肺泡Ⅱ型上皮细胞A549对TNF-α和LPS的刺激效果研究

目的研究肺泡Ⅱ型上皮细胞A549对TNF-α和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激的反应效果,探讨急性肺损伤体外细胞模型最佳造模方法。方法体外培养的A549细胞分为正常对照组(normal control,NC组),10 ng/ml TNF-α刺激2 h组,10 ng/ml和100 ng/ml LPS分别刺激2、4、8、16 h组。Western blotting检测胞浆IκB-α含量和IκB-α、NF-κB p65磷酸化水平,qRT-PCR检测细胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA转录水平,ELISA检测细胞培养上清IL-1β和IL-6质量浓度。结果 TNF-α刺激导致A549细胞大量凋亡或死亡,而LPS刺激对A549细胞生长形态无明显影响,且与LPS的刺激质量浓度和时间无关。TNF-α刺激可明显增加A549细胞内IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平(P<0.05),而LPS刺激对A549细胞内IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平无明显影响(P>0.05),且与LPS的刺激质量浓度和时间无关(P>0.05)。TNF-α刺激可显著增加A549细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA转录水平和培养上清中IL-1β、IL-6质量浓度(P<0.05),而LPS刺激对上述炎症因子的合成和分泌并无显著影响(P>0.05),且与LPS的刺激质量浓度和时间无关(P>0.05)。结论 TNF-α可以有效刺激A549产生过度炎症反应,而LPS不能刺激A549细胞产生炎症损伤,因此建立急性肺损伤体外细胞模型时可以考虑用TNF-α代替LPS刺激。     

川芎嗪抑制LPS诱导的人Ⅱ型肺泡上皮细胞炎性反应

目的体外探讨川芎嗪(TMP)对脂多糖(LPS)诱导的人Ⅱ型肺泡上皮细胞(HAECⅡ)炎性反应的保护作用及机制。方法体外培养HAECⅡ(A549细胞来源),LPS刺激建立炎性模型,分别加入TMP和前B细胞克隆增强因子(PBEF)抑制剂FK866进行干预。q-PCR和Western blot检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)和PBEF的mRNA和蛋白表达;通过Western blot检测细胞核和细胞质内磷酸化P65蛋白来反映核因子κB(NF-κB)的激活。结果 LPS刺激A549细胞后,TNF-α、IL-1β、IL-8和PBEF mRNA及蛋白表达均较对照组明显增高(P0.001),伴随着细胞核和细胞质磷酸化的P65蛋白增高(P0.001);TMP干预后,上述炎性因子mRNA和蛋白表达下降,磷酸化P65蛋白表达降低(P0.05);FK866干预后,TNF-α、IL-1β和IL-8表达以及磷酸化P65蛋白降低(P0.01)。结论 TMP可能通过降低PBEF的表达,从而抑制NF-κB的激活,减轻肺泡上皮细胞炎性反应。     

沉默NF-κB p65基因下调TNF-α诱导的肺泡上皮细胞的炎症反应

目的建立急性肺损伤体外细胞炎症模型,探讨NF-κB p65基因沉默减轻细胞炎症、保护肺结构细胞的可行性。方法以TNF-α(10 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549),运用RNA干扰技术沉默NF-κB p65基因,采用RT-PCR及Westernblotting法检测沉默效率,ELISA法检测细胞培养上清中IL-1β、IL-8、IL-10等炎症因子浓度。结果 TNF-α刺激A549细胞可在基因水平上调NF-κB p65的表达,并增加NF-κB蛋白的核转位,上调细胞培养上清中IL-1β、IL-8、IL-10的浓度;预转染NF-κB p65 siRNA可在基因水平及蛋白水平有效沉默NF-κB p65表达,降低上述各炎症因子浓度(P<0.05)。结论急性肺损伤体外细胞炎症模型构建成功,RNA干扰技术能有效沉默该模型NF-κB p65基因,下调炎症反应水平,保护肺泡上皮细胞,为急性肺损伤免疫调控机制的研究和基因靶向治疗提供实验依据。     

β-胡萝卜素对脂多糖刺激巨噬细胞RAW264.7炎症因子的影响及其机制

目的:探讨β-胡萝卜素对脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞RAW264.7炎症因子的影响及其机制。方法:采用5μg/ml的LPS刺激巨噬细胞24 h后用不同浓度的β-胡萝卜素(20、40、80、160μmol/L)处理细胞3 h,MTT法测细胞活性,荧光定量PCR测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相对表达量,ELISA测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量,Western blot测NF-κB p65蛋白相对表达量。5μg/ml的LPS和不同浓度的NF-κB抑制剂PDTC(1、5、10μg/ml)共同处理巨噬细胞24 h,Western blot测NF-κB p65蛋白相对表达量,荧光定量PCR、ELISA测炎症因子的表达和分泌。比较LPS+PDTC组和LPS+PDTC+β-胡萝卜素组炎症因子和NF-κB p65蛋白相对表达的变化。结果:与LPS组相比,不同浓度的β-胡萝卜素对LPS刺激的巨噬细胞的细胞活性有提升作用,对炎症因子和NF-κB p65蛋白的表达有抑制作用;抑制NF-κB蛋白的表达可以抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症因子的分泌;LPS+PDTC+β-胡萝卜素组对炎症因子的抑制作用比LPS+PDTC组明显,且差异显著(P0.05),但两组对NF-κB p65蛋白的表达不明显。结论:β-胡萝卜素可以通过抑制NF-κB通路中NF-κB p65蛋白的表达抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌,且此通路不是唯一相关的通路。     

下调lncRNA NEAT1通过NF-κB信号传导途径抑制TNF-α诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症因子释放北大核心CSCD

目的:探究下调lncRNA NEAT1对TNF-α诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症因子释放的影响。方法:将肺泡上皮细胞A549分成Control组、TNF-α组(TNF-α处理)、sh-NC组(转染shRNA control,TNF-α处理)、sh-NEAT1组(转染NEAT1 shRNA,TNF-α处理)、sh-NEAT1+PMA组(转染NEAT1 shRNA,TNF-α和NF-κB信号激活剂PMA处理)。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,硫代巴比妥酸法检测细胞中MDA含量,黄嘌呤氧化法检测细胞中SOD活性,CellROX Green法检测细胞中ROS水平,ELISA检测IL-6、IL-8、IL-1β水平,Western blot检测Cleaved caspase-3、p65蛋白表达。结果:与Control组相比,TNF-α组肺泡上皮细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达水平升高,MDA含量、ROS水平升高,SOD活性降低,细胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β增多,细胞中p65蛋白表达水平升高。与sh-NC组相比,sh-NEAT1组肺泡上皮细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,MDA含量、ROS水平降低,SOD活性升高,细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β减少,细胞中p65蛋白表达水平降低。与sh-NEAT1组相比,sh-NEAT1+PMA组肺泡上皮细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved caspase-3、p65蛋白表达增多,MDA含量和ROS水平升高,SOD活性降低,细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β增多。结论:下调NEAT1通过降低NF-κB信号通路激活水平抑制TNF-α诱导的肺泡上皮细胞氧化损伤和炎症因子释放。     

过表达SIRT1抑制脂多糖诱导的胰岛β细胞炎症因子表达及NF-κB信号通路激活

目的研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对脂多糖(LPS)诱导的胰岛β细胞炎症因子表达及核因子-κB(NF-κB)信号通路激活的影响。方法用LPS处理胰岛β细胞,qRT-PCR和Western blot测定细胞中SIRT1表达变化。用pcDNA3.1-SIRT1慢病毒感染胰岛β细胞,qRT-PCR检测细胞中白细胞介素-6(IL-6)mRNA和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达水平,流式细胞术测定细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、核因子-κBp65亚型(NF-κBp65)、Toll样受体4(TLR4)蛋白表达水平。结果 LPS处理后的胰岛β细胞中SIRT1表达水平降低。pcDNA3.1-SIRT1慢病毒感染可以提高LPS条件下胰岛β细胞中SIRT1表达水平。LPS处理后的胰岛β细胞中IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表达水平升高,凋亡率升高,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4蛋白表达升高。过表达SIRT1可以降低LPS条件下胰岛β细胞中IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表达水平,抑制细胞凋亡,减少细胞中Bax、cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4蛋白表达。结论 SIRT1减少LPS诱导的胰岛β细胞炎症因子表达并下调细胞中NF-κB信号激活水平。     

miR-221靶向AdipoR1基因对LPS诱导的肺泡上皮细胞A549炎症分泌及凋亡影响

目的:探讨miR-221是否靶向脂联素受体1 AdipoR1基因影响脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞A549炎症分泌和凋亡。方法:随机将人肺泡上皮细胞A549分为对照组、LPS组和LPS+转染组,RT-qPCR法检测miR-221和AdipoR1 mRNA表达,Western blot法检测AdipoR1蛋白及凋亡相关因子Bax、Bcl-2蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法检测细胞培养上清液中炎性因子IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度,双荧光素酶报告基因检测miR-221是否靶向AdipoR1。结果:与对照组比较,LPS组细胞中miR-221及Bax蛋白表达升高(P<0.05),AdipoR1 miRNA和蛋白及Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度升高(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实miR-221靶向负调控AdipoR1的表达;抑制miR-221和过表达AdipoR1均能抑制LPS诱导肺泡上皮细胞分泌炎症因子,抑制细胞凋亡;抑...     

炎症状态下NF-κB-mTOR通路及转录因子RUNX1调控肾小管上皮细胞DC-SIGN表达研究

探讨炎症状态下NF-κB通路、mTOR通路以及转录因子RUNX1对肾小管上皮细胞DC-SIGN表达调控。体外培养肾小管上皮细胞株(HK-2)并经TNF-α刺激,分别给予NF-κB抑制剂(BAY 11-7082)和mTOR抑制剂(Rapamycin)干预。采用免疫印迹试验和实时定量PCR法检测HK-2细胞DC-SIGN表达;免疫印迹试验检测mTOR的磷酸化水平。用上述经TNF-α刺激的HK-2以及建立的肾炎损伤小鼠模型,以实时定量PCR法检测HK-2细胞以及分离的模型鼠肾小管上皮细胞中RUNX1表达。进一步利用HK-2构建过表达RUNX1稳定转染细胞株并经TNF-α刺激,实时定量PCR法检测RUNX1和DC-SIGN表达。结果显示,HK-2经TNF-α刺激模拟炎症状态下,可促进mTOR磷酸化并诱导DC-SIGN表达;NF-κB抑制剂和mTOR抑制剂均能抑制HK-2细胞的DC-SIGN表达,NF-κB抑制剂亦可抑制mTOR的磷酸化。还发现炎症因素刺激下,人和小鼠肾小管上皮细胞体内体外均明显表达RUNX1,且过表达RUNX1的HK-2细胞稳转株显著表达DCSIGN,并在TNF-α刺激下可进一步上调DC-SIGN表达。本研究表明,肾脏微炎症状态下,NF-κB-mTOR通路以及转录因子RUNX1均参与了肾小管上皮细胞DC-SIGN的表达调控。提示此过程中,NF-κB通路作为mTOR上游通路,通过激活后者参与DC-SIGN表达,而转录因子RUNX1可能是启动DC-SIGN表达的关键调控因素。     

RNAi沉默NF-κB p65对小鼠巨噬细胞细胞因子表达的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术在抑制NF-κB p65表达、调控LPS活化后巨噬细胞细胞因子表达中的应用.方法:利用阳离子脂质体将NF-κB p65小干扰RNA(siRNA)瞬时转染入Ana-1细胞,RT-PCR及Western blotting法检测其沉默效率,ELISA法检测LPS(1 mg/L)刺激下0 h、4 h、12 h和24 h Ana-1细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10浓度.结果:NF-κB p65 siRNA转染24 h后,NF-κB p65在基因水平及蛋白水平表达均被明显抑制(P<0.05).RNA干扰组Ana-1细胞培养上清中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达在相应时点内均较对照组明显降低(P<0.05),IL-10表达显著升高,在12 h和24 h差异显著(P<0.05).结论:体外实验初步证实RNAi技术能有效沉默小鼠巨噬细胞NF-κB p65基因的表达,下调其下游调控的促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及上调抑炎症细胞因子IL-10的表达,从而抑制过度的炎症反应.     

白藜芦醇抑制脂多糖诱导破骨前体细胞Raw264.7的激活

目的探讨白藜芦醇(Res)对脂多糖(LPS)诱导的破骨前体细胞Raw 264.7细胞系释放炎性细胞因子的抑制作用。方法采用LPS刺激Raw 264.7细胞构建炎症模型,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定细胞,采用MTT检测Res对Raw 264.7细胞的毒性影响,免疫荧光双标以及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测不同浓度Res(1μmol/L和5μmol/L)对细胞炎性因子:肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)与细胞炎性蛋白酶:诱导型一氧化氮合酶(i NOS)和环氧合酶-2(COX-2)、炎性信号蛋白核因子-κB(NF-κB)蛋白与mRNA的表达变化。结果不同浓度的Res(1μmol/L和5μmol/L)在翻译水平和转录水平上明显抑制了LPS诱导的细胞炎性蛋白酶i NOS和COX-2表达,同时了抑制细胞炎性因子IL-1β与炎性信号蛋白NF-κB的上调。结论 Res可能通过NF-κB调控LPS诱导的Raw 264.7细胞炎性细胞因子的释放进而抑制破骨前体细胞的激活,进而具有抗骨质疏松的作用。     

NF-κB介导脂氧素A4拮抗TNF-α所致的系膜细胞白介素的合成

为研究脂氧素A4(LXA4)拮抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肾小球系膜细胞的白介素(IL)-1β(IL-1β)、IL-6合成的作用。对体外培养大鼠肾小球系膜细胞,用不同浓度的LXA4预刺激,再加入TNF-α共同孵育;或单用TNF-α刺激肾小球系膜细胞。在孵育后用ELISA法检测培养上清中的IL-1β、IL-6蛋白表达量;用RT-PCR法检测IL-1β、IL-6的mRNA表达量。应用凝胶电泳迁移率试验(EMSA)测定核因子-κB(NF-κB)的DNA结合活性。结果发现,LXA4呈剂量依赖性地抑制TNF-α诱导的肾小球系膜细胞IL-1β和IL-6蛋白的合成与mRNA表达,抑制NF-κB的DNA结合活性。说明LXA4通过下调NF-κB的DNA结合活性,拮抗TNF-α对肾小球系膜细胞的IL-1β、IL-6合成的促进作用。     

沉默NF-κB/p65对TNF-α诱导的肺泡Ⅱ型上皮NOX1基因表达的影响

目的构建急性肺损伤肺泡Ⅱ型上皮A549细胞炎症模型,通过沉默NF-κB基因,观察NOX1基因表达水平及氧化应激指标变化,探讨NOX1基因与NF-κB/p65的相关性。方法运用RNA干扰技术沉默NF-κB/p65基因,以TNF-α(10 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549),采用RT-PCR及Western blot检测NOX1基因表达水平,DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧水平,比色法检测细胞的总抗氧化能力、总谷胱甘肽、总超氧化物歧化酶活力和丙二醛的浓度。结果采用TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮A549细胞可以分别在基因和蛋白水平上调NOX1基因表达;同时,增加细胞丙二醛和活性氧浓度,降低总抗氧化能力、总谷胱甘肽及超氧化物歧化酶浓度,氧化应激程度放大(P0.05)。预转染NF-κB/p65 siRNA,可下调NOX1基因的表达,减少细胞丙二醛、活性氧生成,提高总抗氧化能力、总谷胱甘肽及超氧化物歧化酶浓度,氧化应激程度降低(P0.05)。结论沉默NF-κB/p65基因,可有效下调TNF-α诱导A549细胞氧化应激程度及NOX1基因表达水平,提示NF-κB/p65可能参与调控TNF-α诱导的NOX1基因表达。     

核转录因子在二氧化硅刺激巨噬细胞产生细胞因子中的作用

目的 探讨二氧化硅(SiO2)刺激巨噬细胞生成肿瘤坏死因子(TNF)-α、转化生长因子(TGF)-β1增多的分子机制及核转录因子Egr-1和NF-κB介导的信号通路在硅肺发生发展中的作用。方法 Egr-1或NF-κB抗体和反义寡核苷酸分别处理巨噬细胞后,用ELISA法检测细胞上清液中TNF-α蛋白的含量;免疫细胞化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测细胞中TGF-β1蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TNF-α和TGF-β1mRNA的表达。结果 与非抗体处理组比较,SiO2刺激下抗体处理组巨噬细胞生成TNF-α蛋白和TGF-β1蛋白减少,其mRNA表达也相应下降(P<0.05);与未转染和转染正义寡核苷酸的细胞相比,Egr-1或NF-κB反义寡核苷酸转染细胞后,在SiO2刺激下巨噬细胞生成TNF-α蛋白和TGF-β1蛋白减少,二者mRNA表达也相应下降(P<0.05)。结论 SiO2刺激巨噬细胞生成TNF-α和TGF-β1可能主要是经核转录因子Egr-1和NF-κB介导,Egr-1与NF-κB抗体和反义寡核苷酸的应用可能会导致早期肺泡炎的活动性下降,延缓或阻止肺纤维化的形成。     

银杏提取物降低丙烯酰胺诱导的小鼠小胶质细胞炎性反应及机制

目的研究低浓度丙烯酰胺(ACR)长期刺激下,银杏提取物(GBE)调控小胶质细胞炎性反应的分子机制。方法小胶质细胞取自新生小鼠大脑,采用(0.01～10)mmol/L ACR刺激48 h,用CCK-8法检测细胞增殖、免疫荧光细胞化学染色法检测裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)确定ACR最优浓度为0.1 mmol/L。GBE给药方法为100 mg/L GBE预处理2 h。ACR刺激48 h后,免疫荧光细胞化学染色法检测小胶质细胞离子钙接头蛋白分子1 (IBA-1)、核因子κB (NF-κB)的表达及分布情况, Griess反应检测培养液中一氧化氮(NO)水平, ELISA检测培养液白细胞介素6(IL-6)、 IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;实时定量PCR检测IBA-1和IL-6、 IL-1β、 TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA水平,染色质免疫共沉淀法检测p65、核受体相关蛋白1 (Nurr1)、 RE-1沉默转录因子共抑制物(CoREST)等转录因子在炎症细胞因子基因启动子区域NF-κB结合位点的结合程度变化;蛋白免疫共沉淀法检测Nurr1与CoREST蛋白的相互作用。结果低浓度ACR长期刺激将静息态小胶质细胞转变为激活态,通过NF-κB通路激活IL-6、 IL-1β、 TNF-α基因转录表达,促使小胶质细胞释放大量炎症细胞因子。GBE预处理显著改善小胶质细胞的炎症态应激,减少其炎症细胞因子的释放。在炎症细胞因子基因启动子区域的NF-κB结合位点上, GBE能够减少招募NF-κB亚单位p65,并增加招募Nurr1-CoREST复合物以抑制基因的转录表达。结论 GBE通过Nurr1/CoREST反式抑制NF-κB通路,改善小胶质细胞因长期低浓度ACR刺激引发的炎症反应。     

姜黄素抑制肺上皮细胞BEAS-2B真菌产生炎症细胞因子的作用

目的探讨姜黄素(Cur)抑制肺上皮细胞BEAS-2B真菌产生炎症细胞因子的作用。方法黄曲霉菌(AFT)感染肺上皮细胞BEAS-2B后,用不同浓度的姜黄素(10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L)进行抗炎抑制作用。采用ELISA法检测细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-Iβ、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TLR4和NF-κB的表达水平;采用Western blot和Real-time PCR检测重组高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)、TLR4和NF-κB蛋白和m RNA表达。结果随着姜黄素剂量的升高,细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-Iβ、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TLR4和NF-κB的表达显著降低(P0.05);HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白和m RNA表达明显降低(P0.05)。结论姜黄素调节TLR4/NF-κB信号通路来产生抗炎作用,可以抑制真菌刺激肺上皮细胞BEAS-2B产生炎症细胞因子。     

鹰嘴豆芽素A通过PPARα/γ抑制脂多糖诱导猪外周血单个核细胞炎性细胞因子的分泌

目的:研究鹰嘴豆芽素A对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导猪外周血单个核细胞分泌炎性细胞因子的影响。方法:用鹰嘴豆芽素A(50,100μmol/L)处理猪外周血单个核细胞,采用ELISA方法检测其对LPS刺激后细胞分泌肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)的影响,并用RT-PCR法检测这些细胞因子mRNA的表达,用Western blot法检测核因子κB(Nuclear factorκB,NF-κB)由细胞浆移位至细胞核内情况以判断NF-κB活性变化;同时分别用过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α的拮抗剂MK886和PPARγ的拮抗剂GW9662与鹰嘴豆芽素A共同处理猪外周血单个核细胞,观察鹰嘴豆芽素A在PPARα或PPARγ的活性被抑制时对NF-κB活性的影响。结果:鹰嘴豆芽素A能显著降低LPS诱导猪外周血单个核细胞的TNF-α、IL-6的分泌和mRNA的表达;同时鹰嘴豆芽素A显著抑制了LPS诱导猪外周血单个核细胞NF-κB的激活,而此抑制作用均被MK886或GW9662减弱。结论:鹰嘴豆芽素A可通过PPARα和PPARγ抑制LPS诱导猪外周血单个核细胞NF-κB的活化,从而下调LPS诱导的TNF-α、IL-6的生成。     

LRRFIP1基因干扰对脂多糖诱导的支气管上皮细胞炎症、氧化应激和细胞凋亡的影响

目的探讨富亮氨酸重复序列相互作用蛋白1(LRRFIP1)基因对脂多糖(LPS)诱导的支气管上皮细胞炎症、氧化应激和细胞凋亡的影响及其作用机制。方法使用LPS处理人支气管上皮细胞株16HBE,并利用Lipofectamine 2000试剂将siLRRFIP1转染到16HBE细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测LRRFIP1 mRNA表达;免疫印迹试验(Western blot)检测LRRFIP1、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、p65、磷酸化p65(p-p65)、IκBα和IκBα和磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白表达;噻唑蓝(MTT)检测细胞活力;试剂盒检测细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)水平和炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌;流式细胞术检测细胞凋亡。结果LPS诱导的16HBE细胞中LRRFIP1 m RNA、LRRFIP1蛋白表达量、Cleaved caspase-3、Bax、p-p65、p-IκBα蛋白表达量、MDA、LDH、IL-1β、IL-6、TNF-α水平和细胞凋亡率显著提高(P0.05),CyclinD1、Bcl-2蛋白水平、细胞活力、SOD活性和IL-10水平明显降低(P0.05),而p65和IκBα蛋白表达量无显著变化。抑制LRRFIP1明显减少LPS诱导的16HBE细胞中LRRFIP1、Cleaved caspase-3、Bax、p-p65、p-IκBα蛋白表达量、MDA、LDH、IL-1β、IL-6、TNF-α水平和细胞凋亡率(P0.05),并显著增加CyclinD1、Bcl-2蛋白水平、细胞活力、SOD活性和IL-10水平(P0.05),对p65和IκBα蛋白水平无明显影响。结论抑制LRRFIP1可能通过下调NF-κB信号通路活性及促进脂多糖损伤的支气管上皮细胞的增殖,减轻细胞炎症和氧化应激,并抑制细胞凋亡。     

血管紧张素Ⅱ1型受体在脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞促炎性细胞因子产生中的作用

目的 探讨血管紧张素Ⅱ1型受体在脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞促炎性细胞因子产生中的作用和机制.方法 按照随机数字表法将小鼠单核巨噬细胞株（RAW264.7）细胞分为空白对照组、ZD7155组、LPS组和LPS ＋ZD7155组.酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的含量,逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测RAW264.7细胞内TNF-α和IL-1β mRNA表达,凝胶电泳迁移检测法（EMSA）检测RAW264.7细胞内核因子-κB（NF-κB）和活化蛋白-1（AP-1）活性的变化.结果 和空白对照组相比,ZD7155组培养上清液中的TNF-α和IL-1β含量差异没有统计学意义（P＞0.05）,但是LPS组细胞培养上清液中的TNF-α和IL-1β含量均显著高于空白对照组（均P〈0.01）和ZD7155组（均P〈0.05）.LPS组细胞内的TNF-α和IL-1β mRNA表达是空白对照组的2.19倍（P〈0.01）和1.77倍（P〈0.01）,细胞内NF-κB和AP-1活性是空白对照组的1.43倍（P〈0.01）和1.90倍（P〈0.01）.而LPS＋ZD7155组上清液中的TNF-α和IL-1β含量较LPS组下降（均P〈0.05）,细胞内TNF-α和IL-1β mRNA表达较LPS组下降了34.7%（P〈0.01）和49.72%（P〈0.01）,同时细胞内NF-κB活性和AP-1活性较LPS组下降了46.15%（P〈0.05）和48.42%（P〈0.05）.结论 血管紧张素Ⅱ1型受体通过活化转录因子NF-κB和AP-1,参与了LPS诱导巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的产生和释放.     

JNK3抑制NF-κB转录活性的研究

目的研究人c-Jun氨基末端激酶3(c-Jun N-terminal kinases3,JNK3)对核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)转录活性的影响。方法构建人JNK3真核表达载体pcDNA3.1-JNK3,与3×κB-luc报告基因质粒共转染人胚胎肾细胞293(HEK293),分别进行如下处理:共转染50ngpCMV-Myc-p65质粒;转染24h后,加入浓度为10ng/ml的TNF-α或IL-1β刺激6h,收集细胞,检测荧光素酶活性。结果成功构建了pcDNA3.1-JNK3真核表达载体;提高细胞内p65水平,加入TNF-α或IL-1β刺激均可明显激活NF-κB的转录,JNK3对NF-κB的转录活性有明显抑制作用,且随着JNK3转染剂量的增加,抑制作用增强。结论JNK3能明显抑制NF-κB的转录活性。     

三七皂苷Rg1抑制脂多糖诱导的小胶质细胞激活

目的 探讨三七皂苷Rg1(Rg1)对脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞系BV-2细胞炎性因子释放的抑制作用.方法 用LPS刺激BV-2细胞构建炎症模型,采用四甲基偶氮唑盐比色法检测Rg1对BV-2细胞活力的影响,免疫荧光染色和反转录PCR方法检测不同浓度Rg1(10、20、40μmol/L)对细胞炎性蛋白酶诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2 (COX-2)、细胞炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)、炎性信号分子NF-κB蛋白与mRNA的表达变化.结果 不同浓度的Rg1在转录水平和翻译水平上明显抑制了LPS诱导的细胞炎性蛋白酶iNOS和COX-2、细胞炎性因子TNF-α和IL-1β与炎性信号分子NF-κB的上调,并且iNOS、COX-2和NF-κB的表达呈剂量依赖性.结论 Rg1可通过调控LPS诱导的小胶质细胞系BV-2细胞炎性因子释放从而抑制小胶质细胞激活,发挥抗神经炎症的作用.