外源基因经静脉途径跨血脑屏障在大鼠脑内的特异性表达

目的 构建脑特异性启动子GFAP启动的由转铁蛋白受体抗体(OX26)靶向的免疫脂质体0X26-pGFAP-IL,研究其携带外源基因LaeZ在大鼠脑内的表达情况.方法 将pCMV-LacZ脂质体(pCMV-Liposome)、OX26-pCMV-LacZ免疫脂质体(0X26-pCMV-IL)、0X26-pGFAP-LacZ免疫脂质体(OX26-pGFAP-IL)和空白脂质体,分别通过股静脉注射至大鼠体内.24 h后Q-PCR检测LacZ基因mRNA在脑及周围器官的表达相对量,48 h后检测LacZ基因在脑及周围器官的蛋白表达情况.结果 药物注射24 h后OX26-pCMV-IL组和OX26-pGFAP-IL组脑中LacZ基因mRNA表达相对量分别为49.2 x 10~(-6)和44.9×10~(-6),显著高于pCMV-Liposome组和空白脂质体组(P<0.05).OX26-pCMV-IL组在周围脏器的LacZ基因mRNA相对量显著高于OX26-pGFAP-IL组(P<0.05).48 h后OX26-pCMV-IL组和OX26-pGFAP-IL组脑中β-半乳糖苷酶活性分别为0.67 pg/mg和0.92 pg/mg,显著高于pCMV-Liposome组和空白脂质体组(P<0.05).OX26-pCMV-IL组和OX26-pGFAP-IL组在脑中β-半乳糖苷酶活性差异无统计学意义.组织化学染色OX26-pGFAP-IL组可以实现在脑内的特异性阳性表达,减少在周围脏器的阳性表达.结论 OX26-pGFAP-IL通过静脉途径注射后可以透过血脑屏障,在GFAP启动子的作用下实现外源基因脑内特异性的表达,同时减少在周围脏器的非特异表达,是实现颅内疾病的非病毒载体基因治疗的一种可行的方法.     

腺病毒携带的LacZ基因静脉注射后在大鼠体内的表达

目的 :探讨周围静脉注射的腺病毒载体介导的外源基因在体内不同组织的表达。方法 :将重组LacZ腺病毒经尾静脉注射导入Wistar大鼠体内 ,以X -gal染色法明确腺病毒载体介导的标识基因 (LacZ)在大鼠体内的表达部位和时间。结果 :β- gal表达具有剂量依赖性 ,而且存在器官、组织和细胞三种水平的表达差异。剂量较小时 ,肺、肾、肝、脾优先表达 ,而心肌在 1× 1 0 1 1 pfu/kg剂量组才有少量表达 ,大血管和脑组织始终未见表达。注射后 1～ 2周 ,大鼠的肾、肺、肝、脾、肾上腺高表达 β -半乳糖苷酶 ,3～ 4周表达量减少 ,5周基本消失。 结论 :腺病毒介导的外源基因经静脉途径转移 ,可能是肾、肺、肝的部分疾病基因治疗的有效基因转移途径 ,而对心脑血管疾病不适合。     

将含有报告基因LacZ的重组腺病毒载体从大鼠鼻腔转移至脑的实验研究

目的 探讨将携带有报告基因的腺病毒载体由鼻腔转移至脑途径的可行性.方法 将携带半乳糖苷酶报告基因(LacZ)的5型重组腺病毒载体(Ad5 CMV LacZ)注入SD大鼠鼻腔黏膜,分别在注射3 d、7 d、14 d、21 d及28 d切取大鼠鼻腔黏膜以及与嗅觉信息传导途径相关的脑组织,进行冰冻切片和β-半乳糖苷酶(β-gal)免疫组织化学反应显色,判断该载体是否转染和表达蛋白质产物.结果 β-gal免疫组化染色反应显示,该病毒载体从第3天起即可在鼻腔黏膜与嗅球内的细胞转染和表达,在第7天至第21天病毒载体逐渐向颅内深部的室管膜下区、杏仁核及齿状回细胞转移和表达,持续性表达蛋白质产物达28 d之久.结论 经鼻腔黏膜注入腺病毒载体不仅可将外源性基因转移到脑实质内,还可确保外源性基因转染和表达成功.     

嗜酸乳杆菌推定的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的功能性表达

目的在大肠杆菌中诱导表达以嗜酸乳杆菌克隆β-半乳糖苷酶基因lacZ,为研究其酶学特性做准备。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因,并构建表达载体pET22b—lacZ-H、pQE31-H-lacZ和pQE31-lacZ,然后在大肠杆菌中诱导表达,并测定表达产物的β-半乳糖苷酶活性。结果无标签的重组嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶LacZ获得了功能性表达,表达量可达2．28kU／L．而融合His-Tag的重组嗜酸乳杆菌LacZ却失去了β-半乳糖苷酶活性,即使复性也不能恢复。结论克隆表达的成功为该酶的酶学性质研究和可能的应用打下了基础。     

将含有报告基因LacZ的重组腺病毒载体从大鼠鼻腔转移至脑的实验研究

目的探讨将携带有报告基因的腺病毒载体由鼻腔转移至脑途径的可行性。方法将携带半乳糖苷酶报告基因（LacZ）的5型重组腺病毒载体（Ad5 CMV LacZ）注入SD大鼠鼻腔黏膜,分别在注射3d、7d、14d、21d及28d切取大鼠鼻腔黏膜以及与嗅觉信息传导途径相关的脑组织,进行冰冻切片和β-半乳糖苷酶（β-gal）免疫组织化学反应显色,判断该载体是否转染和表达蛋白质产物。结果β-gal免疫组化染色反应显示,该病毒载体从第3天起即可在鼻腔黏膜与嗅球内的细胞转染和表达,在第7天至第21天病毒载体逐渐向颅内深部的室管膜下区、杏仁核及齿状回细胞转移和表达,持续性表达蛋白质产物达28d之久。结论经鼻腔黏膜注入腺病毒载体不仅可将外源性基因转移到脑实质内,还可确保外源性基因转染和表达成功。     

HSV-1载体中介lacZ基因导入大鼠中枢神经系统及其表达的研究

目的 研究用HSV-1载体将外源基因导入大鼠中枢神经系统的方法。方法 将HSV-1载体接种于大鼠嗅神经末梢，在不同时间取各部位脑组织检测lacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶活性，并观察大鼠脑组织局部及全身的病理学和免疫学变化。结果接种HSV-1载体后2d在嗅球中检测到β-半乳糖苷酶活性，接种后4d在嗅球、嗅前神经核、蓝斑、杏仁核、海马、颞叶皮质、间脑以及最后区均检测到β-半乳糖苷酶活性，并持续10周以上；脑组织及全身各脏器未见病理学及免疫学改变。结论HSV-1载体可通过大鼠嗅神经通路将外源基因导入中枢神经系统并在其中表达。     

异常黑胆质成熟剂对D-半乳糖致衰老模型大鼠p16蛋白、β-半乳糖苷酶表达的影响

目的探讨异常黑胆质成熟剂（ASMq）对D-半乳糖致衰老模型大鼠P16蛋白、β-半乳糖苷酶表达的影响,以此阐明异常黑胆质成熟剂延缓衰老作用的部分机制。方法选取3个月龄雄性 SD 大鼠60只,体质量180～220 g,采用 D-半乳糖制作亚急性衰老模型,随机分为衰老模型组及 ASMq高、中、低剂量组各15只（ASMq高、中、低剂量分别为6．0、3．0、1．5 g·kg-1·d-1）,连续给药21 d。另取15只正常雄性大鼠作为正常对照组。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠心、脑、肝组织中 P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达。结果各组大鼠心、脑、肝脏组织中 p16蛋白、β-半乳糖苷酶表达阳性的细胞表现为细胞浆染成黄褐色。与正常对照组比较,衰老模型组心、脑、肝组织中的P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达明显升高,差异有统计学意义（P ＜0．05～0．01）;与衰老模型组比较, ASMq高、中、低剂量组心、脑、肝组织中 P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达明显下降,差异有统计学意义（P ＜0．05～0．01）。结论 ASMq可降低衰老大鼠P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达,从而发挥抗衰老作用。     

何首乌饮对Leydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响

目的:探讨何首乌饮对eydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响.方法:采用3 β-HSD特异性染色鉴定体外培养的大鼠睾丸Leydig细胞,分为正常组、Leydig细胞衰老损伤组、何首乌饮预防组和何首乌饮治疗组,用50 μ mol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4处理Leydig细胞建立Leydig细胞衰老模型.观察各组Leydig细胞β-半乳糖苷酶表达的变化.结果:正常组Leydig细胞无β-半乳糖苷酶表达.与正常组比较,衰老组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达明显升高(P＜0.05);何首乌饮预防组、治疗组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达明显低于衰老组(P＜0.05),何首乌饮治疗组、预防组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:何首乌饮可通过降低β-半乳糖苷酶的表达保护睾丸Leydig细胞衰老损伤.     

脑灵汤对AD模型大鼠行为学及海马内APP mRNA表达的影响

目的：观察脑灵汤对Alzheimer病（AD）模型大鼠行为学及脑内海马部位β-淀粉样前体蛋白（APP）mRNA影响。方法：以D-半乳糖腹部注射合并铝盐皮下注射制作AD大鼠模型，行γ电迷宫实验检测学习记忆能力及RT-PCR法观察大鼠脑内海马APP mRNA的变化。结果：脑灵汤治疗30d后大鼠学习记忆能力较模型组和对照组明显增强（P〈0．05）；大鼠脑内海马部位APP基因mRNA表达的水平亦较模型组和对照组明显降低（P〈0．05）。结论：脑灵汤抑制和下调APP mRNA表达的水平，减少海马结构中β-淀粉样蛋白的沉积，是改善模型大鼠学习记忆的作用机制之一。     

电脉冲介导基因转移效率的实验研究

目的　研究电脉冲介导的基因转移效率及其最佳的基因转移的电脉冲参数。方法　用微量注射器将pcD2/LacZ质粒10μg,在昆明小鼠的股四头肌注射,1～2min内在注射部位给予不同参数的电脉冲刺激(不同的电脉冲参数每组10只小鼠),然后进行β-半乳糖苷酶活性的测定或酶组织化学染色。同时设空白对照组及单纯注射组。结果　电脉冲可明显增加LacZ基因的表达,电脉冲组的β-半乳糖苷酶活性（131.6U/mg±86.5U/mg蛋白）是单纯注射组（4.9U/mg±1.0U/mg蛋白）的30倍（P<0.05）。组织化学染色结果表明电脉冲组肌肉组织中β-半乳糖苷酶蓝色颗粒的数目和染色的程度均明显高于单纯肌肉注射组。当电脉冲参数电压200V/cm,波宽40ms,脉冲次数6次和频率1Hz时,可获得最高的基因表达效率。结论　在最佳的电脉冲参数条件下,电脉冲介导的基因转移可获得较高的基因表达。     

基因诊断与基因治疗

20 0 0年 6月 2 6日 ,参与人类基因组计划的六国 (美、英、日、德、法、中 )政府和有关科学家分别以不同的方法 ,宣布人类基因工程草图绘制成功。此计划始于 1990年 ,我国于 1999年参与该计划。国际社会对于这一重大科学进展给予高度评价。并一致呼吁共享这一人类共同财富。 2 0 0 1年 2月人类基因组图谱“正式版”公布 ,此表示测序任务终结 ,本次公布的主要有 3个内容 :1人类基因数只有 3万多 (3 .5万 ) ,比原先估计 10万个少很多 ;2发现致病基因 ,已找出 3 0个致病基因 ;3绝大多数遗传基因疾病来源为男人。广大的中西医工作者 ,期望对基因…     

含有CD基因的腺病毒载体的构建

目的 :构建携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体。方法 :先将真核表达载体质粒 pCI中的转录框架构建入腺病毒载体中 ,后再将CD和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点内。结果 :经过酶切鉴定成功地构建了分别携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体 ,对肿瘤的前药转换基因治疗有重要意义。     

一种快速筛选基因转染阳性细胞的标志基因-GFP

目的：寻求基因转移中快速检测转染阳性细胞的方法。方法：采用逆转录病毒介导的基因方法，将Ｉ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ＴＫ）基因、绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因及抗新霉素（ＮｅｏＲ）基因插入人外周血单个核细胞（ＰＢＭＮＣ），利用ＧＦＰ在细胞内的表达所产生的绿色荧光，经流式细胞仪测定基因转移效率。结果：被转染结胞以Ｔ淋巴细胞为主，占１１．３９％，而且被转化的Ｔ细胞中ＣＤ４阳性细胞转化率较高，占７．６１％，ＣＤ８，ＣＤ１９和ＣＤ３３阳性细胞转化率分别为２．９％，２．１％和４．７２％，ＰＣＲ鉴定表明转染的人外周血单个核细胞中含量有ＮｅｏＲ基因。结论：在基因转移中ＧＦＰ可作为一种标记基因，快速检测转染阳性细胞。     

抗病毒基因治疗

基因治疗是将治疗性基因导人到发生病变的细胞内，以替补突变基因的功能，或封闭异常基因表达的治疗方法。抗病毒基因治疗可以概括为两个方面：细胞内免疫和基因免疫技术。