞,以含10%胎牛血清的培养基种植、无血清饲养液维持饲养,神经微管相关蛋白2(Map-2)鉴定神经元纯度。结果培养8d,神经元胞体清晰,结构完整,神经元纯度最高达到85.71%。结论该法无需严格控制消化时间,也不使用阿糖胞苷纯化细胞,即能够获得生长状态良好、纯度较高的神经元。     

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中褪黑素受体和多效蛋白的表达

目的体外诱导成人骨髓间充质干细胞（MSCs）向神经元样细胞分化,并探讨分化过程中多效蛋白（PTN）和褪黑素（Mel）受体亚型MT1、MT2 mRNA的表达,以探索MSCs向神经元样细胞分化的特性和机制。方法密度梯度离心加贴壁培养法分离成人MSCs,原代和传代培养。取第6代MSCs设对照和实验组进行诱导,诱导后30min至3d,观察细胞形态并计数。免疫细胞化学法和RT—PCR法测定分化后细胞神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白-2（MAP-2）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和诱导前、诱导后12hPTN和MT1、MT2 mRNA的表达。结果接种24h后MSCs开始贴壁,呈圆形或椭圆形。3d后可见梭状细胞呈集落状生长,10d～14d融合。第5代～第6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。诱导后胞体向胞核收缩;出现双极及多极细胞。12h变形细胞增多,细长突起相互连接。24h后变形细胞增多不明显。诱导后12h大部分细胞表达NSE、MAP-2,未检测到GFAP的表达。实验组诱导后12h细胞有PTN和MT1 mRNA的表达。结论PTN和Me1信号传导可能参与调控了MSCs向神经元样细胞的分化。