应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的探讨表达载体介导小干扰RNA（siRNA）对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3（STAT3）表达的抑制作用。方法设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列，将其连入pRNAT—U6．1／Neo质粒中，构建STAT3siRNA表达载体。表达载体进行PCR及测序鉴定，并分别转染SW1990细胞，实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变。结果PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功，分别转染SW1990细胞后，STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降（P〈0．05），其中，第二种STAT3 siRNA作用明显，可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63％和60％。结论本研究构建的STAT3．siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达，为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础．     

STAT3靶向短发夹RNA干扰重组载体对结肠癌SW480细胞的沉默作用

目的 探讨STAT3基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对结肠癌SW480细胞STAT3基因的干扰作用.方法 根据siRNA设计原则,构建靶向STAT3基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/STAT3),使用脂质体法转染人结肠癌细胞系(SW480),通过RT-PCR和 Western 印迹检测结肠癌SW480细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平.结果 pGPU6/GFP/STAT3重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确.质粒成功转染SW480细胞后,该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05).结论 成功构建靶向STAT3基因的shRNA表达载体,转染SW480细胞,能有效抑制细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达,为STAT3基因靶向治疗提供前期的实验依据.     

pEGFP-C1-HSP27真核表达载体的构建及其稳定转染人胰腺癌SW1990细胞株的筛选

目的 构建表达热休克蛋白27( HSP27)的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核载体,建立稳定表达HSP72的人胰腺癌SW1990细胞株.方法 采用RT-PCR法从SW1990细胞中扩增出带有BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点的HSP27基因片段,插入真核表达载体pEGFP-C1,鉴定正确后用重组质粒转染SW1990细胞,并筛选稳转细胞株.荧光显微镜观察HSP72的定位,RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染细胞HSP27的表达.结果 双酶切法鉴定和测序证实重组载体pEGFP-C1 -HSP27的DNA序列完全正确,并成功转染SW1990细胞,筛选获得稳转细胞株.荧光显微镜见EGFP主要分布在胞质中,转染细胞的HSP27mRNA表达明显增加(1.458±0.160比0.897 ±0.051,P＜0.05),且表达HSP27与EGFP的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pEGFP-C1-HSP27,并筛选获得稳转的细胞株.     

STAT3调控胰腺癌侵袭转移相关基因的筛选

目的 应用基因芯片筛选信号转导与转录激活因子3(STAT3)调控胰腺癌侵袭转移的相关基因.方法 以慢病毒感染获得稳定STAT3沉默人胰腺癌细胞株SW1990,以空质粒病毒组、未感染组为对照.应用基因芯片筛选3组细胞与肿瘤侵袭转移相关的差异表达基因.用实时PCR及蛋白质印迹法检测STAT3 mRNA及蛋白表达,并验证所选取的3个差异表达基因(MMP-7、IL-1β、IgTα7).结果 靶向STAT3的病毒感染SW1990细胞后,STAT3 mRNA表达水平为0.391±0.037,显著低于空质粒病毒组的1.002±0.015和未感染组的1.206 ±0.042(P ＜0.05);STAT3蛋白表达水平为182.38±65.32,亦明显低于空质粒病毒组的223.40±58.40和未感染组的212.33±53.69(P＜0.05).STAT3沉默的SW1990细胞有8个肿瘤侵袭转移相关基因表达上调,3个表达下调,经验证,沉默组细胞MMP-7、IL-1β mRNA表达水平明显低于空质粒病毒组(0.287±0.115比1.010±0.124,t =19.45,P=0.000;0.490±0.010比1.002±0.002,t=13.83,P=0.000),而IgTα7 mRNA表达水平无明显变化(1.173±0.280比0.998±0.003,t=4.236,P=0.094).同时沉默组细胞MMP-7蛋白表达亦显著降低.结论 STAT3沉默可导致人胰腺癌SW1990细胞多个与肿瘤侵袭转移相关基因表达的改变,其中MMP-7可能是受STAT3调控的主要靶基因.     

SMO基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对胰腺癌细胞SMO基因表达的影响

目的:Hegdehog信号通路在胰腺癌发生发展过程中发挥着重要的作用,针对其调控机制的研究将对胰腺癌发病机制的阐明奠定良好的理论基础.构建携带SMO靶向si RNA慢病毒表达载体,并证实其对胰腺癌细胞中SMO基因表达的抑制作用.方法:设计并合成3条SMO基因靶向si RNA片段,利用基因重组技术构建携带此3条片段的慢病毒表达载体并测定其滴度,构建好的慢病毒表达载体转染人胰腺癌细胞株SW1990后,采用RT-PCR法检测SMO基因的表达以筛选出效果最佳的干扰表达载体,并以此载体转染SW1990细胞后采用Western blot法检测SMO蛋白表达.结果:基因测序与酶切电泳结果提示成功合成SMO靶向siRNA片段且其正确插入慢病毒表达载体,无碱基缺失错排与突变,测定病毒滴度分别为5.31×10~8TU/m L,1.49×10~9TU/m L及8.50×10~8TU/m L,经转染SW1990细胞后,测定对SMO基因表达的抑制率分别为86.00%、74.85%及19.22%,效果最优的干扰表达载体转染SW1990细胞后对SMO蛋白表达的抑制率80%.结论:成功构建携带SMO基因靶向si RNA的慢病毒表达载体,且该载体可有效抑制胰腺癌细胞中SMO基因的表达,为进一步的研究提供了良好的实验工具.     

靶向胰腺癌PANC-1细胞整合素连接激酶基因RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的:构建整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组质粒并检测其对胰腺癌PANC-1细胞ILK基因表达的干扰效率,为进一步研究胰腺癌中ILK基因功能奠定实验基础和理论依据.方法:设计并构建3条含有针对ILK基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列的重组质粒并进行DNA测序.通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒转入人胰腺癌细胞株Panc-1细胞中,G418压力筛选至得到稳定转染细胞克隆,利用Real-Time PCR和Western blot检测ILK基因的表达抑制情况.筛选出干扰效率最高的重组质粒.结果:经DNA测序证实胰腺癌PANC-1细胞ILK基因的R NA干扰重组质粒构建成功;重组质粒稳定转染Panc-1细胞后(各组转染效率均>90%),各实验组ILK基因表达均被有效地抑制,其中重组质粒-2的干扰效率最高,其mRNA及ILK表达显著下调,其抑制率分别为93.01%和65.69%;ILK mRNA表达较阴性对照组、空质粒组表达量显著下降(0.090±0.009vs 1.147±0.110,1.005±0.121,P<0.01).结论:成功构建ILK基因RNA干扰重组质粒,重组质粒能有效抑制胰腺癌Panc-1细胞ILK基因表达.为进一步研究ILK在胰腺癌中的基因功能奠定基础.     

TMPRSS4基因沉默对胰腺癌SW1990细胞生长及侵袭的影响

目的 观察TMPRSS4基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞体外生长增殖和侵袭的影响.方法 体外合成4个靶向TMPRSS4基因和阴性对照的真核表达载体,瞬时转染到SW1990细胞,实时定量PCR法检测转染细胞的TMPRSS4 mRNA表达.以干扰效率最高的真核表达载体转染SW1990细胞,G418筛选出稳定的TMPRSS4基因沉默的细胞株,蛋白质印迹法检测稳定细胞株TMPRSS4蛋白抑制效率,CCK-8法检测细胞生长抑制率,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 成功构建了稳定下调TMPRSS4表达的细胞株SW1990/psi-TMPRSS4,细胞转染效率为82.9%.与亲本SW1990细胞比较,TMPRSS4 mRNA和蛋白水平分别下调了80.1%、60%.SW1990/psi-TMPRSS4组穿膜细胞数为(118.6±13.4)个,显著低于阴性对照组的(157.4±12.9)个和亲本细胞组的(157.0±9.5)个(P值均<0.01).SW1990/psi-TMPRSS4组细胞的侵袭抑制率为24.5%.但各组细胞增殖无明显变化.结论 成功筛选出稳定下调TMPRSS4表达的细胞株.下调TMPRSS4表达能有效抑制胰腺癌SW1990细胞的侵袭能力,但对细胞增殖无影响.     

RNAi沉默STAT3基因表达对Lewis肺癌细胞生长影响的实验研究

目的 探讨RNA干扰技术沉默转录信号传导子与激活子家簇3（STAT3）对Lewis肺癌细胞凋亡、细胞生长抑制的影响。方法 应用真核细胞转染技术将Psilencer2.1-U6一siRNA—STAT3重组质粒转入小鼠Lewis肺癌细胞，同时分别设立转染空质粒阴性对照组和转染试剂阴性对照。于72h后收集细胞，分别提取细胞总蛋白及总RNA，分别用Western blot和RT—PCR测定STAT3基因在蛋白水平及mRNA水平的表达，用MMT法测定细胞的生长抑制状态，通过流式细胞仪检测Lewis肺癌细胞凋亡情况。结果 重组质粒明显抑制STAT3蛋白的表达、降低STAT3 mRNA水平并诱导Lewis肺癌细胞凋亡、使肿瘤细胞生长明显受抑。结论 Psilencer2.1-U6-siRNA—star3 Lewis转染肺癌细胞后，可有效抑制STAT3蛋白表达和STAT3 mRNA的表达，诱导Lewis肺癌细胞凋亡和肿瘤细胞生长抑制。     

丝裂原活化蛋白激酶特异性小干扰RNA表达载体对结肠癌细胞周期和DNA甲基化的影响

目的 构建丝裂原活化蛋白激酶（MEK）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体，观察其静默效应及对结肠癌细胞SW1116生长周期和DNA甲基化的影响。方法 选择MEK不同靶点寡核苷酸片段，克隆到pGCsilencer真核表达载体中。脂质体转染SW1116细胞，荧光显微镜评估转染效率，G418筛选稳定表达siRNA的细胞。Western印迹法检测siRNA对MEK蛋白表达的静默效果。应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测细胞生长活力，流式细胞术分析细胞周期，甲基化特异性PCR和DNA测序检测p16^INK4A基因启动子甲基化状态。结果 构建2个靶点的MEK重组质粒，分别转染和联合转染SW1116细胞，转染效率约为72．1％，G418筛选培养2周得到稳定表达MEK siRNA的细胞，MEK蛋白抑制率分别为74．2％和69．1％和90．2％，下游分子ERK蛋白磷酸化水平随之降低；细胞增殖活力下降2～4倍和细胞周期阻滞于G1期，细胞周期负调控冈子p16^INK4A启动子区呈低甲基化状态。结论 MEK特异性siRNA表达载体对结肠癌细胞MEK蛋白表达有一定的静默效果，多靶点联合效果更好，阻滞细胞周期于G1期，促进p16^INK4A基因去甲基化。     

靶向5-LOX的siRNA诱导胰腺癌细胞的凋亡

目的:采用RNA干扰技术(siRNA)阻断5-LOX基因的表达,观察其抑制人胰腺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用.方法:构建靶向5-LOx的siRNA质粒表达载体,采用Lipofectamine-2000转染人胰腺癌细胞株SW1990,采用RT-PCR检测RNA干扰后5-LOX mRNA表达,MTT法检测细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:靶向5-LOX序列特异性的三条siRNA(组1、组2、组3)可以有效地抑制SW1990细胞5-LOX基因表达,其表达抑制率分别为19.6%±1.9%、55.4%±2.6%和55.2%±2.7%.转染靶向5-LOX siRNA的三个质粒表达载体可以显著抑制SW1990细胞的增殖, 细胞接种24 h后,三组增殖抑制率分别为5.37%±1.19%、11.63%±1.25%和13.67%±1.04%:48 h后其增殖抑制率分别为16.13%±1.5%、26.63%±1.22%和25.47%±1.67%, 各siRNA组增殖抑制率高于空白组和阴性对照组(均P<0.05),转染后24 h和48 h三组细胞凋亡率分别为5.56%±1.05%、11.45%±1.44%、12.13%±1.36%和7.37%±1.23%、18.75%±1.5%和22.02%±1.45%,均高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05).结论:所构建的靶向5-LOX的siRNA质粒表达载体可以有效阻断SW1990细胞5-LOX基因表达,显著地抑制SW1990细胞增殖,并在一定程度上诱导其凋亡.     

Intracellular expression of CD61 precedes surface expression

 We report a case of acute myeloid leukemia which we have classified as acute megakaryoblastic leukemia because of intracytoplasmic expression of CD61. Light microscopy demonstrated agranular blasts which, by cytochemical staining, were negative for myeloperoxidase. Using flow cytometry, the blast cells were seen to be positive for HLA-DR, CD7, CD13, CD33, and CD34, thus revealing their myeloid origin. Immunophenotyping on fixed blood smears additionally showed positive reaction with the CD61 antibody, demonstrating the megakaryoblastic differentiation of the blasts. After permeabilization of the cell membrane, the intracytoplasmic CD61 expression was confirmed by flow cytometry. Cytogenetic analysis disclosed a del(7)(q21–22). Our findings suggest that cytoplasmic expression of CD61 may precede the cell-surface expression of this antigen and should therefore be investigated in all cases of acute leukemias with undifferentiated morphology and negative cytochemistry to set apart early FAB-M7 from FAB-M0. Received: February 8, 1999 / Accepted: May 5, 1999     

新布尼亚病毒真核表达载体的构建及表达

目的 探究SFTSV-NSs基因的结构和功能以及病毒在感染细胞过程中与宿主的相互作用,通过构建SFTSV-NSs真核表达载体SFTSV-NSs-FLAG,并将其转染进293细胞内,为进一步研究SFTSV-NSs基因的结构和功能奠定基础。方法 利用RT-PCR 扩增SFTSV-NSs基因序列并测序,并将纯化得到的SFTSV-NSs cDNA 片段连接到pFLAG-CMV-3载体,通过EcoRI/BamHI双酶切鉴定重组质粒。将重组表达体pSFTSV-NSs-FLAG导入293细胞中,共聚焦显微镜下观察SFTSV-NSs在细胞中的定位、 Western Blot 检测SFTSV-NSs 蛋白在293细胞中的表达情况。结果 成功克隆测序SFTSV-NSs基因;成功构建SFTSV-NSs真核表达载体pSFTSV-NSs-FLAG,并将其转染到293细胞中。在293细胞中的表达检测结果显示共聚焦显微镜下观察重组体主要集中在细胞质中,并形成类包涵体样结构;且Western Blot 检测结果显示SFTSV-NSs 蛋白在293细胞中表达。结论 为进一步研究SFTSV-NSs基因的结构和功能以及病毒在感染细胞过程中与宿主的相互作用提供新思路。     

成纤维细胞激活蛋白载体的构建及表达

目的建立成纤维细胞激活蛋白(FAP)表达系统,以获得完整蛋白。方法采用RT-PCR方法,自人新鲜胃癌组织中扩增FAP-cDNA,同时将FAP-cDNA克隆到pMD18-T中,表达正确后,再定向插入真核表达载体pQE30中,转化大肠埃希菌JM109,经异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果测定FAP-cDNA序列与GeneBank(基因库)中的FAP序列相同;构建出重组表达载体pQE30-FAP;转化大肠埃希菌JM109,并获得完整蛋白,经验证为诱导后的表达蛋白。结论成功构建pQE30-FAP表达载体,Western-Blotting验证为完整蛋白,为进一步获得抗FAP抗体奠定了基础。     

人硫氧还蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人硫氧还蛋白基因的重组真核表达载体。方法人硫氧还蛋白的cDNA克隆至pGEM-TEasy载体,经DNA测序证明后,将其克隆至真核表达载体pShttle构建重组pShttle-hTRX,pShttle-hTRX转染Hela细胞系进行瞬时表达,通过Westernblot、免疫组化、活性测定、酶切、PCR扩增等方法证实构建载体的正确性。结果构建携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体pShttle-hTRX,转染HeLa细胞后可检测到hTRX的转录和表达。结论正确构建了携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体,本结果可用于探讨硫氧还蛋白的生物学作用。     

Construction and expression of recombined human AFP eukaryotic expression vector

AIM: To construct a recombined human AFP eukaryotic expression vector for the purpose of gene therapy and target therapy of hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: The full length AFP-cDNA of prokaryotic vector was digested, and subcloned to the multi-clony sites of the eukaryotic vector. The constructed vector was confirmed by enzymes digestion and electrophoresis, and the product expressed was detected by electrochemiluminescence and immunofluorescence methods. RESULTS: The full length AFP-cDNA successfully cloned to the eukaryotic vector through electrophoresis, 0.9723 IU/ml AFP antigen was detected in the supernatant of AFP-CHO by electrochemiluminescence method. Compared with the control groups, the differences were significant (P<0.05). AFP antigen molecule was observed in the plasma of AFP-CHO by immunofluorescence staining. CONCLUSION: The recombined human AFP eukaryotic expression vector can express in CHO cell line. It provides experimental data for gene therapy and target therapy of hepatocellular carcinoma.     

人白细胞介素10真核表达载体的构建及表达

目的 建立人白细胞介素10(hIL-10)真核表达系统并观察其在HeLa细胞中的表达。方法 用RT-PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10 cDNA，将其克隆至pMDl8-T中，测序正确后，再定向插入真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染HeLa细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌。结果 RT-PCR扩增的hIL-10 cDNA序列与GenBank中hIL-10 cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneo-hIL-10；转染HeLa细胞后可检测到hIL-10的转录和表达。结论 成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物的生产奠定基础。     

小鼠白介素-10真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-10(murineinterleukin-10,mIL-10)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠脾脏IL-10基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,酶切和测序鉴定重组质粒的大小、序列。采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-10瞬时转染293T细胞,用Westernblot法检测IL-10表达。结果重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,而且转染了293T细胞中提取的蛋白可检测到活性蛋白。结论经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,并在293T细胞中成功表达活性蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。