原代培养人肝细胞的简易高效法

二步胶原酶灌注术分离大鼠肝细胞已比较成熟,但是用大鼠肝细胞所得的实验结果还需外推于人,而人的整肝或肝叶的获取来源极其有限,不宜在一般实验室推广[1]。人肝癌细胞、传代肝细胞株等体外虽然容易增殖,但其生物学特性已发生显著变化,因此,原代人肝细胞是公认用来研究药物代谢     

大鼠肝细胞的原代培养及鉴定

目的：探讨大鼠肝细胞原代培养的方法及细胞的鉴定。方法：采用胶原酶消化获取大鼠肝细胞进行纯化、培养。并采用免疫组织化学方法对其进行鉴定。结果：培养的肝细胞产量高、活力好，用相差显微镜对不同生长时期的肝细胞进行观察证实了细胞贴壁后变平变薄，双核细胞和多核细胞呈岛状连接的形态学特性，采用抗大鼠细胞角蛋白（ck18）的特异抗体进行免疫组化细胞爬片鉴定，经SP染色DAB显色后，阳性着色部位在胞浆呈棕黄色颗粒，阴性对照未见着色。结论：成功地体外培养了大鼠肝细胞并对其进行了鉴定，为进一步的实验研究奠定了基础。     

藏药蕨麻对原代培养小鼠肝细胞酒精损伤保护作用研究

目的 研究藏药蕨麻对原代培养酒精损伤肝细胞的保护作用。方法 原代肝细胞经分离纯化培养后,MTT法评价藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞存活率的影响;荧光染色法测定藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞活性氧物质(ROS)含量、细胞内钙离子浓度的影响;流式细胞仪检测藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞凋亡的影响;免疫印迹法检测藏药蕨麻对Bcl-2和Bax表达的影响。结果 经酒精损伤后,肝细胞存活率降低;细胞内ROS含量和钙离子浓度增高;凋亡抑制基因Bcl-2减弱、促凋亡基因Bax表达增强。藏药蕨麻可明显提高细胞存活率;降低细胞内ROS含量和钙离子浓度;改善凋亡情况,增强Bcl-2表达,抑制Bax表达,且作用呈剂量依赖性。结论 藏药蕨麻对原代培养小鼠肝细胞酒精损伤具有一定的保护作用。     

大鼠原代肝细胞分离培养的实验研究

目的:探讨胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞及培养的可行性.方法:取10只SD大鼠,按照改良Seglen原位两步胶原酶灌流法分离培养原代肝细胞.以SD大鼠作为肝细胞供体,采用Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注,下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离肝细胞,经200目筛过滤,滤液以200 r/min离心3～5 min,重复3次,纯化肝细胞.台盼蓝拒染实验检测分离细胞活性.将10只SD大鼠分离得到的肝细胞混合,稀释50倍后接种于包被有鼠尾胶原的培养皿或培养板中,倒置显微镜下观察分离肝细胞的形态特征,糖原染色法(PAS法)鉴定分离肝细胞,MTT法测定肝细胞在培养不同时期的增殖情况.结果:平均每只大鼠肝脏分离获得(1.8±0.14) ×108/mL肝细胞,细胞活率＞85％.肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS染色后被染成红色.MTT实验结果表明在培养的第八天肝细胞增殖达到峰值,培养的第九天细胞活力开始下降.结论:采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种简单、高效的获得肝细胞的方法.     

昆明种乳鼠肝细胞原代培养方法的比较研究

目的 通过比较3种昆明鼠乳鼠肝细胞原代培养的方法,探索一种更有效、快捷的原代培养方法。方法 取30只1~3日龄昆明种乳鼠,随机分为3组,分别采用组织块培养法、胰酶消化法、组织块联合胰酶消化法进行肝细胞原代培养,用倒置显微镜观察实验过程中肝细胞的形态及生长情况。结果 3种方法均能进行乳鼠肝细胞的原代培养,其中组织块联合胰酶消化法培养的肝细胞形态学和生物学特性优于其他两种方法培养的细胞。结论 组织块联合胰酶消化法是3种方法中最快速和高效的一种方法,获得的乳鼠肝细胞形态及生物学特性好,为体外建立乳鼠肝细胞实验模型奠定了实验基础。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

酮康唑对原代培养大鼠肝细胞的毒性作用及其机制

目的观察酮康唑（ketoconazole，KCZ）对原代培养大鼠肝细胞的毒性效应，探讨其可能的毒性机制。方法采用胶原酶二步灌流法分离制备雄性SD大鼠肝细胞，进行原代培养。量效关系研究中KCZ设56、75、94、113和188μmol／L，染毒时间4h；时效关系研究中KCZ设188μmol／L，染毒时间分别为0．5、1、2和4h；同时设溶剂对照。检测染毒后肝细胞活力、胞内LDH泄漏情况以及巯基状态的变化。结果（1）量效关系研究中，随着KCZ剂量的升高，肝细胞活力逐渐下降，培养液中LDH活力逐渐增高，肝细胞内巯基也呈下降趋势，上述指标均有明确的剂量．反应关系（γLDH=0．906，P〈0．01）；（2）时效关系研究中，KCZ在188μmol／L剂量下染毒后肝细胞活力呈时间依赖性下降；培养液中LDH活力随染毒时间延长逐渐增高；细胞内巯基出现相应性下降。结论KCZ可以导致肝细胞活力下降，胞内LDH泄漏，巯基含量减少，并有明确的量效和时效关系，提示酮康唑对肝细胞的毒作用可能与细胞内巯基状态改变有关。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

肉苁蓉总苷对原代培养小鼠肝细胞酒精损伤保护作用研究

目的:研究肉苁蓉总苷对原代培养肝细胞的保护作用。方法:采用原位灌流法收集原代肝细胞,MTT法评价肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响;荧光显微镜技术评价肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞及细胞核形态的影响;流式细胞仪检测肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响;免疫细胞化学染色法检测肉苁蓉总苷对bcl-2和c-fos表达的影响。结果:原代肝细胞经酒精损伤后,存活率降低,出现明显凋亡和坏死改变,凋亡抑制基因bcl-2减弱、促凋亡基因c-fos表达增强。肉苁蓉总苷可明显提高细胞存活率,改善凋亡和坏死情况,增强bcl-2表达,抑制c-fos表达。且作用呈剂量依赖性。结论:肉苁蓉总苷可通过增加凋亡抑制基因bcl-2表达,减少促凋亡基因c-fos表达,减少凋亡和坏死,增加细胞存活率来实现对原代培养肝细胞的保护作用。     

肾小管上皮细胞原代培养及鉴定

目的探讨肾小管上皮细胞体外培养及鉴定方法。方法①采用机械分离结合酶消化法获取肾小管,原代培养肾小管上皮细胞。②利用动态观察、细胞化学染色法及细胞的透射电镜扫描进行鉴定。结果①肾小管段不同换液时间24h、48h、72h、96h、120h,贴壁率分别为:0.1378±2.048E-02、0.3300±7.969E-02、0.5411±3.919E-02、0.5344±2.506E-02、0.4389±3.018E-02,以72小时首次换液最佳。②肾小管上皮细胞成功原代培养并于第4～7天处于对数生长期。细胞碱性磷酸酶染色均呈阳性,透射电镜扫描见细胞面向液层的刷状缘有大量微绒毛形成。结论采用机械结合酶消化法可分离到较纯的肾小管,肾小管段培养72h首次换液细胞贴壁最佳,肾小管上皮细胞用化学结合形态学及鉴定。     

小鼠3T3-L1前脂肪细胞培养与诱导分化方法的建立

目的建立小鼠3T3-L1前脂肪细胞的培养及诱导分化为成熟脂肪细胞的方法。方法使用含10%胎牛血清（FBS）的高糖达氏修正伊氏培养基（DMEM）-F12液体培养基在体积分数5%二氧化碳（CO2）、37℃条件下常规培养3T3-L1细胞,2~3 d换液1次;诱导分化培养基Ⅰ培养2 d,诱导分化培养基Ⅱ培养2 d;基础培养基培养4~6 d,1~2 d换液1次。结果小鼠3T3-L1前脂肪细胞状态良好,成铺路石状生长,布满培养瓶底,3 d传代1次。90%以上细胞诱导分化成功,细胞呈圆形,有大量酯滴聚集,油红O染色呈橘红色。结论建立了小鼠3T3-L1前脂肪细胞的培养方法和诱导分化方法,为肥胖相关药物研究奠定了方法基础。     

Paradoxical potassium outward transport in hepatocytes exposed to high extracellular potassium concentration

Summary Isolated hepatocytes and perfused rat livers respond to high external potassium concentrations with a remarkable potassium loss which is completely inhibited by ouabain. In contrast the liver swelling induced by high K⁺-concentrations in perfused livers is not influenced by ouabain.     

细胞工厂培养原代地鼠肾细胞工艺的建立及优化

 目的  采用40层细胞工厂(40-layer cell factory, CF40)工艺培养原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞,优化乙脑减毒活疫苗的生产工艺。 方法  用不同浓度新生牛血清培养不同接种密度PHK细胞,比较各组PHK细胞数量,确定CF40工艺的PHK细胞接种密度和新生牛血清浓度。通过对比CF40和15 L转瓶采用不同新生牛血清的PHK细胞培养情况,比较两种工艺对新生牛血清的选择性。对4个厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析,判定对CF40的选择性。结果  CF40工艺的最有条件为PHK细胞接种密度为6.1×10⁵ ml^-1、新生牛血清浓度6%。CF40工艺对新生牛血清的选择性较低,能比转瓶工艺更稳定地培养更多的PHK细胞。4个厂家CF40培养的PHK细胞数量之间的差异无统计学意义（F=0.23,P＞0.05）,对CF40选择性低。 结论  采用CF40可以制备出满足乙脑减毒活疫苗生产要求的PHK细胞。     

单纯疱疹病毒2型感染的细胞培养系统的建立

目的建立稳定的单纯疱疹病毒2型（HSV-2）感染的细胞培养系统,为研究药物的抗HSV-2作用搭建一个良好的平台。方法以猴肾细胞（Vero）为繁殖细胞,选择人鼻咽癌上皮细胞（Hep-2）为靶细胞,观察HSV-2在Hep-2株中的致细胞病变效应（CPE）。结果HSV-2感染Vero细胞4d后大量繁殖;HSV-2感染Hep-2细胞12h后可出现明显的细胞病变。结论以Vero为繁殖细胞,Hep-2为靶细胞的细胞培养系统是研究药物抗HSV-2作用的良好的平台。     

Toxicity of aflatoxin B1 in rat and mouse hepatocytes in vivo and in vitro

The reported LD50 for the adult, male Fisher rat is 1.2 mg aflatoxin B1/kg body weight (i.p.); we have found that male C57BL/6 mice survive single doses of aflatoxin B1 as high as 60 mg/kg (i.p.). We have demonstrated a 1000-fold greater LC50 of aflatoxin B1 for primary mouse liver cell cultures from C57BL/6 male mice (3 X 10(-5) M) than for primary liver cells from F344 male rats (3 X 10(-8) M). In 4 h of exposure to a non-toxic dose (1 X 10(-9) M) of [3H]aflatoxin B1, cultured rat liver cells accumulated up to 5-fold higher concentrations of 3H label than did mouse liver cells. The difference in cell-associated counts was due largely to higher levels of aflatoxin B1 metabolites bound to macromolecules in the rat cells.     

细胞工厂培养原代地鼠肾细胞工艺的建立及优化

 目的  采用40层细胞工厂(40-layer cell factory, CF40)工艺培养原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞,优化乙脑减毒活疫苗的生产工艺。 方法  用不同浓度新生牛血清培养不同接种密度PHK细胞,比较各组PHK细胞数量,确定CF40工艺的PHK细胞接种密度和新生牛血清浓度。通过对比CF40和15 L转瓶采用不同新生牛血清的PHK细胞培养情况,比较两种工艺对新生牛血清的选择性。对4个厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析,判定对CF40的选择性。结果  CF40工艺的最有条件为PHK细胞接种密度为6.1×10⁵ ml^-1、新生牛血清浓度6%。CF40工艺对新生牛血清的选择性较低,能比转瓶工艺更稳定地培养更多的PHK细胞。4个厂家CF40培养的PHK细胞数量之间的差异无统计学意义（F=0.23,P＞0.05）,对CF40选择性低。 结论  采用CF40可以制备出满足乙脑减毒活疫苗生产要求的PHK细胞。     

The metabolism of 7-ethoxycoumarin in primary maintenance cultures of adult rat hepatocytes

Summary 7-Ethoxycoumarin is metabolized to 7-hydroxycoumarin in short-term (1–4 days) maintenance cultures of adult rat hepatocytes. The 7-hydroxycoumarin is predominantly found as the sulphate and glucuronic acid conjugates. This pattern of metabolism is very similar to that observed with freshly-isolated rat hepatocytes and suggests that the culture system may be of value in studying the metabolism of novel chemicals designed for human therapeutic use. The specific activity of microsomal monooxygenase activity falls by 50–60% during 4 days in culture. This is not reflected by the sulphate and glucuronic acid conjugation pathways which are retained at normal levels throughout the entire 4-day culture period.     

响应面法优化MDCK-siat7e细胞培养工艺

目的 以响应面法优化MDCK-siat7e细胞培养条件.方法 以MDCK-siat7e细胞培养的起始氨浓度、乳酸浓度、渗透压和活细胞密度(viable cell density,VCD)为因子,以MDCK-siat7e细胞培养的72 h细胞比生长率、细胞活率、乳酸比生成率和氨比生成率为响应值,采用全因子实验设计和响应面分析来研究这些因子对MDCK-siat7e细胞培养的影响.结果 在MDCK-siat7e细胞培养过程中,对72 h细胞比生长率有显著影响的因子是起始VCD(t=3.43,P＜0.05);对72 h细胞活率有显著影响的因子是起始乳酸浓度(t=4.32,P＜0.05)和氨浓度(t=2.86,P＜0.05);对72 h乳酸比生成率有显著影响的因子是起始乳酸浓度(t=8.92,P＜0.05)、渗透压(t=4.11,P＜0.05)和VCD(t=2.66,P＜0.05),其中乳酸浓度起主要作用;对72 h氨比生成率有显著影响的因子是起始氨浓度(t=2.63,P＜0.05).结论 用响应面法优化MDCK-siat7e细胞培养工艺可对该细胞培养过程中的条件控制起指导作用.     

Glutathione and glutathione-related enzyme activities of male and female rat hepatocytes under various culture conditions

 The effect of culture medium on glutathione (GSH) dependent detoxification defence system of primary cultured hepatocyte from either male or female rats was studied. Intracellular reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG), and six GSH-related enzyme activities, including GSH peroxidase (GSH Px), GSH reductase (GSH Rd), cytosolic GSH S-transferase (cGST), microsomal GSH S-transferase (mGST), γ-glutamyl transpeptidase (GTP), and γ-glutamylcysteine synthetase (GCS), were investigated during a 6-day culture. Media free of fetal bovine serum (FBS) and with 2.5 or 10% FBS were used. Whatever the medium, there was an initial increase of intracellular GSH and GSSG, a threefold increase of GSH at day 3 and fourfold increase of GSSG at day 4, later decreasing to their original level at day 6. The activities of all six GSH-related enzymes of male and female hepatocytes remained relatively stable during the first 72 h, then gradually decreased to 50–80% of initial activities. With the exception of cGST, time-course profiles of other enzyme activities were not significantly different among various media. In both sexes, higher cGST activity was maintained for cells cultured in the presence of FBS. Results of immunoblotting analysis of cytosolic GST isozymes indicate that the placental form of GST (Yp) was markedly increased after plating and the extent of increase of Yp was higher in the presence of FBS. Despite the culture medium, the level of GST isoform Ya was maintained steadily for 6 days, however, Yb was maintained during the first 3 days and then decreased. In terms of the gender difference, GSH Px and GTP activities of hepatocytes from females were significantly greater than of males over the entire culture period. Results indicate that FBS seems not to be absolutely essential in maintaining GSH level and most of the GSH-related enzyme activities in rat hepatocytes. Furthermore, GSH levels and GSH-related enzyme activities of hepatocytes from female rats were similar to those from male rats. Received: 10 January 1996/Accepted: 3 May 1996