鼠源性血管抑素cDNA在人肝癌细胞SMMC-7721中的稳定表达及意义

目的 将血管抑素基因转染入人肝癌细胞SMMC－7721中,观察其表达效果衣其对细胞本身的影响,并探讨血管抑素治疗动物种植性肿瘤的效果。方法 将鼠源性血管抑素基因插入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建重组质粒,用HindⅢ和XbaⅠ双酶切及基因测序进行鉴定。然后用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-mAST转染入人肝癌细胞SMMC－7721中,并行RT－PCR鉴定和Western-blot检测其表达效果。结果 鼠血管抑素基因成功克隆人真核表达载体pcDNA3.1( )中;经脂质体法转染入SMMC－7721细胞并获稳定表达;转染血管抑素和未转染血管抑素的SMMC－7721细胞生长速度无明显差异。结论 鼠血管抑素基因在人肝癌细胞SMMC－7721中可获稳定表达,但对细胞本身生长无明显抑制作用。     

人颗粒溶素基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究

目的： 构建人颗粒溶素（GNLY） 全长编码序列的真核表达载体,转染肿瘤细胞,观察GNLY在细胞内的表达及其对细胞增殖的抑制作用. 方法：用RT-PCR技术获取人GNLY 全长编码序列cDNA,克隆至pGEM-T 载体进行测序,再将克隆片段插入质粒pcDNA3.1（＋）中,构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY,用阳离子聚合物转染试剂转染肝癌细胞系SMMC-7721,检测目的基因mRNA的表达,WST-8法检测细胞增殖活性. 结果：获得人GNLY全长编码序列cDNA ,并成功构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY;转染SMMC-7721细胞后,检测出目的基因mRNA的表达;重组质粒转染组与空质粒对照组细胞增殖活性有非常显著性差异（P〈0.01和P〈0.001）,并且随着转染基因浓度的增加,细胞增殖活性逐渐降低,2.0μg/ml pcDNA3.1（＋）/GNLY转染组细胞增殖活性下降至0.329. 结论：pcDNA3.1（＋）/GNLY真核表达载体构建成功,GNLY基因转染对SMMC-7721细胞能产生细胞毒性效应,对肝癌细胞具有一定的杀伤作用.     

人血管内皮生长因子shRNA真核表达载体对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖影响

目的:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,观察对其增殖影响。方法:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,ELISA法检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达量,检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的增殖及细胞的克隆形成能力的变化。结果:VEGF shRNA真核表达载体大部分阻断肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达,转染后细胞周期中,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞增殖能力降低;MTT法观察细胞生长速度变慢,单个细胞的克隆形成能力明显下降。结论:VEGF shRNA真核表达载体可明显抑制SMMC-7721细胞增殖能力,为将VEGF shRNA真核表达载体应用于肝癌的基因治疗提供依据。     

人血管内皮生长因子基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段。构建pcDNA3／VEGF165真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株SMMC-7721中扩增出血管内皮生长因子VEGF165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3真核表达载体上,构建成pcDNA3／VEGF165重组质粒,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人VEGF165cDNA。结论：本实验成功地克隆了VEGF165基因并构建了其真核表达质粒。为进一步研究用VEGF基因转染的方法来恢复或增强放疗后组织的血管生成能力奠定了基础。     

人MT1-MMP真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达及意义

目的：克隆人膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因,构建真核表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人正常肝组织中扩增MT1-MMP全长cDNA,将之与pMD18-T载体连接,测序后将该片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。将构建好的pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经酶切鉴定后,采用脂质体法转染入HepG2细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。应用RT-PCR检测转染前后该细胞株MT1-MMP mRNA表达水平。结果：①RT-PCR获得长度约为704 bp的目的片段,与预期片段相符;②将pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,得到约5 400 bp和704 bp两个片段,测序结果证实所插入目的片段与GenBank中MT1-MMP cDNA序列匹配;③重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平（1.66±0.43）明显高于空质粒组（1.21±0.25）和对照组（1.19±0.18)(P<0.01）。结论：成功构建pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体,并在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达。     

重组人肿瘤抑素分泌型真核表达载体的构建及其表达

目的 构建重组人肿瘤抑素分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达.方法 以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin.以pGEM-T/tumstatin为模板扩增含Ⅳ型胶原信号肽sig基因的sig-tumstatin基因片段,sig-tumstatin 片段经酶切后,插入经同样酶切的pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tum-statin基因片段及重组载体进行验证.将重组sig-tumstatin 真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测.结果 所获得的sig-tumstatin片段(822 bp)序列与报道的序列完全一致.酶切鉴定的结果表明含重组人肿瘤抑素的pIRESneo3/sig-tumstatin表达载体构建成功.转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin的CHO-K1分泌表达了重组人tum-statin.另外,从生长曲线结果来看,转染了 pIRESneo3/sig-tumstatin真核表达载体和空载体的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢一些.结论 成功地构建了重组人tumstatin分泌型真核表达载体并获得能稳定表达tumstatin的CHO-K1,为开展下一步的实验奠定了基础.     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.     

鼠血管抑素Angiostating真核表达载体的构建及在人胃癌细胞中的表达

目的：构建鼠源性血管抑素agniostatin cDNA真核表达载体,转梁人胃癌细胞株SCG7901,检测蛋白表达,方法：采用定向克隆构建鼠源性血管抑素angiostatin cDNA真核表达载体pcDNA3.1( )-angiostatin,酶切鉴定和测序,彩用脂质体基因转染人胃癌细胞株SCG7901,G418抗性筛选,Western blot检测血管抑素的表达,结果：酶切鉴定和测序证明成功构建了基因序列正确的血管抑素直核表达载体,经G418筛选和Western blot检测得到表达血管抑素的细胞株,结论：真核表达载体pcDNA3.1( )-angilstatin转导的人胃癌细胞肥够表达血管抑素蛋白,在胃癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值。     

重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α的分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的稳定表达。方法以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin。利用PCR从pGEM-T/tumstatin和PBV220-TNF-α载体中分别扩增出sig-tumstatin-linker和linker-TNF片段,将其克隆得到sig-tumstatin-linker-TNF片段,sig-tumstatin-linker-TNF片段经酶切后,插入经同样酶切pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tumstatin-linker-TNF基因片段及重组载体进行验证。将重组sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测。结果所获得的sig-tumstatin-linker-TNF片段(1.32kb)序列与报道的序列完全一致。酶切鉴定的结果表明含肿瘤抑素基因的重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF表达载体构建成功。转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF的CHO-K1表达了肿瘤抑素融合蛋白tumstatin-linker-TNF。从生长曲线结果来看,转染pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体和转染pIRESneo3的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢。结论成功地构建了重组人肿瘤抑素融合蛋白的真核表达载体,并获得能稳定表达人肿瘤抑素融合蛋白的CHO-K1。     

人同源盒基因NKX3.1cDNA真核表达载体的构建及表达

目的：构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC 3、LNCaP中的表达情况。方法：以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,T/A克隆至pCR2.1载体中。经酶切、测序鉴定后,将NKX3.1cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中。将pcDNA3.1 NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP 细胞,RT PCR和Western blot法检测NKX3.1cDNA在转录水平和蛋白水平的表达。结果：人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1经酶切及测序鉴定正确。 pcDNA3.1 NKX3.1转染PC 3和LNCaP细胞后,经RT PCR和Western blot证明在mRNA和蛋白水平均能有效表达NKX3.1。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP后能有效表达。     

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 

目的：构建人B细胞易位基因2（BTG2）真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法：利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果：将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG 抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论：成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因,构建angioarrestin基因的真核表达载体.方法:从人肝cDNA文库中经PCR扩增出angioarrestin基因及其C-端FD domain,经纯化、回收目的片段,将其插入克隆载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B,构建重组质粒pcDNA3.1-ARP和 pcDNA3.1-FD,稳定转染大细胞肺癌NCI-H460细胞,RT-PCR和Western印迹法鉴定.结果:从人肝cDNA文库中扩增出1 473 bp的angioarrestin目的片段及其C-端560 bp FD domain,构建的重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD 经PCR及酶切鉴定与预期相符,经RT-PCR和Western印迹法确定稳定转染NCI-H460细胞成功.结论:成功构建了angioarrestin 和C-FD基因的真核表达重组质粒并转染NCI-H460细胞,为angioarrestin抗肿瘤血管形成作用机制的研究奠定了初步基础.     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人类TSLC1基因并构建其真核表达载体pcDNA3.1( )/TSLC1.方法:从正常皮肤组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增TSLC1基因全长cDNA,克隆入pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸测序分析,再将TSLC1基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体.结果:RT-PCR扩增后的产物在约1413 bp处出现明显的特异性条带,TSLC1基因的cDNA片段被成功插入真核表达载体pcDNA3.1( )质粒的多克隆位点,经鉴定与GenBank收录的TSLC1 cDNA 序列一致.结论:TSLC1基因的cDNA片段被成功克隆,为以后的研究奠定了基础.     

Construction and identification of eukaryotic eukaryotic expression plasmid pcdna3.1-bace and its transient expression in cells

Objective： To generate eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-BACE and obtain its transient expression in COS-7 cells and high expression in the neuroblastoma SK-N-SH cells. Methods： A 1503 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of human neuroblastoma by RT-PCR method and cloned into plasmid pcDNA3.1. The vector was identified by digestion with restriction enzymes BamHI and XhoI and sequenced by Sanger-dideoxy：mediated chain termination. The expression of BACE gene was detected by immunocytochemistry method. Results： The results showed that the cDNA fragment included 1503 bp total coding region. The recombinant eukaryotic cell expression vector of pcDNA3.1-BACE was constructed successfully, and the sequence of insert was identical to the published sequence. The COS-7 cells and the neuroblastoma SK-N-SH cells transfected with the pcDNA3.1-BACE plasmid expressed high level of BACE protein in cytoplasm. Conclusion： The recombinant plasmid pcDNA3.1-BACE can provide very useful tool for researching the mason of Alzheimer＇s disease and lays the important foundation for preventing the AD laterly.     

重组GSTP1真核表达质粒的构建及稳定转染NCI-H520细胞系的建立

目的构建pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞N C I-H 520中,建立稳定转染的N C I-H 520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以pD N R-LIB-G STP1为模板,用PC R扩增G STP1 cD N A的编码区,并将扩增的cD N A片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pcD N A3.1(+)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系N C I-H 520,经G 418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用W estern blotting检测转染前后该细胞株G STP1基因在蛋白水平的表达。结果 pcD N A3.1(+)/G STP1经酶切鉴定及D N A测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经W estern blotting检测,重组质粒转染株中G STP1基因的蛋白表达水平明显高于对照组,证实G STP1基因已稳定转染到N C I-H 520细胞中并得到表达。结论成功构建了pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达质粒,建立了稳定表达G STP1的N C I-H 520细胞系,为进一步研究G STP1的生物学功能奠定了基础。     

人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及体外转染的生物学活性测定

目的：构建人淋巴细胞趋化因子(HLptn)真核表达质粒，在膀胱肿瘤细胞株BIU-87中表达重组质粒，并检测趋化活性。方法：用RT-PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增HLptn含编码区序列的cDNA，克隆至pGM-T Easy T载体，测序正确后，将目的片段插入pcDNA3．1( )载体，获得阳性克隆pcDNA3．1( )．HLptn；用脂质体介导其转染BIU-87细胞，用Western-blot检测转染后细胞中HLptn的表达；取转染后的上清液，采用Boyden小室法检测表达的HLptn趋化CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞的生物学活性。结果：克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同，系同义突变，构建了真核重组表达载体pcDNA3．1( )-HLptn；转染的BIU-87细胞表达HLptn，其培养上清对CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞具有趋化活性。结论：成功构建的HLptn真核表达系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU-87中表达。