肌苷对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和卡配因基因表达的影响

①目的　研究肌苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和卡配因基因表达的影响 ,探讨肌苷的神经保护作用机制。②方法　取成年健康雌性SD大鼠 6 8只 ,随机分为治疗组和对照组 ,每组再随机分为缺血1.5h再灌注 2h、6h、12h、1d、2d、3d、7d、14d组 (n =4 ) ,另外 4只为假手术组。应用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉阻塞 (MCAO)再灌注模型 ,腹腔注射肌苷注射液 (10 0mg/kg) ,原位末端标记 (TUNEL)和原位杂交技术分别观察大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和卡配因mRNA表达。③结果　脑缺血再灌注后 2h皮质区与纹状体区即出现凋亡细胞 ,并逐渐增加 ,皮质区 1d达高峰 ,纹状体区 2d达高峰 ,之后逐渐减少 ,至 14d接近假手术组水平 ;经肌苷治疗后 ,皮质区和纹状体区凋亡神经细胞减少 ,其中再灌注 12h～ 7d较对照组有显著差异 (t=2 .5 2 5～ 8.987,P <0 .0 5 )。脑缺血再灌注后皮质区和纹状体区卡配因mRNA的表达于 2h逐渐增加 ,皮质区 12h、纹状体区1d达高峰 ,3d后逐渐降低 ,至 14d仍明显高于假手术组 ;肌苷治疗组再灌注 12h～ 14d ,其在皮质区和纹状体区表达较对照组显著降低 (t=4 .4 4 3～ 8.876 ,P <0 .0 5 )。④结论　脑缺血再灌注后肌苷使卡配因mRNA表达降低 ,神经细胞凋亡减少 ,提示肌苷具有抑制细胞凋亡和     

肌苷对脑缺血再灌注后COX-2表达的调节作用

目的 研究肌苷对大鼠脑缺血再灌注后COX-2mRNA及其蛋白表达影响,探讨其神经保护作用机制。方法 应用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注动物模型,肌苷组缺血再灌注前腹腔注射肌苷（100mg/kg）,假手术组和对照组同步注射相同剂量生理盐水。原位杂交法和免疫组织化学法检测大鼠脑缺血再灌注后COX-2 mRNA及蛋白的表达。结果 对照组皮质和纹状体区COX-2 mRNA表达于脑缺血再灌注6h开始增强,12h达高峰,持续1～3d,然后逐渐降低,至14d仍高于再灌注2h水平,同一时间点皮质区高于纹状体区。肌苷组COX-2 mRNA表达于脑缺血再灌注2h～14d较对照组显著减低（t=5．50～11．66,P〈0．01）。对照组皮质和纹状体区COX-2蛋白表达的变化趋势与COX-2 mRNA相似,但其高峰出现在24h,较COX-2 mRNA略延迟,且持续时间短,至7d已降至再灌注2h水平,同一时间点皮质区高于纹状体区。肌苷组COX-2表达于脑缺血再灌注2h～14d较对照组显著减低（t=3．27～18．14,P〈0．01）。结论 肌苷对脑缺血的保护作用可能是通过下调COX-2 mRNA及蛋白表达而实现的。     

肌苷对大鼠脑缺血再灌注后勿动蛋白基因表达的影响

①目的　探讨脑缺血再灌注后勿动蛋白 (Nogo A)基因表达的变化规律及肌苷对其表达的影响。②方法　成年健康雌性SD大鼠 6 0只 ,以线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型。随机分为治疗组和对照组 ,每组再随机分为缺血 1.5h再灌注 2h、12h、1d、2d、3d、7d、14d组 (n =4 ) ,另外 4只作假手术组。应用Bederson等神经功能评分法评定脑缺血再灌注后各组大鼠神经功能的恢复情况 ,原位杂交技术检测脑组织Nogo AmRNA的表达。③结果　对照组在缺血侧皮质和纹状体区Nogo AmRNA表达于 12h和 2d呈双峰增高 ,神经功能于 3d开始恢复。肌苷治疗组与对照组比较 ,Nogo AmRNA在皮质区的表达于 12h增高 ,7d下降 ,在纹状体区 12h、2d、3d增高 (t=1.93～ 14 .96 ,P <0 .0 5 ) ;神经功能于 7d恢复 ,差异有显著性 (t =2 .31,P <0 .0 5 )。④结论　肌苷可促进大鼠脑缺血再灌注后神经功能恢复 ,其作用机制可能与Nogo AmRNA表达下调有关。     

肌苷对脑缺血再灌注损伤神经细胞巢蛋白表达的影响

①目的　研究大鼠缺血性脑损伤后神经细胞巢蛋白 (Nestin)变化的规律 ,探讨肌苷治疗中枢神经缺血性损伤的作用机制。②方法　成年健康雌性SD大鼠 6 8只 ,以线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型。随机分为治疗组 (腹腔注射 5 0 g/L肌苷 10 0mg/kg)和对照组 (腹腔注射生理盐水 10 0mg/kg) ,每组再随机分为缺血1.5h再灌注 2h、6h、12h、2 4h、2d、3d、7d、14d组 (n =4 ) ,另取 4只作假手术组。应用原位杂交技术检测脑缺血再灌注后脑组织Nestin的表达。③结果　假手术组皮质、纹状体和室旁区Nestin表达很弱。对照组缺血侧皮质除 2h以外、纹状体除 2、6h以外、室旁区除 2h、6h、14d以外各时间点Nestin的表达均明显高于假手术组 (t =1.95～4 7.2 1,P <0 .0 5 )。治疗组Nestin表达较对照组在皮质于 2h、6h、7d、14d、在纹状体于 14d有所降低 ,在皮质、纹状体及室旁区于 3d均显著升高 ,在纹状体、室旁区于 7d显著升高 (t=4 .37～ 18.0 3,P <0 .0 5 )。④结论　肌苷可以促进大鼠脑缺血再灌注后Nestin的表达 ,可能具有促进神经干细胞生成的作用。     

肌苷对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和HSP-70基因表达的影响

①目的　了解肌苷 (Inosine)对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和热休克蛋白 70 (HSP 70 )基因表达的影响 ,探讨Inosine的神经保护作用机制。②方法　应用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉阻塞 (MCAO)再灌注模型 ,腹腔注射Inosine注射液 (1 0 0mg/kg) ,应用原位末端标记 (TUNEL)和原位杂交技术分别观察大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和HSP 70mRNA表达。③结果　脑缺血再灌注后 2h皮质区与纹状体区即出现凋亡细胞 ,并逐渐增加 ,皮质区 1d达高峰 ,纹状体区 2d达高峰 ,之后逐渐减少 ,至 1 4d接近于假手术组水平 ;经Inosine治疗后 ,皮质和纹状体区凋亡神经细胞减少 ,其中再灌注 1 2h～ 7d与对照组比较差异有显著性 (F =3.2 38～1 1 .1 6 3,q =2 .4 5 1～ 7.2 0 0 ,P <0 .0 5 )。脑缺血再灌注后皮质区和纹状体区HSP 70mRNA的表达于 2h逐渐增加 ,皮质区 1 2h、纹状体区 1d达高峰 ,3d后逐渐降低 ,至 1 4d仍明显高于假手术组 ;Inosine治疗组再灌注 1 2h～ 1 4d ,皮质区和纹状体区HSP 70mRNA表达较对照组显著升高 (F =4 .5 73～ 1 0 .2 4 1 ,q =3.1 4 4～ 6 .992 ,P <0 .0 5 )。④结论　Inosine具有抑制细胞凋亡和神经保护作用。     

血管内皮生长因子对大鼠脑缺血再灌注模型的神经保护作用

目的 探讨血管内皮生长因子VEGF对大鼠脑缺血再灌注模型的神经保护作用。方法 应用大鼠大脑中动脉缺血再灌注（MCAO）模型，再灌注12h后给予VEGF腹腔注射，检测再灌注不同阶段大鼠神经功能缺损情况，以及梗死区一氧化氮合酶（nNOS）mRNA和超氧化物歧化酶（SOD）蛋白的表达量，与未注射VEGF组比较。结果 注射VEGF组大鼠缺血再灌注24、36和48h神经功能缺损评分明显高于MCAO组；MCAO组大鼠再灌注后nNOS基因表达开始增加，于24h达到高峰开始下降；SOD表达量则在48h内都在升高。注射VEGF组再灌注24、48h的nNOS和SOD的表达量与MCAO比较均明显增高（P〈0．05）。结论 VEGF具有增加再灌注组织一氧化氮合酶和超氧化物歧化酶表达进而促进脑缺血再灌注后神经功能恢复的作用。     

肌苷对大鼠脑缺血再灌注后GAP-43 mRNA表达影响

目的探讨肌苷对脑缺血再灌注后中枢神经再生的作用。方法线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型,随机分为治疗组和对照组,每组再随机分为缺血1.5 h再灌注2 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d1、4 d组(n=4),另取4只作假手术组。应用BEDERSON等神经功能评分法评定神经功能,原位杂交技术检测脑缺血再灌注后各时间点脑组织生长相关蛋白基因(GAP-43 mRNA)的表达。结果对照组于再灌注2 h~7 d、治疗组于再灌注12 h~7 d,GAP-43 mRNA表达与假手术组比较明显增多(t=2.70~29.84,P<0.05),治疗组与对照组比较GAP-43mRNA表达于再灌注2 h一过性下降,12 h和7 d明显增高(t=1.97~7.41,P<0.05);治疗组与对照组比较神经功能恢复于再灌注7 d有显著性差异(t=2.31,P<0.05)。结论肌苷可促进大鼠脑缺血再灌注后神经功能恢复,其作用机制可能是通过调节与神经轴突再生有关的GAP-43 mRNA表达而实现的。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后VEGF及VEGFmRNA的表达

目的:探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织内血管内皮细胞生长因子(VEGF)及VEGFmRNA的表达及意义.方法:制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,动物分为缺血2h再灌注6h、12h、24h、48h、72h及假手术对照组.应用免疫组化法检测VEGF蛋白的表达;RT-PCR法检测VEGF mRNA的动态变化.结果:大鼠缺血再灌注6h,缺血侧脑组织梗死灶周边VEGF免疫阳性反应已出现,24h明显增多,48h达高峰;VEGF mRNA在6h开始上升,12h达高峰,24h开始下降,48～72h接近正常水平.结论:脑缺血再灌注损伤可以诱导VEGF表达增强,提示VEGF对缺血性脑损伤有保护作用.     

脂肪来源的神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后VEGF表达的影响

[摘要]目的观察人脂肪组织来源的神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后VEGF表达的影响,探讨其治疗局灶性脑缺血的可能机制。方法线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血(MCAO) 2 h再灌注模型。60只健康雄性SD大鼠随机分为4组：正常对照组(6只),假手术组(6只),缺血对照组(24只)和移植治疗组(24只)。后两组又各分4组：缺血2 h再灌注7、14、21、28 d组(各6只)。体外培养脂肪基质细胞,诱导分化为神经干细胞。造模成功后24 h,移植治疗组经尾静脉移植人脂肪组织来源的神经干细胞悬液(细胞密度为2×106/ml),缺血对照组经尾静脉注射生理盐水,假手术组不做任何处理。免疫组化法检测VEGF的表达,原位杂交法检测VEGF mRNA的表达。结果与缺血对照组比较,移植治疗组各时间点(7、14、21、28 d)的VEGF染色阳性细胞数均增加(均P<0.01),VEGF mRNA含量均增加(均P<0.01)。结论脂肪组织来源的神经干细胞移植可促进内源性VEGF及VEGF mRNA的表达,提高大鼠局灶性脑缺血后损伤局部VEGF及VEGF mRNA的含量,对脑缺血再灌注损伤后的神经细胞起保护作用。     

雌二醇预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织HSP70表达的影响

目的：观察雌二醇对脑缺血再灌注损伤脑组织HSP70表达的影响。方法：大鼠分假手术对照组、脑缺血再灌注组和雌二醇治疗组,每组32只,采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,每组分别于再灌注3h、6h、12h、24h处死8只动物,于视交叉前后2mm脑冠状切开,取闭塞侧组织制备连续性切片．免疫组化技术检测脑组织中HSP70的表达。结果：3组脑血管内皮均有HSP70的表达。假手术组皮层和纹状体无HSP70表达：雌二醇治疗组与脑缺血再灌注组再灌注后各时间点皮层、纹状体均有HSP70的表达,且雌二醇治疗组脑缺血再灌注后12h、24h皮层HSP70表达高于脑缺血再灌注组。结论：雌二醇预处理,可以诱导大鼠脑缺血再灌注脑组织HSP70的表达,对缺血性脑损伤可能有一定的保护作用。     

大川芎丸对大鼠缺血脑组织中血管内皮细胞生长因子的影响

目的研究大川芎丸对大鼠缺血脑组织中血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法采用大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型,将20只SD大鼠随机分成治疗组和对照组,每组各10只,分别于术后每天予以大川芎丸提取物4.13g/kg或相应剂量生理盐水灌胃给药,72h后行神经功能评分后处死,取脑组织作免疫组化染色检测VEGF蛋白表达变化。结果大川芎丸治疗组神经功能评分(1.5±0.71)低于对照组(2.3±0.82),差异有统计学意义(P=0.032);大川芎丸治疗组VEGF表达(19.13±1.52)高于对照组(14.83±0.94),差异有统计学意义(P=0.000)。结论中药大川芎丸可上调大鼠缺血脑组织中VEGF表达,并可能通过此机制起到保护作用。     

G-CSF对大鼠脑缺血再灌注模型脑组织内VEGF表达的影响及脑保护作用

目的：研究粒细胞集落刺激因子（G-CSF）在大鼠局灶性脑缺血再灌注模型中对脑组织中血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响及脑保护作用。方法：雄性Wistar大鼠40只,随机分为试验组和对照组,参照Zea Longa报道的方法建立大鼠大脑中动脉线栓模型（MACO）。造模成功24 h后,测定神经功能缺失评分。实验组皮下给予G-CSF 20μg/（kg.d）,对照组给予等量生理盐水,连用5 d。测定动物神经功能缺失再评分,断头取脑,取距额极4~6 mm部分,分成两部分,取其一做TTC染色,测定脑梗死面积比;剩余部分做HE染色,观察光镜下结构;免疫组化测定脑梗死周围损伤区VEGF表达情况。结果采用SPSS10.0统计学软件进行统计学分析。结果：造模成功后共入组大鼠29只,其中实验组17只,对照组12只。①实验组与对照组神经功能缺失评分均主要集中在2分,统计学分析未见明显差异（P〉0.05）。②实验组梗死面积与对侧大脑半球面积比小于对照组,两组存在统计学差异（P〈0.05）。③实验组脑梗死周围损伤区组织VEGF表达水平高于对照组,两组间存在统计学差异（P〈0.05）。结论：粒细胞集落刺激因子能增强脑组织VEGF表达,减小脑梗塞面积,从而发挥脑保护的作用。但未发现对神经功能缺失评分有显著影响。     

环氧酶-2在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的表达及意义

目的探讨局灶性脑缺血再灌注损伤过程中环氧酶(COX)-2基因的表达及其意义。方法采用栓线法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。随机分为8组:假手术组,缺血2h组,缺血再灌注3、6、12、24、48和72h组,每组10只。评定神经功能损伤,HE染色观察脑组织形态学改变。Northern blot、Western blot和免疫组化染色方法检测脑组织的mRNA和蛋白产物表达。结果神经功能缺损表现随缺血再灌注时间的延长而逐渐加重。缺血2h组可见COX-2的mRNA和蛋白产物表达明显增加,再灌注后表达逐渐增强,再灌注12～24hCOX-2的mRNA和蛋白产物表达达到高峰。结论COX-2基因在局灶性脑缺血再灌注损伤中的表达呈动态变化过程,COX-2可能与缺血再灌注后迟发性神经细胞死亡有关。     

远隔后适应对大鼠脑组织中淀粉样前体蛋白表达的影响

目的研究远隔缺血后适应对大鼠脑缺血再灌注损伤后存在于神经元和神经胶质细胞中的淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,β-APP)的影响。方法应用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞缺血模型,缺血即刻和再灌注即刻分别给予肢体缺血后适应。应用双侧股动脉夹闭10 min/放开10 min,反复3次进行肢体缺血后适应。实验分为7组:假手术组,单纯缺血再灌注组(4 h、24 h组),缺血再灌注+缺血即刻远隔缺血后适应组(4、24 h组),缺血再灌注+再灌注即刻远隔缺血后适应组(4 h、24 h组),每组4只大鼠。采用免疫荧光方法观察β-APP蛋白表达的部位;采用免疫印迹方法研究β-APP的蛋白表达水平。结果脑缺血组大鼠缺血脑组织β-APP蛋白表达在缺血后不同时间点与假手术组比较差异无统计学意义。但是,可以看出β-APP在大鼠缺血后4 h无升高,缺血后24 h开始升高。给予远隔缺血后适应组与单纯缺血组比较,24 h时缺血即刻给予远隔后适应组,β-APP蛋白水平显著低于对照组(P<0.05)。结论远隔缺血后适应可能会通过降低脑缺血后β-APP蛋白表达水平,从而减轻脑缺血损伤。     

大鼠脑缺血不同时间再灌注脑损伤的实验研究

目的 通过了解大鼠脑缺血不同时间再灌注神经细胞坏死情况，进一步探讨溶栓时间窗问题。方法 应用SD大鼠建立大鼠大脑中动脉局灶脑缺血模型，分脑缺血再灌注组(缺血1／2、1、2、3、4、5、6h再灌注2，4、48、72h)、脑梗死组、永久缺血组及假手术组，于再灌注后24、48、72h处死大鼠取脑，免疫组织化学方法观察细胞间粘附因子1(ICAM-1)表达、TTC测定脑梗死体积。结果 缺血1／2h，再灌注24h时ICAM-1表达开始增加，随着脑缺血时间的延长，ICAM-1表达呈上升趋势；ICAM-1表达高峰的缺血时间为3h。每个缺血时间点内，ICAM-1表达高峰的再灌注时间是48h。缺血1h再灌注可降低ICAM-1表达，减轻脑梗死面积，但缺血3h后再灌注增加ICAM-1的表达且增加脑梗死面积。结论 ICAM-1参与了脑缺血后的炎症反应，促使缺血后继发脑损伤。一般情况下，血管再通应在缺血3h内进行，否则再灌注损伤带来的副面影响将远远大于恢复血流本身。     

黄芪对大鼠脑缺血再灌注损伤c-fos和Bcl-2表达及细胞凋亡的影响

目的探讨黄芪对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡和凋亡基因c-fos、Bcl-2表达的影响。方法 40只Wistar大鼠,体质量180～220 g,随机分为黄芪组、缺血4 h再灌注1 h组(Ⅰ组)、缺血4 h再灌注12 h组(Ⅱ组)、缺血4 h再灌注24 h组(Ⅲ组)和对照组。线栓法建立脑缺血再灌注损伤大鼠模型。切片分别行HE染色,应用免疫组织化学染色检测神经细胞凋亡基因c-fos、Bcl-2蛋白表达。结果对照组、Ⅰ组脑细胞未见明显变化,Ⅱ组轻度脑细胞水肿,Ⅲ组脑细胞明显水肿,黄芪组损伤区范围变小,肿胀减轻。与对照组比较,其余各组脑细胞c-fos和Bcl-2阳性表达率增高(P<0.01);黄芪组c-fos和Bcl-2阳性表达率较Ⅱ、Ⅲ组降低(P<0.01)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和黄芪组细胞凋亡指数较对照组明显增加(P<0.01);黄芪组较Ⅱ、Ⅲ组明显降低(P<0.01)。结论黄芪在脑缺血再灌注损伤后可抑制c-fos表达、增加Bcl-2表达,减轻脑细胞凋亡。     

肌苷对缺血再灌注脑组织VCAM-1表达的影响

①目的 探讨肌苷对局灶性缺血再灌注后脑组织血管细胞间黏附分子-1（VCAM-1）表达的影响。②方法 将健康成年雌性SD大鼠70只随机分为假手术组、治疗组和对照组，治疗组在缺血再灌注前腹腔注射肌苷注射液，另两组腹腔注射相同体积的生理盐水。后两组分别在脑缺血90min后再灌注2h、6h、12h、1d、2d、3d、7d和14d等不同时间，用免疫组化技术观察VCAM-1的表达。③结果 在皮质区，VCAM-1的表达在缺血再灌注不同时间点呈现不同水平，假手术组和对照组缺血再灌注2h之前有痕量表达，VCAM-1的阳性表达在缺血再灌注6h有较明显增加，1～2d时表达达高峰，之后逐渐下降，到7d时VCAM-1的表达接近假手术组水平；在纹状体区呈现与皮质区相似的表达规律，但其表达与同时间点皮质区比较水平更高。在治疗组VCAM-1的表达规律类似于对照组，在同一时间点较对照组表达显著降低，又明显高于假手术组。④结论 适量输注肌苷可能通过VCAM-1作用机制对缺血再灌注脑组织起一定的保护作用。     

电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑细胞凋亡及神经功能恢复的影响

目的 观察针刺干预对于大鼠局灶性脑缺血再灌注脑细胞内游离钙、Caspase-3 mRNA及大鼠双前肢抓力的影响.方法 145只成年雄性SD大鼠随机分成对照组(sham)、缺血再灌注组(1/R)和针刺组(I/R+EA).选用Longa改良线拴法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO).实验大鼠处死后取材制成单细胞悬液,经Fluo-3/AM标记,用激光扫描共聚焦显微镜检测脑细胞[Ca2+]i浓度.应用RT-PCR技术检测大鼠大脑皮层和纹状体内Caspase-3 mRNA表达的变化.大鼠双前肢抓力试验检测大鼠神经功能重建情况.结果 ①针刺干预6h后[Ca2+]i为10.96±1.18,针刺12h后为20.9±4.73,与缺血再灌注组[16.87±3.56,34.10±1.06]比较显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01).②I/R组大脑皮层及纹状体Caspase-3 mRNA表达增强;电针干预后Caspase-3 mRNA表达与I/R组比较明显下调.③针刺7d、14d大鼠抓力明显高于脑缺血再灌注7d、14d,针刺30d、60d、90d大鼠抓力与脑缺血再灌注30d、60d、90d组大鼠抓力无明显差异.采用单因素方差分析,I/R+EA与sham及I/R组比较(P＜0.05),差异有统计学意义.结论 缺血急性期针刺干预显著降低大鼠局灶性脑缺血再灌注脑细胞内游离钙的浓度及Caspase-3 mRNA的表达;并有效促进大鼠神经功能的恢复.