心脉神口服液对低密度脂蛋白介导的内皮细胞分泌一氧化氮和内皮素-1的影响

目的 探讨中成药心脉神口服液（XMSol)对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL)致血管内皮细胞（VEC）损伤的细胞保护作用。方法 进行人脐静脉内皮细胞（HUVEC）体外培养；用中药血清药理学的方法制备心脉神口服液（XMSol)含药血清；用放射免疫法等技术观察ox-LDL对VEC分泌一氧化氮（NO）及内皮素-1（ET——1）的影响并研究心脉神口服液（XMSol)的保护作用，结果 培养液中加有ox-LDL的VEC分泌的NO显著降低，分泌的ET-1明显升高，于加入ox-LDL之前预先加入XMSol或同时加入XM-Sol时，VEC分泌NO较单用ox-LDL明显升高，ET-1明显较低，结论 心脉神经服液能拮抗ox-LDL致内皮细胞分泌NO下降和ET-1升高。     

卡托普利对氧化型低密度脂蛋白致血管内皮细胞形态和功能改变的影响

目的：探讨氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）致血管内皮细胞形态和功能的改变及卡托普利（CPT）的作用。方法：将融合成单层的牛胸主动脉内皮细胞（BAEC）:① 用含ox-LDL的培养液常规培养，加或不加CPT预孵，在倒置显微镜及扫描电镜下比较细胞形态;② 分别用不同浓度CPT预孵及ox-LDL处理，测定不同时点培养液ET-1、6-keto-PGF1α和TXB2的含量。结果：① 光镜下各组细胞形态无明显变化，扫描电镜下可见ox-LDL组细胞有较多脱落、局部缺损，细胞分散，表面微绒毛明显减少；CPT预孵后有所改善，表面微绒毛明显增多。② ox-LDL组ET-1、6-keto-PGF1α和TXB2 含量显著高于对照组。CPT低浓度抑制ET-1分泌，较高浓度则刺激ET-1分泌；CPT使6-keto-PGF1α含量增加，对TXB2的含量无影响。结论：ox-LDL对内皮细胞形态和功能的影响至少部分是通过血管紧张素系统实现。     

氧化修饰低密度脂蛋白对内皮细胞功能的影响

目的 观察氧化修饰低密度脂蛋白（ox-LDL）对内皮细胞NO／ET-1、t-PA／PAI-1合成、细胞表面细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法 采用培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs），在分另0加入不同浓度ox-LDL（50、100、150、200mg／L）孵育24h后，观察培养液中NO、ET-1、t-PA、PAI-1水平及细胞表面ICAM-1的表达。结果 ox-LDL可显著抑制NO、t-PA的合成。ox-LDL还可明显增加ET-1、PAI-1的分泌及诱导细胞表面ICAM-1的表达。结论 ox-LDL对内皮细胞具有明显的细胞毒作用，它对NO／ET-1、t-PA／PAI-．1及ICAM-1表达的影响可能是其致动脉粥样硬化发生的重要机制之一。     

绿原酸对肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO和ET-1的影响

目的:探讨绿原酸对治疗大肠杆菌内毒素性疾病的作用机制.方法:利用体外培养大鼠肠黏膜微血管内皮细胞,研究金银花主要成分绿原酸对正常肠黏膜微血管内皮细胞作用1、3、6、9h后的NO和ET-1分泌量的影响,以及对经大肠杆菌内毒素作用1h后肠黏膜微血管内皮细胞于3、6、9h后的NO和ET-1分泌量的影响.结果:绿原酸有效地抑制了肠黏膜微血管内皮细胞分泌的ET-1和NO的比值升高.结论:绿原酸对内毒素作用下的肠黏膜微血管内皮细胞的功能有保护作用.     

PI3K/Akt/eNOS信号通路在葛根素抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞组织因子表达中的作用

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)信号通路在葛根素(puerarin)抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管内皮细胞组织因子(tissue factor,TF)表达中的作用。方法:实时荧光定量PCR检测TF的mRNA表达,Western blot检测TF和Akt的蛋白表达,硝酸盐还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。结果:与对照组相比,ox-LDL孵育内皮细胞后,内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高,Akt蛋白磷酸化水平降低,细胞内NO产生减少;而葛根素预孵育内皮细胞1 h后,再用ox-LDL孵育,内皮细胞TF mRNA和蛋白表达下降,Akt蛋白磷酸化升高,细胞内NO产生增多;PI3K抑制剂LY294002和葛根素共同预孵育内皮细胞1 h后,再用ox-LDL孵育,内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高,Akt蛋白磷酸化降低,细胞内NO产生减少;eNOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和葛根素共同预孵育内皮细胞,也明显阻断葛根素对ox-LDL诱导的内皮细胞TF mRNA和蛋白表达、细胞Akt蛋白磷酸化和细胞内NO产生的作用。结论:葛根素可通过上调PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞TF mRNA和蛋白表达。     

绿原酸对肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO和ET-1的影晦

目的：探讨绿原酸对治疗大肠杆菌内毒素性疾病的作用机制。方法：利用体外培养大鼠肠黏膜微血管内皮细胞，研究金银花主要成分绿原酸对正常肠黏膜微血管内皮细胞作用1、3、6、9h后的NO和ET-1分泌量的影响，以及对经大肠杆菌内毒素作用1h后肠黏膜微血管内皮细胞于3、6、9h后的NO和ET-1分泌量的影响。结果：绿原酸有效地抑制了肠黏膜微血管内皮细胞分泌的ET-1和NO的比值升高。结论：绿原酸对内毒素作用下的肠黏膜微血管内皮细胞的功能有保护作用。     

补肾宁心方对人单核-血管内皮细胞粘附的影响

目的:探讨补肾宁心方对人单核-血管内皮细胞粘附的影响及机理。方法:以培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为靶细胞,在内皮细胞培养基中加入氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)或在试验体系中加入灌服补肾宁心方的兔血清,以孟加拉玫瑰红活细胞染色法测定人单核细胞系U937与HUVECs的粘附,并用流式细胞仪检测内皮细胞表面粘附分子细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)以及E-选择素的表达。结果:ox-LDL显著增强单核U937细胞与内皮细胞之间的相互粘附,如在试验体系中加入灌服补肾宁心方的动物血清,则粘附率明显降低(P＜0.01)。流式细胞仪分析结果显示ox-LDL能明显促进内皮细胞表面ICAM-1、VCAM-1以及E-选择素的表达,补肾宁心方中药灌服血清可显著下调内皮细胞表面ICAM-1、VCAM-1以及E-选择素的表达(P＜0.01)。结论:补肾宁心方含药血清可能通过下调内皮细胞表面粘附分子的表达抑制单核-血管内皮细胞粘附,从而发挥对血管内皮细胞的保护作用。     

氧化低密度脂蛋白对人血管内皮细胞ECV-304促增殖及诱导凋亡的作用

目的:探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对血管内皮细胞损伤作用的多样性。方法: 通过细胞形态学、台盼蓝活细胞计数、细胞毒四唑盐(MTT)比色试验、乳酸脱氢酶(LDH)、流式细胞凋亡和细胞凋亡小分子量DNA片段凝胶电泳测定法, 观察(0.1、1、10、100、150和200)mg/L的ox-LDL的条件培养液对人血管脐静脉内皮细胞ECV-304的影响。结果:(0.1-10)mg/L的ox-LDL对ECV-304细胞具有促增殖作用, 而增加浓度达100mg/L及以上时, 其表现则主要是对ECV-304的细胞毒性;而且, 这种细胞毒性以当ox-LDL的浓度达到150和200mg/L时, 在12h开始诱导ECV-304细胞出现凋亡, 分别达15.86%和21.89%。而当ox-LDL作用ECV-304细胞18h后, 则出现伴随凋亡的细胞坏死。结论:ox-LDL具有很强的细胞毒性, 其对内皮细胞的细胞毒性经历了促细胞增殖、凋亡前期、细胞凋亡和凋亡后的坏死等过程。     

脉动流场中离体血管段长度与内皮细胞内皮素代谢相关——内皮细胞膜张应力累加效应实验研究III

用离体血管灌流实验验证冯元桢等关于血管内皮细胞的膜张应力逆血流方向累加的理论分析。长度分别为 11、2 1cm的离体血管段内皮细胞分别置于平均切应力均为 0 .12 N / m2 的脉动流环境中剪切 42 h。11cm处理的内皮素 - 1( ET- 1)平均分泌速率 ( 16.93± 0 .89pg/ cm2 · h)显著低于 2 1cm处理 ( 2 6.13± 1.79pg/ cm2 · h) ,差异比率为 1∶ 1.5。脉动流作用引起的 ET- 1平均分泌率显著高于定常流的作用。总体上表明在脉动流条件下 ,血管段长度与其血管内皮细胞 ET- 1代谢 (分泌量 )间有密切的相关关系。本实验结果从又一个侧面证实血管内皮细胞膜张应力存在累加效应     

脉动流场中离体血管段长度与内皮细胞内皮素代谢相关--内皮细胞膜张应力累加效应实验研究 Ⅲ

用离体血管灌流实验验证冯元桢等关于血管内皮细胞的膜张应力逆血流方向累加的理论分析.长度分别为11、21 cm的离体血管段内皮细胞分别置于平均切应力均为0.12 N/m2的脉动流环境中剪切42 h.11 cm处理的内皮素-1(ET-1)平均分泌速率(16.93±0.89 pg/cm2*h)显著低于21 cm处理(26.13±1.79 pg/cm2*h), 差异比率为1∶1.5.脉动流作用引起的ET-1平均分泌率显著高于定常流的作用. 总体上表明在脉动流条件下,血管段长度与其血管内皮细胞ET-1代谢(分泌量)间有密切的相关关系.本实验结果从又一个侧面证实血管内皮细胞膜张应力存在累加效应.     

克拉霉素抑制肺癌细胞诱导血管内皮细胞迁移的实验研究

目的 观察克拉霉素（CAM）对人小细胞癌细胞表达VEGF其诱导血管内皮细胞迁移的影响，探讨CAM抗血管生成的机制。方法 采用免疫组化和图象分析技术，观察不同浓度的CAM作用下人小细胞肺癌细胞（NCI－H446）中VEGF蛋白表达的变化。采用共培养法（Marigel invasion chamber)，观察CAM为NCI－H446细胞诱导人血管内皮细胞（ECV－304）迁移的抑制作用。结果 CAM达到30mmol/L对其诱导的ECV－304细胞迁移表现出明显的抑制作用，达到40mmol/L可以抑制CI－H446细胞表达VEGH，CAM浓芳在30，40和50mmol/L时，抑制率分别为19．7％，24．3％和25．0％，呈现出明显剂量－反应关系（r=-0.764,P=0.001)。结论 CAM能够抑制肺癌细胞诱导的血管内皮细胞迁移，对其表达VEGF也具有抑制作用，以上作用可能是CAM抗血管生成的机制之一。     

过氧化物歧化酶和氨基胍对TNF-α诱导的血管内皮细胞凋亡的影响

目的 研究抗氧化剂过氧化物歧化酶(SOD)、诱导型一氧化氮合酶抑制剂氨基胍(AG)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(ECV-304)凋亡影响及可能的机制。方法 将体外培养的ECV-304的细胞分四组:①空白对照组;②TNF-α组:ECV-304加TNF-α(750、1250、2500、5000、10000 U/ml);③SOD组:ECV-304加TNF-α(2500 U/ml)加SOD(200、400、800 U/ml);④AC组:ECV-304+TNF-α(2500 U/ml)+AC(2、4、8 mmol/L)。采用四唑蓝比色法检测细胞活性;活细胞荧光染色观测细胞凋亡及形态学变化、流式细胞术分析细胞凋亡率;荧光分光光度法测定一氧化氮(NO)。结果 随着TNF-α浓度的增加,ECV-304活性有明显的降低(与对照比P<0.01);SOD或AG均可抑制TNF-α引起的ECV-304活性下降,随着浓度的增加,ECV-304活性有明显的递增趋势,与TNF-α组比较差异有显著性(P<0.01,P<0.05),同时减少NO生成(与TNF-α组比,P<0.05,P<0.002);应用TNF-α(5000 U/ml)的ECV-304凋亡率为27.4％,应用SOD、AG后,两组ECV-304凋亡率分别为17.0％、12.9％。结论 SOD和AG均有抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡的作用,其抑制作用与减少NO生成有关。     

α-硫辛酸对氧化低密度脂蛋白致内皮细胞损伤的保护作用

目的:探讨α-硫辛酸(LA)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致内皮细胞损伤的保护作用。方法:内皮细胞ECV304随机分为:空白对照组(ECV304)、LA对照组(ECV304+LA)、ox-LDL组(ECV304+ox-LDL)、LA处理组(ECV304+ox-LDL+LA),以0.1g/L浓度的ox-LDL刺激细胞,并加入0.5g/L的LA,孵育24h后,收集培养液,测定乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量。结果:LA处理组较ox-LDL组LDH和MDA含量明显降低,两者差异有显著性(P<0.05)。结论:LA对ox-LDL导致的内皮细胞损伤有保护作用。     

PTEN 在动脉粥样硬化中的表达及对血管内皮细胞增殖凋亡的影响研究

目的:探讨第10号染色体同源缺失性磷酸酶鄄张力蛋白(PTEN)在动脉粥样硬化中的表达及对血管内皮细胞(VEC)增殖凋亡的影响。方法:构建动脉粥样硬化小鼠模型,Real-time PCR和Western blot检测动脉粥样硬化组织中PTEN水平;用不同浓度的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理大鼠VEC,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性。VEC转染PTEN过表达载体(pSicoR-PTEN),用ox-LDL 处理细胞,Real-time PCR和Western blot检测PTEN水平,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot 检测磷酸化的STAT3(p-STAT3)、信号转导与转录因子3(STAT3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)水平。结果:动脉粥样硬化组织中的PTEN水平明显低于正常的动脉组织(P<0.05)。不同浓度的ox-LDL处理后的VEC存活率明显降低,并且细胞存活率随着ox-LDL浓度的升高而降低。Ox-LDL作用后的VEC中PTEN表达水平下降,而转染pSicoR-PTEN后可以提高VEC中PTEN表达水平。Ox-LDL处理后的VEC凋亡率增加,细胞中Cleaved Caspase-3水平升高,p-STAT3 水平下降,与正常培养的VEC相比差异具有统计学意义(P<0.05)。转染pSicoR-PTEN后VEC 经过ox-LDL处理后细胞存活率、p-STAT3 水平明显升高,而细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3水平明显降低,与单纯ox-LDL处理后的细胞相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:PTEN 在动脉粥样硬化组织中表达下调,PTEN 可以逆转ox-LDL对VEC增殖抑制和凋亡促进作用,作用机制可能与STAT3 信号通路的激活有关。     

高血压病和2型糖尿病患者血清损伤ECV-304细胞的比较研究

目的:以高血压病和2型糖尿病为例进行血瘀证血管内皮细胞损伤模型的比较研究,为中医学"异病同证"理论提供实验依据。方法:取对数生长期ECV-304细胞,分组如下:空白对照组(无血清的DMEM组)、糖尿病血瘀证组(糖尿病血瘀证患者血清)和高血压病血瘀证组(高血压病血瘀证患者血清)。采用噻唑蓝比色法(MTT法)观察细胞活性;在倒置相差显微镜、扫描电镜和透射电镜下观察细胞形态的变化;应用放免法测定内皮素(ET)含量;硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量;利用双抗夹心酶联免疫法(ELISA)检测各组细胞培养上清液中内皮细胞蛋白C受体(EPCR)、血管内假性血友病因子(vWF)和血栓调节蛋白(sTM)的含量;应用激光扫描共聚焦显微镜,采用Fluo-3/AM作为荧光指示剂观察细胞内游离钙([Ca2+]i)浓度的变化;并采用荧光探针标记的鬼笔环肽染色法观察细胞肌动蛋白微丝分布的差异。结果:(1)MTT结果显示,10%血清作用下,高血压病血瘀证组的细胞活力低于对照组(P0.05),糖尿病血瘀证组的细胞活力也低于对照组(P0.05),但高血压病血瘀证组的细胞活力与糖尿病血瘀证组差异无显著(P0.05);(2)高血压病血瘀证组的ET水平高于对照组(P0.05),糖尿病血瘀证组也高于对照组(P0.05),且高血压病血瘀证组的ET水平低于糖尿病血瘀证组(P0.05);高血压病血瘀证组的NO水平低于对照组(P0.05),糖尿病血瘀证组也低于对照组(P0.05),且高血压病血瘀证组的NO水平高于糖尿病血瘀证组(P0.05);(3)高血压病血瘀证组的EPCR、vWF和sTM含量高于对照组(P0.05),糖尿病血瘀证组也高于对照组(P0.05),且高血压病血瘀证组的EPCR水平低于糖尿病血瘀证组(P0.05);而高血压病血瘀证组的vWF和sTM含量与糖尿病血瘀证组之间差异无显著(P0.05);(4)高血压病血瘀证组[Ca2+]i高于对照组(P0.05),糖尿病血瘀证组[Ca2+]i高于对照组(P0.05),高血压病血瘀证组胞浆内荧光分布不均匀,[Ca2+]i高于糖尿病血瘀证组(P0.05);(5)高血压病血瘀证组可见细胞骨架微丝减少但排列较为规则,糖尿病血瘀证组的微丝断裂且排列紊乱,二者微丝分布差异显著。结论:高血压病患者血清和糖尿病患者血清对ECV-304细胞骨架、[Ca2+]i及ET、NO和EPCR表达的影响不同,但均能造成ECV-304细胞损伤,这可能是中医学"异病同证"的病理学基础。     

基质金属蛋白酶-9靶向RNA干扰重组载体的构建和效应检测

目的:构建针对人基质金属蛋白酶-9(MMP-9)小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对川崎病(KD)血清诱导的血管内皮细胞MMP-9高表达的干扰效果。方法:依据siRNA设计原则设计两对MMP-9基因的特异性干扰序列,体外分别合成两端含BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火后与pSilencer3.1-HI neo线性质粒连接,转化DH5α感受态菌株,筛选阳性克隆,提取质粒进行双酶切及琼脂糖电泳鉴定。阳性重组质粒测序。将构建的两个MMP-9 siRNA质粒以KD血清作为诱导因子,用脂质法转染内皮细胞ECV-304,应用RT-PCR法测定各实验组血管内皮细胞MMP-9mRNA表达、Western blot检测各组MMP-9蛋白表达情况,对所构建的MMP-9 siRNA质粒进行效应检测。结果:DNA测序证实合成的并被克隆入pSilencer3.1-HI neo表达质粒siRNA插入序列与设计完全符合。KD血清组MMP-9蛋白及mRNA表达水平均较正常血清组明显升高(P<0.05);而所构建的两个MMP-9 siRNA及人血丙种球蛋白均能显著抑制KD血清的上述诱导作用(P<0.05)。结论:成功构建的两个MMP-9 siRNA比人血丙种球蛋白更能高效、特异地抑制MMP-9的表达,为进一步研究MMP-9基因对KD冠状动脉病变的影响及其临床应用奠定了基础。