胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定

目的 探讨胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定的方法,为胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化的研究提供实验基础. 方法 Sprague-Dawley大鼠孕18 d时剖宫取出胎鼠,手术显微镜下取胎鼠四肢骨骼肌肌肉,采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离胎鼠骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法进行纯化.原代培养的生长培养基为(DMEM/F12+ 20％ FBS+ 10％ HS+5 ng/ml bFGF).分化培养基为(DMEM/F12+ 2％ HS).CCK-8法绘制胎鼠骨骼肌卫星细胞生长曲线图,细胞免疫组化染色鉴定纯化后细胞的肌源性标志蛋白Desmin,观察分化培养基条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性. 结果 胎鼠原代骨骼肌卫星细胞在培养的第3天进入对数生长期,5～6d达增殖平台期;纯化后的细胞90％以上表达结蛋白(Desmin).在分化培养基的诱导下细胞之间相互融合形成具有自发节律性收缩特性的多核肌管. 结论 采用消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞,能够获得高活性和高纯度的具有成肌分化能力的骨骼肌卫星细胞.     

十一酸睾酮对肛提肌骨骼肌卫星细胞雄激素受体的影响

目的 通过体外雄激素对骨骼肌卫星细胞影响的研究,为女性盆底功能障碍性疾病治疗提供新的思路.方法 通过不同浓度雄激素对原代培养的骨骼肌卫星细胞的作用,测定细胞的数量和细胞所表达雄激素受体的含量.结果 女性生理范围内,随着雄激素浓度的升高,细胞数量增多、增值加快、雄激素受体表达水平呈逐渐升高趋势.结论 女性正常生理范围内,雄激素促进骨骼肌卫星细胞增殖和雄激素受体的达,为雄激素治疗盆底功能障碍性疾病的研究奠定了基础.     

机械生长因子对骨骼肌卫星细胞增殖及MGFmRNA表达的影响

目的 骨骼肌卫星细胞是肌源性干细胞,该细胞的增殖受一系列生长因子的影响.而机械生长因子( mechano growth factor,MGF)是近年来发现的一种对力学信号敏感的自分泌局部生长因子,可以激活肌卫星细胞的增殖.本研究采用不同浓度的MGF干预体外培养的骨骼肌卫星细胞,探讨促进卫星细胞增殖的适宜浓度.方法 用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞同步化后,分别应用不同浓度的MGF(0 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml和150 ng/ml)干预原代培养的骨骼肌卫星细胞96小时,采用RT-PCR技术检测肌卫星细胞MGF mRNA的表达,用CCK-8检测卫星细胞的增殖情况,并检测细胞总蛋白含量.结果 与0 ng/ml MGF组相比,25 ng/ml和50 ng/ml组OD值在各时间点均显著性增加,其中25 ng/ml组在24 h至96 h内OD值具有高度显著性(P＜0.01),50 ng/ml组在24 h至72 h内也有高度显著性的增加(P＜0.01);25 ng/ml和50 ng/ml组MGF mRNA的表达量均显著高于对照组(P＜0.05),其它组的表达与对照组无显著性差异.总蛋白含量也显示,与0 ng/ml MGF组相比,25 ng/ml和50 ng/ml组均有显著性升高(P＜0.05).结论 适宜浓度的MGF具有促进肌卫星细胞增殖的作用,其中浓度为25 ng/ml和50 ng/ml时具有较强的促增殖作用,但有一定的时间差异.     

亮氨酸对原代新生大鼠骨骼肌卫星细胞肌管形成和MyHC表达的作用研究

目的 探讨新生个体骨骼肌生长重要营养因子亮氨酸对新生大鼠骨骼肌卫星细胞肌管形成和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)表达影响的机制。方法 分离纯化原代新生大鼠骨骼肌卫星细胞,在细胞的分化阶段用不同浓度亮氨酸和雷帕霉素(0 mM亮氨酸,0.1 mM亮氨酸,0.5 mM亮氨酸,2.0 mM亮氨酸,2.0 mM亮氨酸+50 nM雷帕霉素)处理细胞,观察肌管形成情况并检测MyHC、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p-mTOR和Myod的表达。结果 亮氨酸促进肌管的形成,随着原代新生大鼠骨骼肌卫星细胞分化MyHC表达逐渐增加(P<0.05、<0.01或<0.001)。亮氨酸浓度为0.5 mM和2.0 mM时原代新生大鼠骨骼肌卫星细胞p-mTOR表达水平高于亮氨酸浓度为0 mM组(P<0.05或<0.01),添加雷帕霉素后,p-mTOR表达水平下降(P<0.05)。亮氨酸浓度为0.5 mM和2.0 mM时原代新生大鼠骨骼肌卫星细胞Myod的表达水平高于亮氨酸浓度为0 mM组(P值均<0.05),雷帕霉素则抑制Myod的表达(P<0.05)。亮氨酸浓度为0.5 mM和2.0 mM时原代新生大鼠骨骼肌卫星细胞MyHC的表达水平高于亮氨酸浓度为0 mM组(P<0.05或<0.01),雷帕霉素则抑制MyHC的表达(P<0.05)。结论 亮氨酸通过mTORC1/Myod信号通路上调新生大鼠骨骼肌卫星细胞MyHC表达,促进肌管的形成。     

干细胞移植治疗心肌梗死后心力衰竭

细胞移植防治慢性心力衰竭至今已开展十余年了,尽管最初医学界对于这种治疗方法存在疑义,但是此后进行的许多大规模动物实验和临床研究结果显示,细胞注入可以产生新生心肌组织并能改善心脏功能。目前正在进行的临床研究非常多,而我国尚缺乏相关的指导规范,适时地总结以往研究进展,为今后干细胞移植治疗心力衰竭研究提供参考显得尤为重要。现仅对心肌梗死后心力衰竭细胞移植治疗做以综述。一、成体细胞的早期基础研究最初选择骨骼肌卫星细胞来源的骨骼肌成肌细胞治疗心力衰竭,主要因为其来源广泛,可以从自体或者同基因型异体获得,而且与其他…     

c-fos基因在乐果中毒后肌无力大鼠肌组织中的表达

采用ＲＴ－ＰＣＲ、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ技术,检测了有机磷农药乐果对大鼠骨骼肌细胞中即刻早期反应基因ｃ－ｆｏｓ表达的影响。结果表明,在乐果作用下,骨骼肌细胞ｃ－ｆｏｓ基因表达在ｍＲＮＡ以及蛋白质水平均明显增高。然而骨骼肌细胞ｃ－ｆｏｓ的表达是否与毒物刺激有关,其在农药中毒机制上的生物学意义有待深入研究。     

亮氨酸对原代培养大鼠骨骼肌细胞葡萄糖摄取及蛋白激酶B表达的影响

目的以原代培养的大鼠骨骼肌细胞为研究对象,观察亮氨酸对骨骼肌细胞及渥曼青霉素(wortmannin)处理后葡萄糖摄取能力及胰岛素信号通路关键分子蛋白激酶B(AKT)表达的影响,从而为探讨亮氨酸与胰岛素抵抗的关系和相关机制提供依据。方法组织块法培养大鼠原代骨骼肌细胞,不同浓度的亮氨酸(0,0.4,2.0,4.0,8.0mmol/L)作用80min或45min,酶法测定基础状态下和胰岛素刺激下葡萄糖摄取能力,确定亮氨酸作用的最佳浓度和作用时间;在此基础上,应用PI-3K抑制剂wortmannin作用30min,测定葡萄糖摄取能力,Western blot检测AKT及磷酸化AKT表达水平。结果胰岛素刺激状态下,2mmol/L亮氨酸作用45min骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力达最大;2mmol/L亮氨酸干预可改善wortmannin对胰岛素刺激下骨骼肌细胞葡萄糖摄取的抑制作用,显著增强胰岛素信号传导关键分子pSer473 AKT的表达。结论亮氨酸可改善骨骼肌细胞胰岛素抵抗。这种作用不完全依赖于PI-3K胰岛素信号传导通路,并且可能与其增强AKT磷酸化水平有关。     

复合营养素对寒冷暴露大鼠骨骼肌功能的保护作用

目的观察复合营养素对寒冷暴露大鼠骨骼肌功能的保护作用。方法雄性SD大鼠32只,按体重随机平均分为饮用水灌胃室温对照组(n=8)、复合营养素灌胃室温对照组(n=8)、饮用水灌胃寒冷暴露组(n=8)和复合营养素灌胃寒冷暴露组(n=8)。灌胃3周后进行急性寒冷暴露,暴露温度-15℃,时间6h。观察每组大鼠骨骼肌细胞ATP含量变化及细胞超微结构的改变。结果①寒冷暴露使大鼠骨骼肌细胞ATP含量下降(1.353±0.873μmol/L),明显低于室温对照组(6.594±0.421μmol/L)(P0.01),电镜结果显示:细胞线粒体肿胀、易位,肌浆网肿胀,Z线紊乱。②复合营养素可以明显增加寒冷暴露大鼠骨骼肌细胞ATP含量(5.887±0.385μmol/L),与室温对照组(6.594±0.421μmol/L)相比差异无统计学意义(P0.05),电镜结果显示:骨骼肌细胞超微结构正常,线粒体形态完整、排列整齐。结论复合营养素对寒冷暴露大鼠骨骼肌功能有很好的保护作用。     

骨骼肌条件培养液对胸部恶性肿瘤抑制作用的实验研究

目的研究骨骼肌微环境因素对胸部恶性肿瘤细胞增殖的影响,评价其在骨骼肌转移瘤罕见性中的意义及其临床应用前景。方法原代培养新生W istar大鼠骨骼肌细胞,用MTT法分析、比较其条件性上清液(MMCM)对胸部恶性肿瘤细胞(A549,肺泡细胞癌细胞株;An ip-973,肺腺癌细胞株腹水型亚系;PLA-801C,肺巨细胞癌细胞株;NC I-H466,肺小细胞癌细胞株;Eca109,人食管鳞癌细胞株)及正常非肿瘤细胞(金黄地鼠肾细胞株BHK-21)的体外抑瘤作用。结果MMCM分别与A549、An ip-973、PLA-801C、NC I-H466、Eca109及BHK-21共同培养后,五株恶性肿瘤细胞的增殖均显著受抑,而正常非肿瘤细胞株则不受影响。结论新生大鼠骨骼肌细胞可产生选择性抑制胸部恶性肿瘤细胞增殖的抑瘤物质,这种抑瘤物质可能是临床上骨骼肌内罕见转移瘤现象的生物学基础,并可望因此而诞生一种新的防治肿瘤转移的方法,并最终应用于临床。     

皮肌炎知识十二问(二)

正问题5皮肌炎需要做哪些检查?1.体格检查。2.肌肉磁共振成像:可探知肌肉的受累范围.用以诊断分类和治疗管理。它也可引导最合适的活检部位。3.肌电图检查:以针电极插入到骨骼肌,在细胞外记录、放大,并通过示波器显示肌纤维的电活动,用于帮助诊断和鉴别诊断。4.病理活检:帮助诊断和鉴别诊断。5.血清酶测定:高水平的血清肌酶是肌肉受累的标志性参数。在疾病急性期,肌肉损伤释放到血清中的